一种绒毛白蜡ssr标记分子遗传图谱的构建方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学、遗传学和基因组学技术领域且公开了一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括如下步骤：1)提取待测绒毛白蜡亲本和子代的基因组DNA；2)以亲本材料筛选SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测绒毛白蜡亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱。本发明建立了高效低成本的绒毛白蜡SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳定性和共显性等优点，利用该套标记可以进行绒毛白蜡遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动绒毛白蜡遗传学和育种技术的发展。
【专利说明】
一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种绒毛白蜡SSR标记分子构建方法，具体涉及一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，属于分子生物学、遗传学和基因组学技术领域。
【背景技术】
[0002]绒毛白蜡为落叶乔木，高可达10米，小枝密被短柔毛，树皮暗灰色光滑雌雄异株，花杂性，圆锥花序侧生于上年枝上，先开花后展叶，而蜡条、大叶白蜡的花序顶生于当年枝上，花叶同时开放。然而对绒毛白蜡的分子遗传图谱的构建方法相对缺失，为此，我们提出一种绒毛白錯SSR标记分子遗传图谱的构建方法。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，可以有效解决【背景技术】中的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
[0005]本发明提供一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0006]! )DNA的提取:提取待测绒毛白蜡亲本和子代的基因组DNA。
[0007]2)SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物。
[0008]3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测绒毛白蜡亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增。
[0009]4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除，构建绒毛白錯SSR标记分子遗传图谱。
[0010]2.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述待测绒毛白蜡亲本是母本小乔木和父本银杏树;所述子代为149株Fl代的子代。
[0011]3.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下:
[0012](I)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用。
[0013](2)取绒毛白蜡叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液的离心管中。
[0014](3)旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入650C水浴锅中，水浴50min，每隔1min上下翻动离心管，充分混匀。
[0015](4) 12000rpm 常温下离心 lOmin。
[0016](5)取上清液于新的离心管中，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液，其配比为25:24:1，轻轻颠倒混匀，室温放置1min。
[0017](6) 12000rpm 常温下离心 lOmin。
[0018](7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，其配比为24:1，再次抽提。
[0019](8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20 °C冰箱中沉淀20min。
[0020](9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70 %乙醇清洗沉淀2次，每次30min。
[0021 ] (10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入ΙΟΟμΙ TE缓冲液溶解DNA，于-20°C
保存待用。
[0022]4.根据权利要求2所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中所述SSR标记引物为240对引物;所述步骤2)中所述SSR标记引物的筛选基于磁珠富集法，开发小乔木SSR引物，利用母本小乔木和父本银杏树进行SSR标记引物筛选，挑选母本小乔木和父本银杏树中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。
[0023]5.根据权利要求4所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述核心引物为170对核心引物。
[0024]6.根据权利要求4或5所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包括检测提取的DNA的质量。
[0025]7.根据权利要求6所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。
[0026]8.根据权利要求7所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。
[0027]9.根据权利要求8所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中所述生物学软件为genemarkerVl.75软件，读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。
[0028]10.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中分别对PCR扩增结果进行x2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5 %的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式:1: 1、1:2:1、1:1:1:1的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FSLINKAGEMAP进行分子遗传图谱的构建。
[0029]本发明所达到的有益效果是:一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，建立了尚效低成本的域毛白錯SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有尚效性、稳定性和共显性等优点，利用该套标记可以进行绒毛白蜡遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动绒毛白蜡遗传学和育种技术的发展。
【具体实施方式】
[0030]以下结合实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]实施例:本发明一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0032]步骤I提取DNA
[0033]所述绒毛白蜡的基因组DNA提取方法，采用改良后的CTAB法，具体步骤如下:
[0034]步骤(I)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用。
[0035]步骤(2)取绒毛白蜡叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65 °C预热的CTAB提取液(用前加2 % β-巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)。
[0036]步骤(3)旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔1min上下翻动离心管助充分混匀。
[0037]步骤(4)12000rpm常温下离心 lOmin。
[0038]步骤(5)取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置1min0
[0039]步骤(6)12000rpm 常温下离心 lOmin。
