核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤； 检测酶反应的检测步骤;和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的分析步 骤。
[0092] 在实施方案1A中，将复合物级分和非复合物级分分离。因此，在核酸酶处理步骤 中，将核酸单体从复合物中的结合核酸分子释放，并且在酶处理步骤中，引起了以释放的核 酸单体作为底物的酶反应。因此，在检测步骤中检测酶反应的结果相当于检测复合物的结 果，并且因此间接表明了检测复合物中含有的靶标的结果。
[0093] 在实施方案1A中，作为结合核酸分子，优选使用已经向其添加了多核苷酸(在下文 中也被称为"添加多核苷酸"）的结合核酸分子。例如，通过使用已经向其添加了多核苷酸的 结合核酸分子，可以增加从复合物中的结合核酸分子释放的核酸单体的数量。因为释放的 核酸单体充当酶处理步骤中的底物，在释放的核酸单体的数量增加时可以进一步提高检测 灵敏度。
[0094] 对添加至结合核酸分子的多核苷酸没有特别地限定。添加多核苷酸的长度的下限 是，例如，0个碱基、10个碱基、或20个碱基，并且其上限是，例如，1000个碱基、200个碱基、或 20个碱基。
[0095] 对构成添加多核苷酸的核酸单体的类型没有特别地限定，并且例如，其可以根据 将要在酶处理步骤中使用的酶的底物特异性适当地确定。例如，在添加多核苷酸中，核酸单 体经由磷酸二酯键彼此连接。例如，核酸单体是核苷酸残基。核苷酸残基中的糖残基可以 是，例如核糖残基或脱氧核糖残基。当糖残基是核糖残基时，核苷酸残基是核糖核苷酸残 基。当糖残基是脱氧核糖残基时，核苷酸残基是脱氧核糖核苷酸残基。对核苷酸残基中的碱 基没有特别地限定，并且其实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。对核苷酸 残基中的磷酸基团没有特别地限定，并且其可以是，例如单磷酸、二磷酸、或三磷酸。核酸单 体的具体实例包括AMP和脱氧-AMP(dAMP)。例如，添加多核苷酸可以由一种类型或两种以上 类型的核苷酸残基构成。具体地，优选的是，添加多核苷酸由AMP和脱氧-AMP (dAMP)中的至 少一种构成。更优选的是，添加多核苷酸由选自AMP和脱氧-AMP (dAMP)的一种类型的核苷酸 残基构成。
[0096]例如，可以将添加多核苷酸添加至结合核酸分子的3'端或5'端。例如，可以根据核 酸酶的性质适当地确定在结合核酸分子中添加添加多核苷酸的位置。在核酸酶将核酸单体 从5 '端向3 '端释放的情况下，例如，优选将添加多核苷酸添加至结合核酸分子的5 '端。在核 酸酶将核酸单体从3'端向5'端释放的情况下，例如，优选将添加多核苷酸添加至结合核酸 分子的3'端。
[0097]就实施方案1A而言，将参照图1描述在其中使用各自具有向其添加的添加多核苷 酸的结合核酸分子的实例。图1是显示本发明的实施方案1A的概要的示意图，并且(A)至(D) 示出了相应步骤。要指出的是，图1是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、添加多 核苷酸等的尺寸不限于图1中所示的那些。
[0098] 首先，在复合物形成步骤中，如在图1中的(A)中所示，使含有靶标11的样品与各自 具有添加多核苷酸13的结合核酸分子12接触。作为结果，如在图1中的(B)中所示，在复合物 形成步骤中的反应溶液中，由在样品中的靶标11和各自具有添加多核苷酸13的结合核酸分 子12形成复合物。此时，未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子12还存在于反应溶液 中。
[0099] 之后，在分离步骤中，如在图1中的(C)中所示，使反应溶液与固定在载体14上的结 合物质15接触。结合物质15是与靶标11结合的物质。因此，如在图1中的（C)中所示，反应溶 液中含有的复合物经由靶标11和结合物质15之间的结合与载体14结合。此时，未反应的结 合核酸分子12不与载体14结合，并且它们以游离状态存在于反应溶液中。
[0100] 接下来，处理反应溶液从而分离结合有复合物的载体14以及除载体14外的级分。 具体地，例如，将液体级分从载体14移除。之后，通过将核酸酶加入至载体14来进行核酸酶 处理。通过核酸酶处理，如在图1中的(D)中左边所示，将与载体14结合的复合物中的添加多 核苷酸13降解，由此切割核酸单体13'。
[0101] 之后，利用以核酸单体为底物的酶处理从添加多核苷酸13切割的核酸单体13'，并 且检测酶反应。因此，可以分析样品中的靶标。
[0102] 接下来，本发明的实施方案1B涉及一个方面，其中对非复合物级分进行核酸酶处 理。具体地，实施方案1B的分析方法包括:使得与靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触 以形成结合核酸分子与样品中靶标的复合物的复合物形成步骤;将复合物级分和非复合物 级分与用于复合物形成的反应体系分离的分离步骤;通过核酸酶处理将核酸单体从非复合 物级分释放的核酸酶处理步骤;使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应的酶处理 步骤;检测酶反应的检测步骤;和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的 分析步骤。
