一种用于治疗黑色素瘤的新的二萜化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从白背叶的干燥叶中分离得到的一种二萜类 化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 白背叶为大戟科Euphorbiaceae野桐属植物白背叶Mai lotus apelta(Lour ·) Muell .Arg. [Ricinus apelta Lour.]的根或叶，又名酒药子树、白膜叶等。味微苦、湿，性 平。我国主要分布于江苏、安徽、江西、福建、河南、广西、海南、陕西、云南等地。白背叶在民 间应用广泛，主要以根及叶入药，根具有柔肝活血，健脾化湿，收敛固脱之功效，常用于慢性 肝炎，肝脾肿大，子宫脱垂，脱肛，白带，妊娠水肿；叶能消炎止血，主要是外用，常用于中耳 炎，疖肿，跌打损伤，外伤出血。
[0003] 该属植物含有丰富的化合物类型，主要以苯并吡喃类、香豆素类、三萜类以及萜类 化合物为主。苯并吡喃衍生物主要存在于白背叶的叶子中；香豆素类化合物主要存在于叶 子中，根和茎亦有分布;三萜类化合物在白背叶的根、茎、叶中均有分布。萜类化合物以二萜 类为主，存在于叶子中。此外，白背叶还含有生物碱类、黄酮类以及挥发性成分。
[0004] 研究表明白背叶叶子部分有良好的止血、抗肿瘤作用，根部分具有较好的抗病毒 和保肝活性，特别是某些化学成分具有强烈的抑制HIV、逆转录酶或细胞DNA聚合酶的活性， 提示其具有应用于治疗乙肝和艾滋病的潜力。此外，有研究表明，白背叶根水煎剂对金黄色 葡萄球菌有抑制作用，乙醇提取物能够抑制志贺痢疾杆菌;从根中分离出的化合物均能在 不同程度上抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌。白背叶煎剂和浸剂能使 钉螺的死亡率达到30%~60%。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从白背叶的干燥叶中分离得到的一种二萜类化合物，含 其的药物组合物及其制备方法和应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I):
[0008]
[0009] 所还的化甘物（υ的制爸万'/云，包谷以卜探作步骤：u)将白背叶的干燥叶粉碎，用 70~80 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和 的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙 酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇洗脱8个柱体 积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物 用正相硅胶分离，依次用体积比为90 :1、60:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱 得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗 脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)计算E⑶和实验E⑶图；
[0020]图3为BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0023]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0025] (a)白背叶的干燥叶（10kg)粉碎，用75 %乙醇热回流提取（30L X 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次）和水饱和的正丁醇 (6LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇 洗脱8个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物（125g);(c)步骤(b)中 70 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1 (8个柱体积）、60 :1 (8个柱体 积）、35:1 (8个柱体积）、15:1 (10个柱体积)和1:1 (6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱 体积）、15:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步 骤(d)中组分2(15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇 水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)(31mg)。 [0026] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 575.2502，结合核磁特征可得分子式为 C28H4〇Oii，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (4 · 68，br，s)，H-2 (1.52，m)，H-2(1.91，m)，H-3(1.02，m)，H-3(1.76，td，J=14.5,3.9)，H-6(5.33，br，s)，H-7 (5.04，m)，H-8(1.83，m)，H-9(1.15，td，J=13.2,4.6)，H-ll(1.26，t，J=12.5)，H-ll(1.49， m)，H-15(5.95，d，J = 2.3)，H-16(6.21，d，J = 2.3)，H-17(1.34，s)，H-18(1.01，s)，H-19 (1.04，s)，H-20(1.07，s)，l-0Ac(2.03，s)，6-0Ac(1.93，s)，7-0Ac(1.96，s)，H-r(3.47，m)， !1-1'（3.78，111)，!1-2'（1.12，111) ;核磁共振碳谱数据3。(？?111，0130-(16，1251抱）：75.0(〇1，1-〇， 22.6(CH2,2-C)，32.2(CH2,3-C)，38.1(C，4-C)，79.6(C，5-C)，75.3(CH，6-C)，74.1(CH，7-C)， 52.6(CH，8-C)，38.3(CH，9-C)，42.5(C，10-C)，34.0(CH 2，11-C)，175.8(C，12-C)，57.4(C， 13-C)，87.7(C，14-C)，80.4(CH，15-C)，106.1(CH，16-C)，23.1(CH3，17-C)，29.5(CH 3，18-C)， 23.8(CH3，19-C)，16.1(CH3,20-C)，169.1(C，1-0Ac)，20.7(CH3，1-0Ac)，170.9(C，6-0Ac)， 21.5(CH3,6-0Ac)，169.0(C，7-0Ac)，20.8(CH3,7-0Ac)，62.4(CH2，r-C)，15.4(CH 3,2'-C); 碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有羟基（3470CHT1)和羰基（1757，1725〇1^) 基团。hNMR 谱显示出四个含氧次甲基信号5財.68(1^，8，!1-1)，5.33(1^，8，!1-6)，5.04(111，!1-7)，5.95((1，了 = 2.3!^，!1-15)和6.21((1，了 = 2.3抱，!1-16);两个次甲基3!11.83(111，!1-8)和1.15 (七(1，了 = 13.2,4.6他，!1-9);三个乙酰氧甲基；五个甲基6!11.34(!1-17)丄01(!1-18)丄04(!1-19)，1.07(H-20)，1.12(H-2'）^CNMR谱显示有28个信号，含有八个甲基，四个亚甲基(一个 含氧），七个次甲基(五个含氧碳)和九个季碳（四个羰基碳，两个含氧季碳）。上述数据表明， 该化合物为含有三个乙酰氧基取代的三环二萜类化合物。H-1 (δΗ4.68，br，s)，H-6(δΗ5.33， 1^，8)和!1-70!15.〇4，111)与其相应的乙酰氧基0(：169.1，17〇.9，169.〇)的相关性，表明(：-1(3 〇75.〇)，〇60〇75.3)和(：-70〇74.1)位分别连有一个乙酰氧基。圓8(：谱中]^-17与(：-8，(：-13 和C-14的相关性表明C-17位为甲基。HMBC谱中，H-15和C-14的相关性表明该化合物含有氧 杂环丁烷部分。在ROESY谱中，H-1与Me-20，Me-20与H-8，H-8与H-6以及H-6与Me-19的相关性 表明!1-1，!1-6，!1-8，]\^-19和]^-2〇为0型构型，而!1-9与!1-7的交叉峰显示这些质子的€[构型。 综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物 如图1所示，立体构型进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0027]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0028] -、材料和仪器
[0029] 人A375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物（I)自制，制备方法见实施例1， HPLC归一化纯度大于98%<^ΜΕΜ培养基、0.25%胰酶购自美国Gibco公司。MTT(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝）、DMS0(二甲基亚砜）、BrdU购自美国 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠二抗购自美国Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
[0030] 恒温C02培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台（中国 苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置荧光显微镜(Olympus公司）。电热恒温培养箱（中国 上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪(美国Beckman公司）。 J6-HC高速离心机(美国Beckman公司）。低温微量离心机(德国Eppendorf公司）。振荡摇床 (美国Forma公司）。
[0031]二、试验方法 [