制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较 佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。送些扩增产物都应含有SEQ ID NO. 1中第306 位。
[0046] 由于本发明的SNP与强直性脊柱炎具有非常高的关联性，因而可用于早期辅助性 诊断强直性脊柱炎，而且可W未雨調缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措 施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此，具有极其重大的应用价值和社会效益。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New "'iorkiColdSpring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[004引 实施例1 [004引一、研究对象
[0050] 病例样本全部采集自口诊病人，患者的诊断由仁济医院富有临床经验的风湿病科 医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本选自南方中必 样本库中病例组年龄、性别匹配、无关节炎病史的个体。
[0051] 在知情同意的基础上，随机收集了 189例AS病人和177例健康的正常对照个体的 外周血样本。
[0052] 二、实验方法和结果
[0053] 1、DNA 提取
[0054] 用常规酪氯仿法从人的外周血样本中提取DNA(也可采用商业化的试剂盒提取 DNA)，浓度校正至20ng/ μ 1后，用于常规PCR扩增。
[005引 2、用于PCR和测序中的引物设计
[0056] 根据GenBank中PSMB7的基因组序列，设计和合成W下引物：
[0057] 有义引物 P1 ;5' -accgcagaaccaaattaacg-3'(沈Q ID NO. 2 所不）
[0058] 反义引物 P2 ;5' -aatgaatcctcccaccatca-3'(沈Q ID NO. 3 所示）。
[0059] 3、PSMB7 基因的 PCR 扩增
[0060] W提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR仪上W Touchdown程序进行 PCR扩增。反应条件为；94°C预变性2分钟，94°C变性30砂，63°C退火40砂，72°C延伸40 砂，共10个循环，每个循环退火温度递减0. 5°C; W后94°C变性30砂，58°C退火40砂，72°C 延伸40砂，共30个循环；最后72°C延伸7分钟。
[0061] PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得PSMB7基因的扩增产物。
[006引 4、SNP的发现和检测
[0063] PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730 DNA测序仪（美国应用生物系统公司 applie化iosystems(ABI))进行测序，用化ly地red软件（美国华盛顿大学ht化：//化oog. mbt. Washington. edu/Polyp虹ed. html)进行序列的判读、基因分型和SNP确认。
[0064] 结果，发现存在数个SNP，其中，包括W下SNP :
[0065] 沈Q ID NO. 1 中第 306 位 C 一 G(rs2236386)。
[0066] 其中，rs2236386 :
[0067] ggctgtgcctggg曰cttgggtctgtctgtctctg曰曰gc曰ccgc曰g曰曰CC曰曰曰tt曰曰cggt曰g曰曰曰C曰曰g tccagtctgagcggcaggagacctggtcgctggtgcgttcaccttggacaagtcctttcccggttccgggtgtcact ttctcctccgtgccacttggggcgatatacttcaaacatctctggcctctctaggaaccagaatctctaagatcaat cgttctagtgcggcgtttgccccgccccttcagcccccgttgccagcgacgccggaagtgctcggctctttttgttt gcaccCgcctccgacccggaactgctttcttgggaagatggcggctgtgtcggtgtatgctccaccagttggaggct tctcttttgataactgccgcaggtgccgccttgcttggggcttggttcagggagggagaagagtgcggtgctcgggt gggagctgggccaaggtgtgatacgagaattctgagggaagaattcatggcggggcctgtggcccgcggctagtgtg actcaggggaatcagggcctgggcgtgggtttctcctgaagccgggtctgctctcccaccttcccagcgcactcggc caccgtttatctccgtctcctaaggcacgtcacggcccctttgtaagactgtcttcgttggaaaacgggagaacagt gctgatggtgggaggattcattaaa(SEQ ID NO.l 所示）。其中，序列中的"G"即为 SNP 位点。 [006引 5、SNP基因分型和关联分析
[0069] 用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在强直性脊柱炎病人和正常对照组中进 行分型和关联分析。
[0070] 对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在病人 和对照之间是否具有差异，其分析结果如下：
[0071] 根据病例-对照关联分析的研究方法对基因分型的结果进行了卡方计算，结果 发现，多态性位点rs2236386的基因型GG具有显著的统计学差异。其中，在病例样本中， rs2236386的分布为（基因型GG 24例、基因型GC 81例、基因型CC 84例）；而在对照样本 中为（基因型GG 12例、基因型GC 95例、基因型CC 80例），两者具有显著性差异。
[0072] 基因型GG在病例中比在对照中要多，卡方检验P = 0.039。基因型GG的个 体罹患强直性脊柱炎的风险要比其它两种基因型（CC+GC)的个体高2. 12倍（95% CI:1. 03-4. 38)。
