一种半胱氨酸检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及化学合成和生物分析检测领域，尤其设及一种半脫氨酸检测试剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 半脫氨酸作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成的20多种氨基酸的一 种，同时，半脫氨酸作为生物体内的一种重要的硫醇，它在细胞内可逆还原反应W及毒物代 谢过程中扮演了至关重要的角色。因此，在细胞水平下维持合理的半脫氨酸浓度，是衡量生 命体正常新陈代谢的标准之一。人体内低浓度水平的半脫氨酸往往与许多疾病息息相关， 比如造血机能下降、皮肤损伤、甚至癌症等。
[0003] 传统的半脫氨酸检测方法主要包括高效液相色谱、毛细管电泳法、电化学分析法 W及质谱法等等。然而，运些方法对样品都是具有破坏性的，无法检测活细胞或是组织内半 脫氨酸的浓度水平。巧光探针具有对检测样品非破坏性的特点，同时具有简便、易操作、W 及实时检测等优点，而备受人们的关注。然而，大部分已报道的半脫氨酸巧光检测试剂的灵 敏性不高，制备复杂，存在明显的生物毒性，难W达到商品化应用要求。
[0004] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0005] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种半脫氨酸检测试剂及其制 备方法，旨在解决现有检测试剂的灵敏性不高，制备复杂，存在明显的生物毒性，难W达到 商品化应用要求的问题。
[0006] 本发明的技术方案如下： 一种半脫氨酸检测试剂，其中，所述半脫氨酸检测试剂具有如下所示的结构通式：
其中：町为H、C1或OC也;R2为H、C1或OC也。
[0007] -种如上所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，包括步骤： A、 将含Ri和R2取代基的临径基苯乙酬和2-醒基嚷吩加入溶剂中，然后滴加入氨氧化钟 溶液，滴加完毕后室溫揽拌8~12小时;揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加双氧水溶液，室溫揽 拌20~25小时，用稀酸中和，将沉淀过滤干燥后，重结晶，获得中间体； B、 将中间体加入干燥的二氯甲烧中，加入=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加丙締酷氯，反应 20~40分钟后，继续在室溫下反应4-20小时，加入碳酸钢饱合水溶液，萃取后干燥，浓缩后分 离。
[000引所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤A中，含Ri和R2取代基的临径基苯 乙酬和2-醒基嚷吩加入的摩尔比为I: (I~3)。
[0009] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤A中，溶剂为乙醇，乙醇的加入量 为10~50毫升。
[0010] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤A中，氨氧化钟的质量分数浓度 为 10~40〇/〇。
[0011] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤A中，双氧水的加入量为5-30毫 升，双氧水的质量分数浓度为20~40%。
[0012] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤A中，在乙醇中重结晶。
[0013] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤B中，萃取后加入无水硫酸钢干 燥。
[0014] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，步骤B中，浓缩后利用凝胶色谱柱分 离。
[0015] 所述的半脫氨酸检测试剂的制备方法，其中，凝胶色谱柱分离时的洗脱剂为二氯 甲烧。
[0016] 有益效果:本发明的上述检测试剂不具有生物毒性，且对半脫氨酸的灵敏性较高， 能够选择性的检测半脫氨酸，能够对细胞内的半脫氨酸实现巧光检测，达到商品化应用要 求。
【附图说明】
[0017] 图1为四种检测试剂化-切S-1、化-切S-2、化-切S-3和化-切S-4的对人类厮静脉内 皮细胞的细胞毒性实验结果图。
[0018] 图2为检测试剂FkCys-2对常见氨基酸的巧光响应图。
[0019]图3为试剂FkCys-2检测活的人类厮静脉内皮细胞中半脫氨酸的巧光成像图。
[0020] 图4为N-乙基马来酷亚胺处理后的人类厮静脉内皮细胞，经化-切S-2染色的巧光 成像图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明提供一种半脫氨酸检测试剂及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案 及效果更加清楚、明确，W下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施 例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022] 本发明提供一种半脫氨酸检测试剂，其中，所述半脫氨酸检测试剂具有如下所示 的结构通式： 具甲：Ki刃H、(Ji
现UU出；K2刃H、(Jl或OC曲。本发明上述结构通式的半脫氨酸检测试剂是 基于功能化黄酬染料分子而设计合成的。本发明的上述检测试剂不具有生物毒性，且对半 脫氨酸的灵敏性较高，能够选择性的检测半脫氨酸，能够对细胞内的半脫氨酸实现巧光检 ，达到商品化应用要求。
[0023] 基于上述半脫氨酸检测试剂，本发明还提供一种如上所述的半脫氨酸检测试剂的 制备方法，其中，包括步骤： A、 将含化和R2取代基的临径基苯乙酬和2-醒基嚷吩加入溶剂中，然后滴加入氨氧化钟 溶液，滴加完毕后室溫揽拌8~12小时;揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加双氧水溶液，室溫揽 拌20~25小时，用稀酸中和，将沉淀过滤干燥后，重结晶，获得中间体； 例如，将10毫摩尔的含Ri和R2取代基的临径基苯乙酬和10毫摩尔的2-醒基嚷吩加入 10-50毫升(如，20毫升化醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为10-40%(如，20%)的氨氧化 钟溶液，滴加完毕后室溫揽拌8~12小时（如，10小时）；揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加5-30 毫升(如，15毫升)质量分数为30%的双氧水溶液，室溫揽拌20~25小时(如，24小时），用浓度 为1摩尔/升的稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥后，在劣溶剂(如，乙醇）中重结晶，获得中间体； B、 将中间体加入干燥的二氯甲烧中，加入=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加丙締酷氯，反应 20~40分钟后，继续在室溫下反应4-20小时，加入碳酸钢饱合水溶液，萃取后干燥，浓缩后分 离。
[0024] 例如，将5毫摩尔的中间体加入10-40毫升(如，20毫升)干燥的二氯甲烧中，加入1-5毫升(如，2毫升)的=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加1-5毫升(如，3毫升)丙締酷氯，反应20~40 分钟后（如，半小时后），继续在室溫下反应4-20小时，加入20毫升的碳酸钢饱合水溶液，用 二氯甲烧萃取后加入无水硫酸钢干燥，浓缩后利用凝胶色谱柱分离。其中，凝胶色谱柱分离 时的洗脱剂为二氯甲烧。
[0025] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026] 1、4种检测试剂的合成。
[0027] 实施例1 化-切S-I的合成:将10毫摩尔的临径基苯乙酬和10毫摩尔的2-醒基嚷吩加入20毫升乙 醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%的氨氧化钟溶液，滴加完毕后室溫揽拌10小时； 揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加15毫升质量分数为30%的双氧水溶液，室溫揽拌24小时，用 浓度为1摩尔/升的稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥后，在乙醇中重结晶，获得中间产物;再将5 毫摩尔的中间体加入10毫升干燥的二氯甲烧中，加入1毫升的=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加 3毫升丙締酷氯，反应半小时后，继续在室溫下反应4小时，加入20毫升的碳酸钢饱合水溶 液，用二氯甲烧萃取后加入无水硫酸钢干燥，浓缩后利用凝胶色