羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称ΡΡ0)的结构式如式(1)所示;L-草铵膦(简 称L-PPT)的结构式如式(2)所示;具体如下：
[0046]
[0047] 本发明转氨反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产 物进行分析。HPLC分析方法为：液相色谱仪:Agilent 1100;色谱柱 SAX，5μηι，4 · 6_ X 250_。流动相：lOOmM磷酸二氢钾水溶液：乙腈=10:1。检测波长:205nm。 流速:1. OmL/min。柱温:40°C。具体各相关物质出峰情况见液相色谱图。
[0048] 实施例1
[0049] 一、分别从大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis 168以 及巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组中克隆转氨酶基因，根据相应基因组 DNA 序列（GenBank 登录号分别为 CP012868.1、CP010052.1和 CP001982.1)设计相应的 PCR 上 游引物和下游引物。
[0050] 来源于E.coli的转氨酶的引物：
[0051 ] EC-F序列：5 ' -CCGGAATTCATGAGCAACAATGAATTCCATC-3 '（EcoRI)
[0052] EC-R序列：5 ' -CCGCTCGAGTTAATCGCTCAGCGCATCC-3 '（XholI)
[0053] 来源于Bacillus Subtilis的转氨酶的引物：
[0054] BS-F序列：5 ' -CCCGAGCTCATGAGTCAAACAACAGCAAGCATCA-3 '（SacI)
[0055] BS-R序列：5' -CCCAAGCTTTTAAGCTCGCAGGCCCGCCT-3'（HindllI)
[0056] 来源于Bacillus magaterium的转氨酶的引物：
[0057] BM-F序列：5 ' ~CGCGGATCCATGAGTCAAACTTTTAGCAA~3 '（BamHI)
[0058] BM-R序列：5' -CCCAAGCTTTTACACTTCAACCGTTTGCT-3'（HindllI)
[0059] 在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点，如下划线所示，具体限制酶见引物序 列括号内。分别以大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及 巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组DNA为模板，相应的上下游引物进行PCR 扩增，PCR反应体系和反应条件如下：
[0060] PCR扩增体系： DNA聚合酶 25 μL; 上游引物（:10|πηο1/μ1_) 1.5 μL；
[0061 ] 卜游丨物（10 pmol/μΙ). 1.5 μL： Temp laic 1.0 μL； ddH-：0 21 μΙ,
[0062] PCR扩增条件：
[0063] 1)预变性：95°C5min;
[0064] 2)变性:98。(：1〇8;退火：58。(：158 ;延伸：72。(：1〇8;共循环30次；
[0065] 3)延伸：72°C10min;
[0066] 4)4。(：保存2.011。
[0067] PCR扩增结束后，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为 单一条带，大小为1400bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤 参照纯化试剂盒说明书。
[0068] 二、表达载体和工程菌的构建
[0069] 表达载体pET_28a( + )和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶 切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核 苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载 体pET-28a (+)上，连接体系如下表1所示：
[0070] 耒InRTjSaY + 'l-mhT重钼耒伏席鈴连培优系
[0071]
[0072]将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16 °C金属浴中连接12h。将酶连产物 转化至E. coli DH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳 性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。再将重组表达载体转入表达宿主 E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误的基因工程菌即为E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-gabT。
[0073] 实施例2
[0074] 一、微生物的培养
[0075] LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定 容，121°C灭菌20min，待用。
[0076] 将含有转氨酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50yg/mL卡那霉素的 5mL LB液体培养基中，37°C震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培 养基中，37 °C震荡培养至0D6QQ达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.3mM，28°C下诱导培养 20h。培养结束后，将培养液lOOOOrpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-70°C超低温冰箱 中保存，待用。
[0077]二、粗酶液的制备
[0078]将培养结束后收集到的菌体，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。 之后将菌体重悬于!^8-!0(5〇11^，？!17.5,2〇1111咪唑，0.31恥(：1，511^二硫苏糖醇)缓冲液 中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为含转氨酶的粗酶液。
[0079] 实施例3
[0080] 定量称取ΡΡ0、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30 %氨水调节溶液pH=7.5， 加到容量瓶中，用去离子水定容，得到ΡΡ0终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆 醛终浓度为ImM的混合液。
