一种l-草铵膦的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种L-草铵膦的生产方法;具体地说是 一种生物酶法生产光学纯L-草铵膦的方法。
【背景技术】
[0002] 草铵膦，英文名为:Phosphinothricin(简称PPT)，一般是指化合物2-氨基-4-[轻 基（甲基)膦酰基]-丁酸或其与碱性化合物形成的盐。草铵膦是由赫斯特公司于80年代开发 的（后归属于拜耳公司）广谱触杀型除草剂，属于膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，在 叶子内转移，但不能转移到别处，谷氨酰胺合成受抑制后，导致铵离子累积，叶绿体解体，从 而使光合作用受抑制，最终导致植物死亡。
[0003]
2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸
[0004] 草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦(式2)和D-草铵膦(式3)。但只有L-型 具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性 较小，除草谱广，对环境的破坏力小。
[0005]
[0006] 目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型 的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50%，这对于提高原子经济性、降低使 用成本、减轻环境压力都具有重要意义。
[0007] 制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种:化学合成法、手性拆分法以及生物催化 法。
[0008] 化学合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，如 Minowa N等利用甘氨酸为起始原料合成L-草铵勝(Hirayama M.Asymmetric Synthesis of (+)-Phosphinothricin and Related Compounds by the Michael Addition of Glycine Schiff Bases to Vinyl Compounds[J].Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1987,60:1761 - 1766.hZeiss H J等对L-草铵膦的不对称合成做了很多尝试 (Enantioselective Synthesis of Both Enantiomers of Phosphinothricin via Asymmetric Hydrogenation ofa-acylamidoAcrylates[J]. Journal of Organic Chemistry,1991,56:1783-1788.),(Enantioselective Synthesis of L_ Phosphinothricin from L-methionine and L-glutamic Acid via L-vinylglycine[J] .Tetrahedron, 1992,48(38): 8263-8270.)。不对称合成法工艺步骤多、收率低，所用不对称 合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。
[0009]手性拆分法是通过化学合成外消旋DL-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂， 进行D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点，一是 需要使用手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，四是工 艺比较复杂。
[001 0]相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离 纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。
[0011] 早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶 的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸一一2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称 ΡΡ0)。转氨作用是一个可逆反应，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸可在转氨酶的催化下通 过逆反应生成L-草铵膦。
[0012] 国际上，Schulz A 等人（Stereospecific Production of the Herbicide Phosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation and Characterization of a Phosphinothricin-specific Transaminase from Escherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology，1990,56:1-6 ·)(美国专利US5221737)早在上世纪90年 代就利用从E.coli K-12中分离到的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物， L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦（图1)。转氨酶经固定化后安装至生物 反应器，产物浓度可达76. lg/L，最高产率为50g/(L · h)，L-草铵膦的ee值超过99.9%。但这 个工艺有两大缺陷，其一是原料ΡΡ0不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90 % ;其二是要 使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的 谷氨酸给分离带来了很大的麻烦，问题的关键在于以L-谷氨酸作为氨基供体时酶促转氨反 应是一个可逆反应。
[0013] 解决这一问题的途径之一就是利用L-天冬氨酸代替L-谷氨酸，L-天冬氨酸经转氨 作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不稳定、易分解为丙酮酸，从而打破了转氨反应 的平衡。鉴于此，Bartsch K(美国专利US6335186 B1)在上述单酶反应体系下，增加一个草 酰乙酸转氨酶，组成双转氨酶偶联反应体系（图2)。然而，在偶联反应中仍然需要使用谷氨 酸，谷氨酸与酮戊二酸的在反应中形成平衡，其结构又与产品L-PPT极为类似，难以在分离 纯化中加以去除；而且还增加了两种需要分离的杂质草酰乙酸和L-天冬氨酸。此外，由于动 力学参数的不同，使用两种酶的过程比使用1种酶的更加难以最佳化。因此，在此工艺中ΡΡ0 的转化率也只有85%。
