一种建立cyp2c11基因敲除大鼠模型的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种建立CYP2C11基因敲除大鼠模型的方法，属于转基因技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞色素 P450 (cytochrome P450 )，又称混合功能氧化酶（mixed-function oxidase)或单加氧酶(monooxygenase)，主要存在于肝微粒体中，在内源性物质和包括药 物、环境化合物在内的外源性物质的生物转化中起着关键的作用。P450是药物代谢的第I相 酶，它的活性对药物的代谢和毒性产物的生成往往起着决定性作用。人体内约有75%的药 物通过 CYP 代谢。人体内 CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1 和 CYP3A4 与 95% 现有临床 药物的代谢相关，而与大鼠相对应的CYP1A2，CYP2C11，CYP2C13，CYP2D2，CYP2E1和CYP3A1同 工酶是当两种或两种以上药物联合应用时，由于药物之间的相互作用而使药效或不良反应 加强或减轻，甚至出现未预期的不良反应。因此，对该酶系的研究一直是药物代谢和毒理学 中的热点领域。
[0003] 尽管P450基因敲除小鼠模型的建立和应用已经取得了初步成功，但在实际的操作 过程中一直存在两个主要困难，一是在临床前药物安全性评价工作中，常规的手段包括基 于大鼠肝微粒体的体外试验、基于大鼠的各类毒性试验和药代动力学试验，如何把这些大 鼠的数据与基因敲除小鼠模型的实验数据加以整合，需要操作者对不同物种的P450酶系具 有深入的理论认识和长期的实践经验，这一困难在相当程度上制约了 P450基因敲除小鼠模 型的使用和推广；二是小鼠模型受限于其物种，存在可检测组织体积小，体液容量小等特 点，这对后续的药代动力学和毒理学试验提出了更高的技术要求。因此建立P450基因敲除 大鼠模型，将切实解决上述两个困难。
[0004] 人类CYP2C9基因位于10号染色体，全长55kb，包含9个外显子和8个内含子。目前已 证实约 10%-20%的临床常用处方药物是CYP2C9的底物，其中包括抗癫痫作用的苯妥英钠、 抗凝血作用的华法林等一些治疗指数较窄的药物。C Y P 2 C11作为大鼠 P 4 5 0基因，与人类 CYP2C9具有基本相同的底物和组织分布(尤其在雄性大鼠体内），被视为CYP2C9的直系同源 基因。因此，CYP2C11基因敲除大鼠模型缺乏人类CYP2C9相类似的代谢能力，可以较好的模 拟CYP2C9慢代谢人群，验证候选药物针对该人群的安全性。因此CYP2C11实验模型可以用以 评估人体内基于CYP2C9药物相互作用情况，另外也可以作为个体化给药、致癌物代谢等研 究的动物模型。
[0005] 锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)分别通过锌指蛋白 (Zinc finger protein，ZNP)和类转录激活因子效应物（Transcription activator-like effector)识别DNA序列，并在特定位点对DNA进行切割，形成双链断裂 (Double strand breaks DSB)，随后在非同源末端连接（Non homologous end joining， NHEJ)修复机制下形成随机的多个碱基的插入或删除，从而实现基因敲除;或者在同源重组 (Homologous recombination，HR)修复机制以及修复模板(donor)存在的条件下，实现定点 的单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变。此外，利用TALEN和特定的转录因子或者抑 制因子结合，还可以实现对内源基因特异性的转录激活或者抑制、操纵内源基因的表达。目 前TALEN技术的靶位点已经覆盖了多个物种的全基因组，实现了真正意义上的全基因组操 作。ZFN和TALEN技术不仅极大地提高了基因打靶的效率，而且更高效地实现了对基因组的 定点操作以及基因表达控制，如定点插入、删除和替换、转录抑制或激活等，真正的在应用 水平实现了对动植物基因组的精细操作，因此也将以ZFN和TALEN为代表的技术统称为基因 组编辑(Genome editing)技术。
