一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用
【专利摘要】本发明公开了一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用，是一种基于分子内电荷转移机制的以1,8?萘酰亚胺为双光子荧光团的新型甲醛类探针。探针分子具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移，该探针在中性缓冲液中能够很好检测甲醛浓度，同时相对于其他醛类化合物，探针对甲醛具有很好的专一性。双光子共聚焦荧光显微镜成像实验很好地证明了探针能够渗透细胞膜进入细胞中且能够在细胞中检测甲醛浓度的变化，为研究细胞中甲醛的生理作用提供一种有效的研究工具。
【专利说明】-种双光子甲酵黄光探针及其制备与应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种检测细胞内甲醒的双光子巧光染料，具体设及基于1,8-糞酷亚胺 的新型双光子甲醒类巧光探针的制备方法及应用。 (二)【背景技术】
[0002] 甲醒作为一种公认的致癌物质，主要来源有=:一类是来源于工业生产，一类来自 于自然界的释放，一类是来源于内源性的甲醒，例如氧化酶、嗜中性粒细胞髓过氧化物酶等 生物反应就能释放甲醒。在正常的人体血液中，甲醒浓度就可达到0.1 mM左右。但是体内过 量的甲醒能够引起呼吸道慢性疾病、胚胎崎形、阿兹海默病和癌症等等。在现阶段的甲醒检 测方法当中，大多是检测空气中的甲醒，国内外报道的检测细胞内甲醒的探针还是寥寥无 几。目前能够专一性检测细胞内甲醒的主要方法有两种，一种是氨基与甲醒反应后，随后自 发发生2-氮杂-柯普重排W及水解，生成信号增强的效果;另一种利用阱和甲醒反应生成产 物达到巧光信号变化的效果。基于双光子染料低细胞毒性、高穿透性等优点，我们设计并合 成了一种Wl ,8-糞酷亚胺为母核的双光子的甲醒类巧光探针，运类探针能够成功检测甲醒 溶液W及细胞内甲醒浓度的变化。 (H)
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种1,8-糞酷亚胺的新型双光子甲醒类巧光探针及其制备方 法与用途。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种式(I)所示双光子甲醒巧光探针，
[0006]
[0007]本发明还提供一种所述双光子甲醒巧光探针的制备方法，所述方法为:将式(4)所 示化合物溶于甲醇中，冰浴至(TC,加入7mol/L氨甲醇溶液，(TC下反应半小时，随后加入丙 締基棚酸邻二叔醇醋，室溫反应过夜，反应液分离纯化，获得所述双光子甲醒巧光探针；
[0008；
[0009]进一步，所述式(4)所示化合物与丙締基棚酸邻二叔醇醋物质的量之比为1:2,所 述氨甲醇溶液用量W氨物质的量计，所述式(4)所示化合物与氨物质的量之比为1:10。
[0010 ]进一步，所述甲醇体积用量W式(4)所示化合物物质的量计为1 OmL/mmo 1。
[0011] 进一步，所述反应液分离纯化方法为:反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行娃 胶柱分离，W体积比20:1的二氯甲烧甲醇混合液为洗脱剂，收集目标组分，干燥，获得所述 双光子甲醒巧光探针。
[0012] 本发明还提供一种所述双光子甲醒巧光探针在检现巧醒中的应用，所述甲醒为扣 mo 1 /L~Smmo 1 /L甲醒水溶液（优选0.25~SmM )，所述甲醒为细胞内扣mo 1/L~Smmo 1 /L甲醒 (优选2~5mM)，所述细胞为子宫颈癌细胞化La。所述甲醒检测限为如mol/L。
[0013]当检测溶液中甲醒时，所述检测方法是将探针溶液加入憐酸缓冲液（IOmM pH = 7.4)中，再加入甲醒水溶液，所述探针溶液为ImM探针二甲基亚讽溶液，所述探针溶液与甲 醒水溶液体积比为1: 2，所述甲醒终浓度为扣mo 1 /L~5mmo 1 /L，即检测范围为扣mo 1 /L~ 当检测细胞中甲醒时，检测范围为如mol/L~5mmol/L。
[0014] 反应路线如下：
[0015：
[0016] 本发明所述化合物(I)可作为双光子巧光探针，应用于甲醒的巧光检测。所述的甲 醒浓度的巧光检测的方法为：W化合物（I)作为巧光探针，与PBS缓冲溶液中的甲醒进行反 应，生成中间产物，随后2-氮杂-柯普重排W及水解，生成巧光物质4,测定在激发为350nm下 的巧光强度变化，从而获得甲醒浓度。
[0017] 其次，W化合物（I)作为巧光探针，与化La细胞进行解化，然后加入外源甲醒进行 巧光成像，激发波长为720nm，发射波长为425nm到470nm。
