一种中国被毛孢优质菌株的获取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物科学领域，特别设及一种中国被毛抱优质菌株的获取方法。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草[0曲iocordyceps sinensis(Berk. )G.H. Sung et al.]是我国传统名贵 中药，与人身、鹿茸齐名，具有多种药理作用，近年来，由于市场需求逐年增加，野生资源难 W满足需要，而人工培植冬虫夏草由于技术及成本等方面的原因，产量有限，导致冬虫夏草 的价格居高不下。冬虫夏草发酵菌丝体因具有某些方面与冬虫夏草相类似的功效，受到越 来越多的青睐，良好的菌种来源是发酵的关键制约因素，多年的研究证实，中国被毛抱为冬 虫夏草菌的无性型，获得一株优质的中国被毛抱菌株将对中国被毛抱的发酵工业起着重大 的推动作用。
[0003] 传统的获得中国被毛抱菌株的方式有组织分离（虫体分离、子实体部位分离）、子 囊抱子分离和基内分离几种模式，基内分离由于操作的复杂与其有关的内容鲜有报道，组 织分离和子囊抱子分离均可W获得较多的中国被毛抱菌株，但是获得的菌株品质良莽不 齐，后期需进行大量的筛选工作，筛选出适合用于发酵的少数菌株进行发酵，或通过各种形 式的诱导，W消除菌株发酵过程中产徒产黑色素或者菌株在传代较少次数后即发生退化而 影响产量的不利因素，但运往往需要较长的周期和繁杂的选育工作。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种不损伤骗幅蛾幼虫表皮前提下 获取幼虫消化液中（主要为肠液）中国被毛抱菌株的方法，运种方法操作简单不会使骗幅蛾 幼虫受到损伤，获得菌株的数量较多，且获得的菌株不需经过筛选及诱导直接可作为工业 发酵的初始菌株，菌丝体产量较高。
[0005] 本发明W被中国被毛抱感染后的中华骗幅蛾幼虫消化道中（肠液为主）中的虫菌 体为分离中国被毛抱菌株的初始材料，鱗翅目幼虫消化道的pH多在8.5-11之间，而属于鱗 翅目的骗幅蛾幼虫的消化道偏碱性，多次测定的数据显示在9-11之间。作为中华骗幅蛾幼 虫的专一性寄主-中国被毛抱的最适生长pH值为5.5-7之间，而PH4-5.5及PH7-8之间生长极 为缓慢，在pH4与P册的临界值上几乎不生长，PH4-8之外无在论培养基还是模拟肠液中中国 被毛抱菌体均不生长。传统观念上也认为骗幅蛾幼虫消化道的抑并不支持中国毛抱任何菌 体形态的生长，在实验研究中却发现，骗幅蛾幼虫消化道内存在形态饱满且处于增殖中的 虫菌体，如附图1所示，且W此虫菌体为试材分离中国被毛抱菌株不仅分离的成功率较高， 每次分离培养均可获得较多的菌株外，分离到的菌株在后期的菌种发酵中均表现出了优良 的性能，骗幅蛾幼虫特有的生理结构维持了中国被毛抱W虫菌体状态在消化道内生长并顺 利增殖，同时，在运特殊的生理环境下，中国被毛抱菌体完成了 "自然选育"的过程，不再需 要后期的诱导和筛选，为工业发酵菌株的选择提供了较大的便利。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种中国被毛抱优质菌株的获取方法，包 括如下步骤：
[0007] 1.收集幅蛾幼虫消化液(主要为肠液）：
[000引取经过侵染处理的骗幅蛾幼虫，做化-24h饥饿处理，排空嗦囊内食物残渣后，卡住 幼虫使其无法前后移动，出于本能，虫子会自然吐出消化液(主要为肠液，P朋-11之间）。将 幼虫放回洁净区继续饲养。
[0009] 2.菌落培养
[0010] 收集消化液（主要为肠液)并进行稀释，将稀释液涂布于带有培养基的培养皿表 面，待菌落长至直径为2-4mm时进行单菌落转管培养，防止菌落长大后交叉生长。待菌落直 径为1.5-2.5cm时，即可作为中国被毛抱发酵的初始菌株。
[0011] -些实施例中，本发明步骤1所述的骗幅蛾幼虫为3-5龄，W保证每只虫的反吐物 的排出量大于0.化L。
[0012] -些实施例中，本发明步骤1所述的幼虫饥饿处理所处的环境为:溫度8-12°C，相 对湿度65-85%，无光照。
[0013] -些实施例中，本发明步骤1所述的卡住幼虫为在幼虫胸腹部上方覆盖一块滤纸， 露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前 后移动。
[0014] 一些实施例中，本发明步骤1所述的滤纸的大小为长:宽：10-15cm:7-10cm。
[0015] -些实施例中，本发明步骤2所述消化液(主要为肠液)的稀释，优选地稀释至每10 yL稀释液中菌体个数为8~12个。