[0081 ] 培养能够表达SEQ ID N0.1所示转氨酶（来源于大肠杆菌E.coli K12W3110)的基 因工程菌，取lmL培养液，lOOOOrpm离心10min，弃上清，得到细胞5mg;加入到lmL上述获得的 混合液中，重悬，于37 °C金属浴振荡反应器内反应24h。
[0082] 反应结束后，进行HPLC检测，有L-草铵膦生成，但未发现明显的ΡΡ0峰，说明ΡΡ0转 化率达到100 %。
[0083] 定量称取ΡΡ0、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30%氨水调节溶液pH=7.5， 加到容量瓶中，用去离子水定容，得到ΡΡ0终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆 醛终浓度为ImM的混合液。
[0084] 将含有SEQ ID N0.4所示的谷丙转氨酶编码基因的基因工程菌培养结束后，取lmL 培养液离心，弃上清。加入上述含PPO 60mM，丙氨酸180mM以及磷酸吡哆醛ImM的溶液lmL，重 悬，于37°C金属浴振荡反应器内反应一个星期，每隔24小时取样分析，HPLC检测，未发现明 显的L-草铵膦生成，说明此转氨酶对这个反应无催化效果。
[0085] 实施例4
[0086] 培养能够表达SEQ ID .2所示转氨酶（来源于枯草芽孢杆菌168(8&(^11118 subtis 168))的基因工程菌，将离心收集到的细胞5g，制成粗酶液。
[0087] 定量称取ΡΡ0到圆底烧瓶中，用30 %氨水调节溶液pH = 8.0，加入上述粗酶液，使 ΡΡ0的终浓度为80mM，再加入280mM的丙氨酸和ImM的磷酸吡哆醛，用去离子水定容到50mL。 通过水浴控制反应温度为40 °C ;磁力搅拌，HPLC监测反应，反应时间为28h。
[0088]反应过程数据如下：
[0089]
[0090] 实施例5
[0091] 培养能够表达SEQ ID如.3所示转氨酶（来源于巨大芽孢杆菌￥￥811(8&(^11118 magaterium YYBM1))的基因工程菌，离心收集细胞。
[0092] 定量称取ΡΡ0到100mL反应器中，用30%氨水调节溶液pH=9.0,用去离子水定容到 100mL，使ΡΡ0的终浓度为100mM，再加入25g上述离心收集的细胞，再加入400mM的丙氨酸和 ImM的磷酸吡哆醛。通过水浴控制反应温度为50°C ;磁力搅拌，HPLC检测ΡΡ0转化情况，反应 时间为19h。反应数据如下：
[0093]
[0094] 对比例1
[0095] 培养能够表达SEQ ID如.3所示转氨酶（来源于巨大芽孢杆菌￥￥811(8&(^11118 magaterium YYBM1))的基因工程菌，离心收集细胞。
[0096] 定量称取ΡΡ0到lOOmL反应器中，用30%氨水调节?!1=9.0，用去离子水定容，使??0 的终浓度为100mM，在加入25g上述离心收集的细胞，再加入400mM的谷氨酸和ImM的磷酸吡 哆醛。通过水浴控制反应温度为50°C ;磁力搅拌，HPLC检测ΡΡ0转化情况，反应时间为72h。反 应数据如下：
[0097]
[0098] 对比例2
[0099] 定量称取ΡΡ0、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30%氨水调节溶液pH=7.5， 加到容量瓶中，用去离子水定容，得到ΡΡ0终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆 醛终浓度为ImM的混合液。
[0100] 培养能够表达SEQ ID .4所示谷丙转氨转氨酶（来源于大肠杆菌1(121?；1655 (E . coli K12MG1655))的基因工程菌，制成粗酶液；取lmL粗酶液离心，弃上清，得到细胞 5mg;加入到lmL上述获得的混合液中，重悬，于37°C金属浴振荡反应器内反应一个星期，每 隔24小时取样分析，HPLC检测，未发现明显的L-草铵膦生成，说明此转氨酶对这个反应无催 化效果。
【主权项】
1. 一种L-草铵膦的生产方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基）丁酸及其盐为底 物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨 基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦;其特征在于，所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1~3所示。2. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述细胞为表达转氨酶的工程菌，所述 工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1~3所 不。3. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述细胞的添加量为反应液重量的1~ 15%〇4. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述丙氨酸与底物的摩尔比为1~6:1。5. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，反应体系中存在辅酶，所述辅酶为磷酸 吡哆醛或磷酸吡哆胺。6. 如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，以质量分数计，所述辅酶的添加量为 0 · 01 ~2%〇 〇7. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述转氨反应的温度为20~70°C，时间 为6~72小时。8. 如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，控制转氨反应的pH值为6~9。
【专利摘要】本发明公开了一种L-草铵膦的生产方法，该方法包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦；所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1～3所示。本发明以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，丙氨酸为氨基供体，通过特定的转氨酶催化底物发生转氨反应，能够将底物完全转化成为L-草铵膦，原料转化率高，转化率可达100％。
【IPC分类】C12N9/10, C12R1/19, C12P13/04
【公开号】CN105603015
【申请号】CN201610045121
【发明人】杨立荣, 周海胜, 蒙丽钧, 刘善和, 韦永飞, 谷顺明, 袁晓路, 方红新, 刘亚运, 徐刚, 吴坚平
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月22日