[0018] 本发明巧光探针的结构中W3号位的取代基的改变，实现推-拉电子能力的变化， 从而达到吸收光谱W及发射波谱蓝移的效果。
[0019] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明选用的1,8-糞酷亚胺结构 是个双光子巧光团，具有良好的光稳定性W及很大的斯托克位移。我们合成的探针对甲醒 水溶液具有很好的特异性，在生物细胞成像时选用长波长的激发波长，降低细胞自身巧光 背景，穿透能力强，对细胞损伤小，能够检测细胞内甲醒的浓度，最低检测限为扣M，为研究 细胞中甲醒的生理作用提供一种有效的研究工具。 (四）
【附图说明】
[0020] 图1为本发明中探针(I)的核磁氨谱。
[0021] 图2为本发明中探针（I)的核磁碳谱。
[0022] 图3为本发明中探针（I)在抑为7.4条件下加入OmM和5mM甲醒水溶液浓度的紫外吸 收光谱，曲线（I) +甲醒是指探针(I)加入5mM甲醒水溶液，曲线（I)是指探针（I)加入OmM甲醒 水溶液。
[0023] 图4为本发明中探针（I)在pH为7.4激发波长为450nm条件下加入不同甲醒水溶液 浓度下的巧光光谱，曲线（I)是指探针(I)加入OmM甲醒水溶液。
[0024] 图5为本发明中探针（I)在pH为7.4激发波长为350nm条件下加入不同甲醒水溶液 浓度下的巧光光谱。
[0025] 图6为本发明中探针（I)在抑为7.4激发波长为350nm发射波长为510nm条件下加入 0.5mM甲醒水溶液下的时间巧光变化图。
[0026] 图7为本发明中探针（I)在pH为7.4激发波长为350nm条件下加入甲醒和不同生物 相关活性小分子的巧光光谱。
[0027] 图8为本发明中探针（I)在不同抑值激发波长为350nm发射波长为510nm条件下加 入OmM和5mM甲醒浓度的巧光变化，（I)是指探针（I)加入OmM甲醒水溶液。
[0028] 图9为本发明中探针(I)和化合物4的密度泛函数计算。
[0029] 图10为本发明中探针（I化抑为7.4的条件下加入ImM后不同时间段的高效液相色 谱图。
[0030] 图11为本发明中探针（I)在子宫颈癌细胞化eLa)中的双光子共聚焦巧光成像效果 图，（a)(d)(g)分别表示激发光为720nm时0、2、5mM甲醒浓度解化下细胞的双光子共聚焦巧 光成像效果图；（b) (e)化)分别表示0、2、5mM甲醒浓度解化下细胞的细胞明场效果图；（C) (f)(i)分别表示(a)和(b)、（d)和(e)、（g)和化)的叠加效果图。 (五)
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0032] 参照文献（J.Fang, J Am 化em Soc ,2015,137,757-769，S.-K.化ang,Dyes and Pigments)的合成方法，按照合成路线分别合成结构式(2 )、（ 3)和(4)的中间产物。
[003；
[0034]实施例1探针(I)的合成
[00巧]在50mL的圆底烧瓶中，加入148mg化合物4(0.5mmo 1)溶于5mL甲醇中，冰浴至(TC， 加入0.72mL氨甲醇溶液(7mo 1 /L Smmo 1)，(TC下反应半小时，随后加入168mg丙締基棚酸邻 二叔醇醋（Immol)。反应转至室溫且过夜，混合液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱 分离（W体积比20:1的二氯甲烧：甲醇混合液洗脱），得到产物118mg，产率70%。核磁氨谱见 图1，核磁碳谱见图2。
[0036] iHMffi(500MHz，d6-DMS0)S:8.43(d，J = 7.8，lH)，8.25(d，J = 7.0，lH)，8.03(s, lH),7.35(t J = 7.6,lH),5.72(ddt J=13.8,10.1,6.8,lH),5.06(dd J = 25.4,13.6,2H), 4.50-4.32(m,lH),4.09-3.94(m,2H),2.88-2.75(m,lH),2.74-2.63(m,lH),1.64-1.49(m, 2H)，1.39-1.26(m，2H)，0.92(t，J=7.4,3H)〇Uc 醒R(126MHz，d6-DMS0)S:175.4，164.2， 162.7,134.0,130.9,130.2,127.4,121.4,120.8,118.1,98.5,52.5,38.6,36.4,30.1, 20.0，13.9.ESI calcd.for C20肥202N3(M+H)339.2，found 339.2。
[0037] 实施例2探针(I化抑为7.4条件下加入OmM和5mM甲醒浓度的紫外吸收光谱测定
