具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物及制备与用图
【专利摘要】具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物及制备与用途，涉及一种大环内酯新化合物。所述大环内酯化合物的化学名为7,13?cyclo?macrolactin A，分子式为：C24H32O4。制备方法：取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B5菌种接种至液体培养基中培养后，离心除去菌体，得发酵液；将发酵液上大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱液，浓缩液萃取后得萃取物；将萃取物上硅胶柱层析，洗脱，收集含大环内酯化合物的流份，再上反相碳?18柱层析，洗脱，收集含大环内酯化合物的流份，得化合物粗品，高效液相制备，收集主峰，干燥后即得大环内酯化合物。所述大环内酯化合物可在制备抗茶叶致病真菌生物农药中应用。CCTCC NO：M 201238420120927
【专利说明】
具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物及制备与用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种大环内醋新化合物，尤其是设及具有抗茶叶致病真菌活性的大环 内醋化合物及制备与用途。
【背景技术】
[0002] 海洋环境的独特性为海洋微生物产生新的活性物质提供了必要的条件和潜在的 可能，因此海洋微生物是农用或医用药物开发的潜在资源。随着人们对海洋资源的重视，从 海洋资源中筛选抗植物病原真菌的微生物也日渐引起植物病理学家和微生物学家的重视， 并逐渐成为生物防治的热点。在所有海洋微生物研究中，对海洋细菌产生的生物活性物质 的研究占主要地位。海洋细菌由于长期生活在海洋中，比陆栖细菌更偏爱含电解质多的环 境。海洋特殊的地理环境和资源环境孕育了许多有特性的海洋细菌，在它们的代谢产物中 潜藏着许多新颖、特殊的活性物质。
[0003] 枯草芽抱杆菌(B. SUbtiliS)是细菌芽抱杆菌中的一种，在自然界分布非常广泛， 不会产生毒性物质，几乎对人畜无任何毒害作用，广受人们关注。其菌体细胞形态为杆状， 具有内生的抱子，在生命活动过程中，可W产生多种抗菌素和一些相应的酶等，因而其抗菌 活性较强，抑制病原菌种类较多。分离出具有相关抗菌活性的菌株并对其进行大规模发酵 培养，再提纯胞外代谢物，是发现和生产抗菌剂的重要途径。
[0004] 为获得新型、高效的海洋源农用抗生素，或为新型微生物农药的开发提供先导化 合物，
【申请人】从已经建立好的海洋沉积物微生物菌种资源库中挑选出对两种茶叶病原菌 (茶叶轮斑病菌Pestalotiopsis theae和茶叶炭痘病菌Colletotrichum 邑1〇6039〇1'；[01(1日3)具有稳定括抗作用的菌株8日(3；[11113 311131：；[113 65，确定其括抗谱，对其 产生的抑菌物质进行分离、纯化并加 W鉴定。由此得到了一个新化合物，该化合物能抑制上 述两种茶叶致病真菌。发明人还提供了该化合物的制备方法。
[0005] 中国专利CN101792474A公开一种新型阿扎霉素 FUzalomycin F)类大环内醋化合 物及其制备方法与应用。提供一种结构独特的具有广谱抗酵母类真菌、抗香蕉枯萎病和抗 根结线虫活性的新化合物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物及其制备方 法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的 应用。
[000引所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的化学名为7，13-07(：10- macrolactin A，分子式为：C2边3204,结构式为：
[0009]
[0010] 所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的制备方法，包括W下步骤：
[0011] 1)取枯草芽抱杆菌Bacillus SUbtilis B5菌种接种至液体培养基中培养后，离屯、 除去菌体，得发酵液;所述枯草芽抱杆菌Bacillus SUbtiliS B5已于2012年09月27日保藏 于中国典型培养物保藏中屯、，地址：中国武汉武汉大学，邮编:430072,保藏中屯、保藏编号为 CCTCC NO：M 2012384O
[0012] 在步骤1)中，所述液体培养基的组成可为:0.5%可溶性淀粉，1%酵母提取物，1% K2HPO4，0.5%NaN〇3，抑6.8~7.0;所述培养的条件可为200巧m，37°C培养36h。