[0073] W上结果表明；C 一 G改变，增加了强直性脊柱炎的易感性，PSMB7基因多态性位点 rs2236386的基因型GG与强直性脊柱炎的发病显著相关。即；SEQ ID NO. 1中第306位的 SNP位点与强直性脊柱炎的发生存在着相关性。
[0074] 实施例2强直性脊柱炎易感性检测试剂盒
[007引如实施例1所述，SEQ ID NO. 1中第306位C 一 G的突变与强直性脊柱炎疾病密 切相关。因此，可基于送个突变设计PSMB7基因特异性引物，再W病人的DNA为模板进行扩 增进行检测。
[0076] 制备一试剂盒（100人次），其含有：
[0077] 1)有义引物 P1 (SEQ ID NO. 2 所示），浓度 lOOpmol ;
[007引。反义引物P2(SEQ ID NO. 3所示），浓度lOOpmol ; W及
[0079] 3)含Taq酶、dNTP、镇离子、PCR反应缓冲液的PCR反应液。
[0080] 随机挑选100个人构成的测试组，其中，包括；未知是否患强直性脊柱炎的对象、 已知患强直性脊柱炎病人和经检测无强直性脊柱炎的正常人。
[0081] 抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法（或使用特定的商业化试 剂盒）从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到10 μ mol/1，W 所提取的DM为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI 3730 DM测 序仪进行测序，用化ly地red软件进行序列的判读和SNP确认。
[0082] 或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪值册LC)进行色谱分析，也 可检测出沈Q ID NO. 1中第306位的C 一 G。
[0083] 检测结果；对于PSMB7基因存在第306位的C 一 G的对象，进一步通过常规方法检 测W确认是否患有强直性脊柱炎情况。检测结果表明，含第306位的C 一 G的检测对象的 强直性脊柱炎易感性比例明显高于不含G正常人群（高出至少200% )。
[0084] 因此，送表明通过检测PSMB7基因的第306位的C 一 G，可进行强直性脊柱炎的辅 助性检测。
[0085] 实施例3强直性脊柱炎易感性辅助性检测
[0086] 重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了 70个人（检测前不知道是否有强直 性脊柱炎症状）进行检测。
[0087] 制备一试剂盒（100人次），其含有：
[008引 1)有义引物 P1 (SEQ ID NO. 2 所示），浓度 lOOpmol ;
[0089] 2)反义引物 P2 (SEQ ID NO. 3 所示），浓度 lOOpmol 及
[0090] 3)含Taq酶、dNTP、镇离子、PCR反应缓冲液的PCR反应液。
[0091] 抽取待检测对象的外周血3ml，使用常规方法（或使用特定的商业化试剂盒）从 血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到10 μ mol/1，W所提取的 DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI 3730 DNA测序仪进行 测序，用化ly地red软件进行序列的判读和SNP确认。
[0092] 结果同样证实了，含第306位的C 一 G的检测对象的强直性脊柱炎比例明显高于 该位点为GG的检测对象（高至少200% )。
【主权项】
1. 一种用于强直性脊柱炎易感性检测的试剂盒，其特征在于，包括：特异性扩增PSMB7 基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100_2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第306 位的扩增产物。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有选自下组的试剂： 1) 与SEQ ID NO. 1中第306位的突变结合的探针； 2) 识别SEQ ID NO. 1中第306位的突变限制性内切酶。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述突变选自以下的单核苷酸多态性： 第306位C - G ;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO. 1。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的序列如SEQ ID NO. 2和3所 /_J、1 ο5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增产物的长度为100_2000bp且含 有 SEQ ID NO. 1 中第 306 位。6. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTPs、镁离 子、PCR反应缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种强直性脊柱炎易感性检测的方法及其试剂盒，其中，强直性脊柱炎易感性检测的方法包括：检测该个体的PSMB7基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PSMB7基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群；该试剂盒包括：特异性扩增PSMB7基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ？ID？NO.1中第306位的扩增产物。本发明可用于早期辅助性诊断强直性脊柱炎，而且可使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，具有极其重大的应用价值和社会效益。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506064
【申请号】CN201410499122
【发明人】黄薇, 牛振民
【申请人】上海产业技术研究院, 上海人类基因组研究中心
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月25日