[0038] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到39化L憐酸缓冲液（IOmM抑=7.4)，分别加入化L超纯水和化L、500ml甲醒 水溶液，37°C下反应3小时后，测定两个混合液的紫外吸收光谱，结果见图3。
[0039] 实验证明，糞酷亚胺类染料的3位上推-拉电子的能力的不同能够影响化合物的吸 收光谱，由于醒基的拉电子能力比较强，所W探针（I)与甲醒反应后的产物的吸收光谱有个 蓝移的过程，最大吸收波长从440nm降到了 370nm。
[0040] 实施例3探针（I)在pH为7.4激发波长为450nm条件下加入不同当量甲醒浓度下的 巧光效果检测。
[0041] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到39化L憐酸缓冲液（1 OmM抑=7.4)，分别加入化L不同浓度甲醒水溶液(最 终甲醒在水中的浓度分别为OmM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM、5mM)，37°C下反应3小时后，测定 其巧光值。激发波长为450nm，发射波长为480-740nm，巧光谱图见图4。
[0042] 实验证明，在增加甲醒当量的情况下，由于醒基的拉电子能力比较强，在激发波长 为450nm时，探针（I)与甲醒反应后的产物的发射光谱有个蓝移的过程，最大发射波长从 550nm降到了 520nm。
[0043] 实施例4探针（I)在pH为7.4激发波长为350nm条件下加入不同当量甲醒浓度下的 巧光效果检测。
[0044] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到394化憐酸缓冲液（IOmM抑=7.4)，分别加入化L不同浓度的甲醒水溶液 (最终甲醒在水中浓度分别为〇1111、〇.251111、0.5111]\1、1111]\1、21111、51111)，37°(：下反应3小时后，测定 其巧光值。激发波长为350nm，发射波长为440-740nm，巧光谱图见图5。
[0045] 实验证明，在激发波长为350nm的条件下，能够观察到随着甲醒浓度的提高，巧光 强度也能随之增大，检测限为如M。
[0046] 实施例5探针（I)在pH为7.4条件下加入100倍当量甲醒浓度的时间与巧光效果的 关系检测
[0047] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到39化L憐酸缓冲液（IOmM抑=7.4)，加入化L甲醒水溶液(最终甲醒在水中 的浓度为〇.5mM)，37°C下反应，在不同时间点（分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、9、23、24、 25h)测定其巧光值。激发波长为350nm，发射波长为510nm，巧光谱图见图6。
[0048] 实验证明，随着时间的流逝，巧光强度也能随之增强，符合探针检测甲醒的效果。
[0049] 实施例6探针(I)在抑为7.4条件下的选择性实验
[0050] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到39化L憐酸缓冲液（1 OmM抑=7.4)，分别加入化L甲醒水溶液(最终甲醒在 水中的浓度均为1mmol/L)和生物相关活性小分子水溶液化醒、丙酬醒、4-甲基苯甲醒、4- 硝基苯甲醒、苯甲醒、双氧水、谷脫甘肤、半脫氨酸、高半脫氨酸、丙酬酸钢、葡萄糖，最终浓 度均为lmmol/L)，37°C下反应3小时，测定其巧光值。激发波长为350nm，发射波长为440- 740nm，巧光谱图见图7。
[0051] 实验证明，探针(I)的抗干扰能力十分好，即对甲醒的专一性比较好。
[0052] 实施例7探针(I)在不同pH值下的检测性能实验
[0053] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取化L加入到39化L不同抑值的巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液(抑分别为3.4、4、4.6、5.2、 5.8、6.4、7、7.4、8)，分别加入化1不同浓度的甲醒水溶液(最终甲醒在水中的浓度分别为0 和lmmol/L)，37°C下反应3小时，在不同抑值条件下测定其巧光值。激发波长为350nm，发射 波长为510nm，巧光谱图见图8。
[0054] 实验证明，在抑中性或偏碱性时，抑的变化对探针（I)的影响不大，即探针（I)能够 在中性的生物体内检测甲醒的浓度。
[0055] 实施例8探针(I)和化合物4的密度泛函数计算