[0016] -些实施例中，本发明步骤2所述培养皿培养基的配方为(质量比）：葡萄糖28-32、 蛋白腺8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸儀0.8-1.2、憐酸二氨钟0.2-0.3、琼脂16-20、抗生 素2-3、水800-1200，p册.5-7,优选的为葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、无水硫酸儀1、 憐酸二氨钟0.25、琼脂18、抗生素2.5、水1000,抗生素优选的为庆大霉素、阿奇霉素、青霉素 中的一种或多种。
[0017] -些实施例中，本发明步骤2所述的转管培养，其中试管培养基的配方为（质量 比）：葡萄糖28-32、蛋白腺8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸儀0.8-1.2、憐酸二氨钟0.2- 0.3、琼脂16-20、水800-1200，p册.5-7,优选的为葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、无水 硫酸儀1、憐酸二氨钟0.25、琼脂18、水1000。
[0018] -些实施例中，本发明步骤2菌落培养的环境为：避光、溫度15-18Γ、相对湿度 45%-65%。
[0019] 此外，本发明通过观察菌落形态、显微观察分生抱子状态，并对获得的中华被毛抱 菌株进行了 ITS特异性PCR扩增并测序，测序比对结果为冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk. )G.H.Sung et al.]，表明本发明所述的方法得到的菌株为真正的中国被 毛抱菌株。
[0020] 由W上技术方案可知，整个操作过程不会对骗幅蛾幼虫造成损伤，收集完消化液 (主要为肠液)的幼虫可W继续正常生长，而且可W长成冬虫夏草。
【附图说明】
[0021] 图1，巧光显微镜下肠道中出芽增殖的虫菌体；
[0022] 图2,单菌落分离培养菌落的显微镜检-产抱结构及分生抱子；
[0023] 图3，转管斜面上的菌落培养；
[0024] 图4，本发明获得中国被毛抱DNA序列的BLAST对比图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明实施例公开了一种中国被毛抱优质菌株的获取方法，本领域技术人员可W 借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳 的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本发明所述 方法进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种中国被毛抱优质菌 株的获取方法进行详细说明。
[0027] 实施例1:本发明所述方法获取优质中国被毛抱菌株 [00%] 1.收集幅蛾幼虫消化液
[0029] (1)取经过侵染处理的3龄骗幅蛾幼虫50条，于无菌环境下用脱脂棉薩取75%酒精 溶液擦拭虫体表面进行消毒。
[0030] (2)取一张滤纸平铺于经过灭菌的培养皿表面，在滤纸上喷洒少量无菌水，使滤纸 充分润湿，满盈但不溢出水分。将幼虫放在滤纸上，为防止撕咬，每个培养皿内一条虫。于溫 度8 °C、相对湿度65 %、无光条件下做化饥饿处理。
[0031] (3)将幼虫平放于桌面，在幼虫胸腹部上方覆盖小块滤纸(长*宽，10*7cm)，露出幼 虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移 动，出于本能，幼虫会自然吐出消化液(主要为肠液，pH值10)。将幼虫放回洁净区继续饲养。
[0032] 2.菌落的培养
[0033] (1)将50条幼虫吐出的消化液(肠液)合并在一起，加入无菌水逐级稀释，至每10化 稀释液中菌体个数为8个。每10化稀释液涂布于一个直径9cm的带有培养基的平板培养皿 中，后将涂布好的平板置于避光、15°C、45%相对湿度条件下培养40d后，得到2589个直径为 2-4mm的菌落，所采用的培养基配方为:葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、无水硫酸儀1、 憐酸二氨钟0.25、琼脂18、庆大霉素2.5、水1000，P册.0。
[0034] (2)分别转管，进行单菌落培养，60天后获得直径为1.5-2.5cm单菌落2371个，可作 为中国被毛抱发酵的初始菌株。试管培养基的配方为:葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、 无水硫酸儀1、憐酸二氨钟0.25、琼脂18、水1000，P册.8。
[0035] 实