[0014] Bartsch K等随后在中国申请的专利（中国专利CN1349561A)中又提出了一条新工 艺(如图3)，他们筛选得到了能够特异性地转化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙 酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体。但此工艺效率低下，当底物ΡΡ0的浓度为 5 5 2mmo 1 /L、在几乎完全消耗大约7 0Ommo 1 / L的原料L-天冬氨酸的情况下，只生成 251.9mmol/L的产物L-PPT，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸。原料PPO反应 转化率只有52 %。
【发明内容】
[0015] 本发明针对现有转氨酶法生产L-PPT工艺存在的缺陷，提供了一种L-草铵膦的生 产方法，该方法原料转化率高、生产成本低、收率高。
[0016] 一种L-草铵膦的生产方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底 物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨 基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦;所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 ~3所示。
[0017] 其中，氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的转氨酶来源于大肠杆菌K12W3110(E.coli K12W3110)。氨基酸序列为SEQ ID如.2所示的转氨酶来源于枯草芽孢杆菌168(8&(^11118 subtis 168)。氨基酸序列为SEQ ID .3所示的转氨酶来源于巨大芽孢杆菌￥￥811 (Bacillus magaterium YYBM1)。
[0018] 作为优选，所述细胞为表达转氨酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1~3所示。
[0019] 具体地，所述工程菌含有表达载体pET-28a( + )，所述转氨酶基因连接在表达载体 pET-28a( + )上。
[0020] 上述生产L-草铵膦的生物催化反应不仅可以采用表达转氨酶的工程菌，还可以采 用细胞破碎后的离体转氨酶，或者是经固定化后的转氨酶。
[0021 ]作为优选，转氨反应中，lOOOOrpm离心10min后的湿重计，所述工程菌的添加量为 反应液重量的0.5~25%。更优选，所述细胞的添加量为反应液重量的5~10%。
[0022]作为优选，所述丙氨酸与底物的摩尔比为1~6:1;更优选，所述丙氨酸与底物的摩 尔比为2~4:1。
[0023]反应体系中还包括辅酶，该辅酶为维生素 B6类型辅酶，例如，吡哆醇、吡哆醛和吡 哆胺或它们的衍生物。具体地，所述辅酶为磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺；以质量分数计，所述 辅酶的添加量为〇. 〇 1~2%〇;更优选，0.1~1 %〇。
[0024]作为优选，所述转氨反应的温度为20~70°C，时间为6~72小时；更优选，温度为30 ~60°C，时间为12~36小时。
[0025]作为优选，控制转氨反应的pH值为6~9。采用碱进行pH的调节，如:氢氧化钠、氢氧 化钾、氢氧化铵、异丙胺、三乙胺等。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027] (1)本发明以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基）丁酸及其盐为底物，丙氨酸为氨基供 体，通过特定的转氨酶催化底物发生转氨反应，能够将底物完全转化成为L-草铵膦，原料转 化率高，转化率可达1 〇〇 %。
[0028] (2)本发明方法简化了分离工艺，反应完成后，过量的丙氨酸易于与产品L-草铵膦 分离;与此同时，副产物丙酮酸是众多生化反应的中间物，很容易经过酶促反应转变为其他 物质，从而进一步简化了后续精制工艺，提高了产品总收率。
[0029] (3)本发明原料易得且成本低廉，过量的原料还可回收再利用，环保压力小，适合 大规模工业化生产。
【附图说明】
[0030]图1为以谷氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
[0031]图2为双转氨酶体系生产L-PPT的反应式。
[0032]图3为以天冬氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
[0033]图4为本发明以丙氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
[0034]图5为本发明涉及的反应物和产物(反应过程中）的高效液相检测图谱；
[0035] 其中，1:保留时间3.572min为L-丙氨酸;2:保留时间：4.673min为丙酮酸；
[0036] 3:保留时间：5.483min为未知杂质;4:保留时间：6.567min为L-PPT; 5:保留时间：： 26.441min为ΡΡ0。
[0037]图6为本发明涉及的反应物和产物(反应结束后)的高效液相检测图谱；
[0038] 其中，1:保留时间3.569min为L-丙氨酸；2:保留时间：4.673min为丙酮酸；3:保留 时间：5.481min和5.727min为未知杂质；4:保留时间：6.560min为L-PPT;
[0039]图7为原料2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称ΡΡ0)的质谱图；
[0040]其中，A图为ΡΡ0的正源质谱图；B图为ΡΡ0的负源质谱图。
【具体实施方式】
[0041]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0042]本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨 姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0043]上游基因工程所用试剂:本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购 自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化 试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a( + )等购 自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购 自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限 公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
[0044]下游催化工艺所用试剂:2_羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称ΡΡ0)为实验室合 成，其质谱图如图7所示;L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药 集团化学试剂有限公司。
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