[0103] 可以以与实施方案1A的分析方法相同的方式进行实施方案1B的分析方法，不同之 处在于:可以或可以不将添加多核苷酸添加至结合核酸分子;并且用酶处理通过用核酸酶 处理非复合物级分释放的核酸单体，并且检测该酶反应。就实施方案1B的分析方法而言，可 以参考以上与实施方案1A相关的描述。
[0104] 在实施方案1B中，非复合物级分含有未参与复合物形成的未反应的结合核酸分 子。因此，通过用核酸酶处理未反应的结合核酸分子并且检测通过该核酸酶处理释放的核 酸单体，可以分析未反应的结合核酸分子。如果可以分析未反应的结合核酸分子，则还可以 根据分析结果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了 复合物的靶标。
[0105] 在实施方案1B中，作为结合核酸分子，优选使用各自具有向其添加的添加多核苷 酸的结合核酸分子。通过添加多核苷酸，例如，可以增加从复合物中的结合核酸分子释放的 核酸单体的数量。因为释放的核酸单体充当酶处理步骤中的底物，在释放的核酸单体的数 量增加时可以进一步提高检测灵敏度。对添加多核苷酸的条件没有特别地限定，并且可以 参考在与实施方案1A相关的描述中给出的其实例。
[0106] 如实施方案1A的情况中一样，还可以参照图1描述实施方案1B。以与在实施方案1A 中相同的方式将复合物级分和非复合物级分分离。如在图1中的(D)中右边所示，之后，通过 用核酸酶处理非复合物级分，将核酸单体13'从未反应的核酸分子12中的添加多核苷酸13 切割。之后，以与在实施方案1A中相同的方式用酶处理这些核酸单体13'，并且检测酶反应。 因此，可以间接分析样品中的靶标。
[0107] 就实施方案1A和1B而言，图1示出了其中结合核酸分子12具有添加多核苷酸13的 实例。然而，实施方案1B不限于这种说明性实例。例如，结合核酸分子12可以是不具有添加 多核苷酸13的核酸分子。
[0108] 接下来，本发明的实施方案1C涉及一个方面，其中使用负载在一个或多个载体上 的结合核酸分子作为结合核酸分子。例如，其他构造与实施方案1A和1B中的那些相同。
[0109] 在实施方案1C中，对负载在载体上的结合核酸分子的数量没有特别地限定。载体 可以负载一个结合核酸分子，或者可以负载两个以上结合核酸分子。优选地，载体负载多个 结合核酸分子，因为可以增加通过核酸酶处理释放的核酸单体的量。
[0110]例如，载体可以仅负载一个或多个结合核酸分子，或者还可以负载一个或多个多 核苷酸，因为可以增加通过核酸酶处理释放的核酸单体的量。对多核苷酸没有特别地限定， 并且其实例包括在实施方案1A中作为多核苷酸的实例给出的那些。
[0111] 对载体没有特别地限定，并且其实例包括上述载体。其中，珠是优选的。
[0112] 就实施方案1C而言，将参照图2描述在其中使用负载在载体上的结合核酸分子的 实例。图2是显示本发明的实施方案1C的概要的示意图，并且(A)至(D)示出了相应步骤。要 指出的是，图2是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、添加多核苷酸等的尺寸不 限于图2中所示的那些。
[0113] 如在图2中的(A)中所示，在实施方案1C中，在复合物形成步骤中，使含有靶标11的 样品与载体20接触。载体20中的每一个负载多个结合核酸分子12和多个多核苷酸13。作为 结果，如在图2中的(B)中所示，在复合物形成步骤中的反应溶液中，样品中的靶标11与负载 在载体20上的结合核酸分子12形成复合物。此时，未参与复合物形成的未反应的结合核酸 分子12还存在于反应溶液中。随后的工艺与在实施方案中1A和1B中的那些相同。
[0114] 如在图2中所示，载体20中的每一个负载多个结合核酸分子12和多个多核苷酸13。 因此，例如，可以通过与在实施方案1A中一样用核酸酶处理复合物级分或者与在实施方案 1B中一样用核酸酶处理非复合物级分将大量的核酸单体释放。因此，具有较高灵敏度的分 析成为可能。
[0115] (2)实施方案2
[0116] 如上所述，本发明的实施方案2涉及一个方面，其中在复合物形成步骤之后不将复 合物级分和非复合物级分分离，并且对复合物形成步骤中的反应体系进行核酸酶处理。
[0117] 也就是说，实施方案2的分析方法包括:使得与靶标结合的结合核酸分子与样品彼 此接触以形成结合核酸分子与样品中靶标的复合物的复合物形成步骤;通过核酸酶处理将 核酸单体从用于复合物形成的反应体系释放的核酸酶处理步骤;使释放的核酸单体与以核 酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤;检测酶反应的检测步骤;和根据检测酶反应的结果 分析已经形成了复合物的靶标的分析步骤。
[0118] 在实施方案2中，针对其中存在复合物和未参与复合物形成的未反应的结合核酸 分子的反应体系进行核酸酶处理。如果结合核酸分子与靶标形成复合物，则复合物中的结 合核酸分子变得不易于因物理阻隔而被核酸酶降解。因此，在反应体系的核酸酶处理中，未 通过核酸酶将核酸单体从与靶标结合的结合核酸分子释放，并且仅从未参与复合物形成的 未反应的结合核酸分子释放核酸单体。因此，在实施方案2中，不必分离复合物级分和非复 合物级分。通过仅从未反应的结合核酸分子释放核酸单体并且检测释放的核酸单体，可以 分析未反应的结合核酸分子。如果可以分析未反应的结合核酸分子，则还可以根据分析结 果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了复合物的靶 标。
[0119] 在本实施方案中，优选使用不具有添加多核苷酸的结合核酸分子。在使用各自具 有添加多核苷酸的结合核酸分子的情况下，对添加多核苷酸