[0006] CRISPR是指成族的、规律的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) <XRISPR-CAS9系统主要是由三个部分组成，分别是Cas9蛋 白、precursor CRISPR RNA (pre-crRNA)和 trans-activating crRNA (tracrRNA)， CRISPR-CAS9识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-Strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologousend joining，NHEJ)，造成移码突变（frame shift mutation)，导致基因敲除（刘志国，CRISPR-CAS9系统介导基因组编辑的研究进展，畜牧兽医学报，2014-45( 10) : 167-1583)。
[0007] 与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体， 而且可以在不同的位点同时引入多个突变。从质粒构建上来看，CRISPR-CAS9技术设计简 单，操作简便，节约成本。CRISPR-CAS9系统设计过程中只需改变勒基因 SgRNA的20个碱基组 成的向导序列即可，一步简单的分子克隆即可完成。CRISPR/Cas9技术的发展十分迅猛，已 经广泛应用在动物的细胞水平、植物、微生物以及人类医学等各方面。但是CRISPR-CAS9系 统目前也面临着脱靶率高、特异性差的难题，这无疑是CRISPR/Cas9系统应用于基础研究和 临床治疗的最大的挑战。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种CRISPR/cas9基因敲除的CYP2C11大鼠模型。
[0009] 另一个方面，本发明提供了一种基于CRISPR/cas9基因敲除技术建立CYP2C11基因 大鼠动物模型的方法，包括以下步骤： (1)确定CYP2C11大鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNAl和sgRNA2:使用Gene Knock-Out with Cas9软件（南京徇齐生物技术有限公司提供），确定在CYP2C11基因 （Gene ID: 29277)的靶位点exon6内挑选2个特异性的sgRNA靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNAl: GCTACTGTAACTGACATGTTCSEQ. ID.NO.1)；sgRNA2：TCAAGGGTAAACTCAGACTGCSEQ. ID.NO.2)〇 CYP2C11基因长度为684bp。
[0010] (2)设计合成两对寡聚核苷酸链sgRNAl和sgRNA2的引物序列：根据步骤（1 )sgRNA 靶序列，设计2对引物(南京金斯瑞生物有限公司）， Rat_CYP2Cll_c9_l-〇l(SEQ. ID. NO.3)：cacc GCTACTGTAACTGACATGTT 和Rat_CYP2Cll_c9_l-02(SEQ·ID·N0·4):aaacAACATGTCAGTTACAGTAGC ; Rat_CYP2Cll_c9_2-〇l(SEQ. ID. NO.5)：cacc TCAAGGGTAAACTCAGACTG 和Rat_CYP2Cll_c9_2-02(SEQ·ID·NO·6):aaac CAGTCTGAGTTTACCCTTGA， (3)将步骤(2)中合成的2对引物以逐步降温(94°C_55°C)的方法退火成双链，插入经 Bsal酶切好的Cas9-gRNA-Bsal载体中。载体DNA测出浓度为1000ng/mL，测序验证插入片段 正确，将正确的克隆用作转录模板。
[0011] (4)将步骤（3)正确的克隆作为PCR模板，通过PCR得到带有T7启动子序列的 sgRNAl，sgRNA2。用T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit 试剂盒体外转录sgRNAl， sgRNA2。酚氯仿萃取和酒精沉降法纯化转录产物。
[0012] (5)Cas9载体体外转录为Cas9 mRNA并进行纯化：使用T7 Ultra Kit (Ambion, AM1345)试剂盒，将pST1374-cas9载体经Agel线性化后，在体外转录成Cas9 mRNA。用RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74104)试剂盒纯化Cas9 mRNA。
[0013] (6)将步骤(5)构建好的cas9 mRNA与步骤(4)构建好的sgRNAl和sgRNA2,分别在斑 马鱼受精卵中检测活性，结果显示sgRNA2活性较