用于分析靶标的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及用于分析靶标的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，已经尝试使用包括与靶标特异性结合的结合核酸分子（所谓的"适体 (aptamer)"）在内的传感器代替与靶标特异性结合的抗体进行靶标检测。作为这样的传感 器，例如，已经报道了被配置为使得具有催化氧化还原反应能力的DNA(在下文中被称为 "DNA酶"）与结合核酸分子连接从而检验靶标与结合核酸分子的结合的传感器(非专利文献 1)。在这种传感器中，在不存在靶标的情况下发生结合核酸分子和DNA酶的自结合，由此抑 制了 DNA酶的催化能力(OFF)。另一方面，在靶标的存在下，自结合通过靶标与适体的接触而 释放，由此活化了DNA酶的催化能力(0N)。因此，如果靶标存在，其催化能力被活化的DNA酶 引起氧化还原反应，从而可以通过测量反应来间接地分析靶标。
[0003] 然而，取决于存在或不存在靶标，上述传感器需要对在传感器中使用的DNA酶的催 化能力的0N-0FF控制。此外，为了进一步提高在使用传感器的分析中的分析灵敏度，例如， 需要使用展现出更强催化能力的DNA酶。
[0004] 使用结合核酸分子（适体）的ELAA(酶联适体测定（Enzyme-1 inked Aptamer Assay))是例如使用以生物素标记的结合核酸分子的方法。在这种方法中，与链霉抗生物素 蛋白融合的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，与生物素标记的核酸分子结合，并且通过 检测酶的底物来分析靶标与结合核酸分子的结合。然而，在ELAA中，结合核酸分子的标记是 必需的，并且为了提高分析灵敏度，例如需要改善各种条件设置。
[0005] 如上所述，在使用上述传感器的情况下，需要使各种改进从而进行更可靠的分析。
[0006] 这些情况下，存在对能够使用结合核酸分子容易地检测靶标并且还能够容易地提 高分析灵敏度的方法的需求。
[0007] 引用清单
[0008] 非专利文献
[0009] [非专利文献 1 ]Carsten Teller等人，Anal · Chem. 2009，81，pp · 9114-9119 [0010] 发明概述
[0011] 本发明要解决的问题
[0012] 考虑到前述内容，本发明的目的是提供可以使用结合核酸分子容易地分析靶标的 新方法以及用于在该方法中使用的分析试剂盒。
[0013]解决问题的手段
[0014]本发明提供用于分析靶标的分析方法，其包括:使得与所述靶标结合的结合核酸 分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物 形成步骤;通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的 核酸酶处理步骤;使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行反应的酶处理步 骤;检测所述酶反应的检测步骤;和根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合 物的所述靶标的分析步骤。
[0015] 本发明还提供用于在根据本发明的分析方法中使用的分析试剂盒，其包括:与靶 标结合的结合核酸分子;核酸酶;和以核酸单体为底物的酶。
[0016] 本发明的效果
[0017] 根据本发明的分析方法，可以通过下列方式容易地检测靶标:形成靶标和结合核 酸分子的复合物，将核酸单体从复合物级分或非复合物级分释放，以及进行与作为底物的 释放的核酸单体的酶反应。根据这种方法，例如，不必如上文所述的那样使DNA酶与适体连 接，从而取决于存在或不存在靶标的对DNA酶的催化能力的0N-0FF控制也不是必需的。此 外，根据本发明的分析试剂盒，能够容易地进行本发明的分析方法。因为本发明涉及使用适 体的靶标检测方法，可以认为，例如，本发明是用于各种领域（如临床医疗实践、食品和环 境)中的研究和试验的非常有用的技术。
[0018] 附图简述
[0019] [图1]图1是示出本发明的分析方法的一个实例的示意图。
[0020] [图2]图2是示出本发明的分析方法的另一个实例的示意图。
[0021] [图3]图3是示出本发明的分析方法的又一个实例的示意图。
[0022] [图4]图4是示出本发明的分析方法的此外另一个实例的示意图。
[0023][图5]图5是显示实施例1中发光量的图表。
[0024][图6]图6是显示实施例2中发光量的图表。
[0025][图7]图7是显示实施例3中发光量的图表。
[0026][用于实施本发明的方式]
[0027] 如上所述，本发明的分析方法是用于分析靶标的分析方法，其包括:使得与所述靶 标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标 的复合物的复合物形成步骤;通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中 的至少一个释放的核酸酶处理步骤;使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行 反应的酶处理步骤;检测所述酶反应的检测步骤;和根据检测所述酶反应的结果分析已经 形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。
[0028] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，其还包括，在所述复合物形成步骤之 后的将所述复合物级分和所述非复合物级分与用于所述复合物形成的反应体系分离的分 离步骤。
[0029] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述分离步骤中，通过使得用于所 述复合物形成的所述反应体系与固定的结合物质彼此接触以将所述复合物与所述结合物 质结合，而将所述复合物级分和所述非复合物级分分离，并且所述结合物质是与靶标结合 的结合物质。
[0030] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述分离步骤中，在所述复合物已 经与所述结合物质结合之后，洗涤所述固定的结合物质以移除未反应的结合核酸分子。 [0031 ]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述复 合物级分进行所述核酸酶处理将所述核酸单体从所述复合物释放。
[0032]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述非 复合物级分进行所述核酸酶处理将所述核酸单体从未反应的结合核酸分子释放。
[0033] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子包含添加到其上 的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
[0034] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子负载在载体上。
[0035] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述载体还包含添加到其上的多核 苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
[0036] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述复 合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从未反应的结合核酸 分子释放。
[0037] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子是与单链核酸分 子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列；在所述复合 物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交体中的所述结合核 酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释放;并且在所述核酸 酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单 体从所述释放的单链核酸分子释放。
[0038] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子负载在载体上并 且是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的 序列；在所述复合物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交 体中的所述结合核酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释 放;并且在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶 处理以将所述核酸单体从所述释放的单链核酸分子释放。
[0039] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，其还包括，在所述复合物形成步骤之 后的将所述释放的单链核酸分子与所述复合物形成步骤中的反应体系分离的分离步骤，并 且在所述核酸酶处理步骤中，对所述分离的单链核酸分子进行所述核酸酶处理以将所述核 酸单体从所述单链核酸分子释放。
[0040] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述核酸酶是以所述单链核酸分子 为底物的核酸酶。
[0041 ]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
[0042]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，作为所述酶的底物的所述核酸单体 是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
[0043]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述酶是具有荧光素酶活性的蛋白 质，并且其具体实例是荧光素酶。
[0044] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述酶处理步骤中，所述酶反应在 试剂的存在下进行，并且
[0045] 所述试剂是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而产生的试剂，或者 是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而消失的试剂。
[0046] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，在所述检测步骤中，检测到通过所述 酶反应产生的信号或通过所述酶反应导致消失的信号。
[0047] 本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述信号是光信号和电信号中的至 少一种。
[0048]本发明的分析方法可以被配置为使得:例如，所述载体是珠或平板。
[0049]本发明的分析试剂盒是，例如，用于在根据本发明的分析方法中使用的分析试剂 盒，其包括:与靶标结合的结合核酸分子;核酸酶;和以核酸单体为底物的酶。
[0050] 本发明的分析试剂盒可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子包含添加到其 上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
[0051] 本发明的分析试剂盒可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子负载在载体上。
[0052] 本发明的分析试剂盒可以被配置为使得:例如，所述载体还包含添加到其上的多 核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
[0053]本发明的分析试剂盒可以被配置为使得:例如，所述结合核酸分子是与单链核酸 分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，并且通过 与所述靶标接触，所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标形成复合物并且释放所述