[0056] 利用高斯09软件计算探针(I)和化合物4的密度泛函数，结果见图9。
[0057] 实验证明，通过高斯09计算，进一步证明了探针与甲醒反应后产物的巧光最大发 射波长是蓝移的。
[0058] 实施例9探针(I)在抑为7.4的条件下与甲醒反应的中间产物、终产物效果分析
[0059] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为ImM的探针母液，用移液 枪吸取80化加入到31化L憐酸缓冲液（IOmM pH=7.4)，随后加入化L甲醒水溶液(最终甲醒 在水中的浓度为lmmol/L)37°C下反应，分别在0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、她时取样，然后利 用高效液相色谱分析。高效液相谱图见图10。
[0060] 高效液相色谱分析条件为:利用C18柱，洗脱条件为从100%乙腊梯度到100%水， 每次液相时间均为15分钟。
[0061] 实验证明，我们描述的探针（I)与甲醒反应的机理是正确的。探针（I)与甲醒先生 成中间产物1、2,然后经过2-氮杂-柯普重排W及水解生成最终物质4。
[0062] 实施例10探针(I)在子宫颈癌细胞化eLa)中的成像分析
[0063] 准确称取一定量的探针（I)，用二甲基亚讽配制成浓度为IOmM的探针母液。子宫颈 癌细胞化La接近1 X IO5个细胞培养接种在共聚焦盘中，由DMEM培养基在37°C、5%C02条件下 进行恒溫培养，培养24小时后，弃去培养基。将化L探针加入到199祉L新鲜DMEM培养基中，混 合均匀后加入共聚焦盘的细胞中，37°C下解化半小时，用新鲜DMBl培养基洗涂3次，然后用 不同甲醒浓度(最终甲醒浓度分别为0、l、5mM)解化3小时，新鲜DMEM培养基洗涂两次，最终 用Leica TCS SP5Multiphoton Confocal Scanning Microscope进行双光子成像，激发波 长为720nm，发射波长为420-475nm。图11为细胞双光子共聚焦巧光成像效果图。
[0064]实验证明，在甲醒浓度提高的情况下，我们能够看到细胞中的巧光信号也在变强。 说明我们的物质能够检测细胞内的甲醒。
【主权项】
1. 一种式(I)所示双光子甲醛荧光探针，2. -种权利要求1所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为:将式 (4)所示化合物溶于甲醇中，冰浴至0 °C，加入7mo 1 /L氨甲醇水溶液，0 °C下反应半小时，随后 加入丙烯基硼酸邻二叔醇酯，室温反应过夜，反应液分离纯化，获得所述双光子甲醛荧光探 针；3. 如权利要求2所述所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述式(4)所示 化合物与丙烯基硼酸邻二叔醇酯物质的量之比为1:2,所述氨甲醇溶液用量以氨物质的量 计，所述式(4)所示化合物与氨物质的量之比为1:10。4. 如权利要求2所述所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述甲醇体积 用量以式(4)所示化合物物质的量计为1 OmL/mmo 1。5. 如权利要求2所述所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述反应液分 离纯化方法为:反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离，以体积比20:1的二氯 甲烷甲醇混合液为洗脱剂，收集目标组分，干燥，获得所述双光子甲醛荧光探针。6. -种权利要求1所述双光子甲醛荧光探针在检测甲醛中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述甲醛为5ymol/L~5mmol/L甲醛水溶液。8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述甲醛为细胞内5ymol/L~5mmol/L甲醛。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述细胞为子宫颈癌细胞HeLa。10. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述甲醛检测限为5ymol/L。
【文档编号】G01N21/64GK105924394SQ201610340384
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】朱勍, 谢振达
【申请人】浙江工业大学