[0040]步骤(7)取步骤16所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提。
[0041]步骤(8)取步骤17所得上清液于新的离心管中，加等体积_20°C遇冷的异丙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混匀，放置于-20 0C冰箱中沉淀20min。
[0042]步骤(9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70 %乙醇清洗沉淀2次，每次30min。
[0043]步骤(10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入ΙΟΟμΙ TE缓冲液溶解DNA，于-20 °C保存待用。
[0044]用此方法提取以绒毛白蜡品种‘小乔木’为母本的DNA，以‘银杏树’为父本的DNA，以及149株Fl代的DNA，分别得到各自的DNA样品液。
[0045]步骤2检测DNA
[0046]分别取3μ1步骤I所得的DNA样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其DNA含量(μg/ml)、A260nm/A280nm的值及其在260nm处的吸收峰，检测DNA的纯度。分别取5μ1步骤I所得DNA样品混合1μ16 X Loading Buffer，在浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳中检测DNA的完整性。
[0047]步骤3筛选、扩增及检测
[0048]选择本发明人利用磁珠富集法开发的240对‘小乔木’SSR标记引物，利用2个亲本材料‘小乔木’和‘银杏树’进行SSR引物筛选，SSR标记引物，挑选在‘小乔木’和‘银杏树’中至少一方表现为杂合的引物，并且随机挑选子代DNA进行扩增检测，挑选出扩增效果稳定、无杂带、信号较强的170对SSR核心引物用于分子遗传图谱的构建。
[0049]本发明利用三引物法PCR(即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物，利用毛细管电泳技术同时检测不同荧光染料标记的多个SSR位点扩增SSR位点。PCR反应体系包括:2xTaq PCR预混溶液4μ1，正向引物(ΙμΜ)0.32μ1，反向引物(ΙμΜ) I.28μ1，Μ13引物(ΙμΜ) I.28μ1，模版DNA0.80μ1，ddH200.32μ1，总体积8.ΟΟμΙ C3PCR扩增程序:步骤1:94°C5分钟；步骤2: 94°C 30秒，55°C40秒，72°C45秒，共30循环;步骤3: 94 0C 30秒，53 °C40秒，72°C45秒，共8循环;步骤4: 72 °(:10分钟；步骤5: 10 °C保存。扩增结果送金唯智(北京)生物科技有限公司进行毛细管电泳检测。
[0050]步骤4结果处理
[0051 ] 利用genemarkerVl.75(Soft Genetics LLC，USA)软件读取毛细管电泳原始数据，读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。在240对SSR引物的筛选过程中，共挑选出170对扩增稳定、基本无杂带并且信号较强的SSR核心引物用于后续的分子图谱构建。
[0052]步骤5偏分离标记检测
[0053]分别对170个扩增结果的子代分离情况进行X2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5%的显著水平下找到偏分离标记，有57对标记在5%的显著水平下确定为偏分离标记，偏分尚比率为33.5% ,在构建分子遗传连锁图谱时将偏分尚标记去除。
[0054]步骤6分子遗传图谱的构建
[0055]分别将113个所扩增出的分离形式的类型(1:1、1: 2:1、1:1:1:1)转化为统一的格式，用全同胞群体遗传图谱构建软件FSLINKAGEMAP构建的绒毛白蜡分子遗传图谱。的相对距离，右边表示所用标记编号。根据图谱结果，作图的113个标记，有106个标记被定位在图谱上，标记利用率为93.8%,构建出一张包含16个连锁群，总长为579.86cM的遗传连锁图谱，平均图距为5.47cM，最长的连锁群包含15个标记，总长为91.66cM，平均图距为6.11cM，最短的连锁群包含4个标记，总长为3.90cM，平均图距为0.98cM。
[0056]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: I )DNA的提取:提取待测域毛白錯未本和子代的基因组DNA。 2)SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物。 3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测绒毛白蜡亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增。 4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除，构建绒毛白錯SSR标记分子遗传图谱。2.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述待测绒毛白蜡亲本是母本小乔木和父本银杏树;所述子代为149株Fl代的子代。3.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下: (1)取适量CTAB提取液放入650C水浴锅中预热待用。 (2)取绒毛白蜡叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液的离心管中。 (3)旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔1min上下翻动离心管，充分混匀。 (4)12000rpm常温下离心 lOmin。 (5)取上清液于新的离心管中，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液，其配比为25:24:1,轻轻颠倒混匀，室温放置I Omin。 (6)12000rpm 常温下离心 lOmin。 (7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，其配比为24:1，再次抽提。 (8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20°C冰箱中沉淀20min。 (9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min。 (10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入ΙΟΟμΙTE缓冲液溶解DNA，于-20°C保存待用。4.根据权利要求2所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中所述SSR标记引物的筛选基于磁珠富集法，开发240对小乔木SSR引物，利用母本小乔木和父本银杏树进行SSR标记引物筛选，挑选170对母本小乔木和父本银杏树中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。5.根据权利要求4所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包括检测提取的DNA的质量。6.根据权利要求5所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。7.根据权利要求6所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。8.根据权利要求7所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中所述生物学软件为genemarkerVl.75软件，读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。9.根据权利要求1所述的绒毛白蜡SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中分别对PCR扩增结果进行x2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5 %的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式:1: 1、1:2:1、1:1:1:1的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FSLINKAGEMAP进行分子遗传图谱的构建。
【文档编号】C12Q1/68GK105861643SQ201510889392
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年12月3日
【发明人】束靖, 燕丽萍, 温凯, 秦旭, 田华英, 王鹏, 李 杰, 李阳, 王金全, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】山东农业工程学院