[0013] 2)将步骤1)所得发酵液上大孔树脂柱，分别用水和95%乙醇洗脱，收集95%乙醇 洗脱液，回收乙醇，浓缩液萃取后，回收溶剂，得萃取物；
[0014] 在步骤2)中，所述萃取可采用乙酸乙醋萃取。
[001引3)将步骤2)所制得的萃取物上硅胶柱层析，W氯仿-甲醇梯度洗脱，收集含所述具 有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的流份；
[0016] 4)将步骤3)所制得的流份上反相碳-18柱层析，W甲醇-水梯度洗脱，收集含所述 具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的流份，得所述具有抗茶叶致病真菌活性的大 环内醋化合物粗品；
[0017] 5)将步骤4)所制得的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物粗品进行高效 液相制备，收集主峰，回收溶剂，干燥后即得所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合 物。
[0018] 所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物可在制备抗茶叶致病真菌生物 农药中应用。
[0019] 本发明提供的化合物具有抗茶叶致病真菌的活性，为茶叶真菌病的防治提供了一 种新的选择。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例制备的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的氨谱。
[0021] 图2为本发明实施例制备的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的碳谱。
[0022] 图3为本发明实施例制备的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物抑制茶叶 炭痘病菌CoIletotrichum 邑Ioeosporioides结果。
[0023] 图4为本发明实施例制备的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物抑制茶叶 轮斑病菌F*estalotiopsis theae结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面实施例将结合附图对本发明做进一步的描述。
[0025] 所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内醋化合物的化学名为7, 13-cyclo- macroIactin A,分子式为：C24出2〇4,结构式为：
[0026；
[0027]实施例本发明化合物的制备
[002引 a、发酵:取菌种400mL(1 %膜蛋白腺，0.5 %酵母提取物，1 %氯化钢，pH 7.4)接种 至40L的液体培养基中（0.5 %可溶性淀粉，1 %酵母提取物，1 % K2HPO4，0.5 %化N03，抑6.8 ~7.0)，200巧111，37°(：培养3611。离屯、除去菌体，得发酵液401^;
[0029] b、提取:发酵液上大孔树脂柱(柱体积:8L)，分别用3倍柱体积的水和95%乙醇洗 脱，收集95%乙醇洗脱液，回收乙醇，得到浓缩液1L。浓缩液用乙酸乙醋萃取(3次，每次1L)， 减压回收溶剂，得萃取物17.9g;
[0030] C、硅胶柱层析:将步骤b所制得的萃取物进行硅胶柱（柱体积：1.2化)分离，W氯 仿-甲醇50:1一30:1一20:1一 10:1一5:1一3:1的梯度进行洗脱，每个梯度洗脱2个柱体积， 分段收集洗脱液，薄层层析检测，收集含式I的流分0.32g;
[0031] d、反相碳-18柱层析:将步骤C所制得的流分上反相碳-18柱层析(柱体积：IOOmU， W 甲醇-水 20 % 一30 % 一 40 % 一50 % 一 60 % 一70 % 一 80 % 一 90 % 一 100 % 梯度洗脱，每个梯 度洗脱2个柱体积，分段收集洗脱液，分析液相检测，收集含式I的流份，得式I化合物粗品 58mg;
[0032] e、精制:将步骤d所制得的粗品进行高效液相制备(Cosmosil C18 column，20mmX 250mm)，W45 %乙腊-水等度洗脱50min，收集式I化合物色谱峰，回收溶剂，得到式I化合物 I. 5mg。高效液相检测纯度为97.5%。
[0033] 式I化合物的理化测定数据如下：黄色粉末，m. P . 96°C ; [a ] 25D-W. 0° (C = 1.0， MeOH);ESI-MS:m/z 385(M+H) +，407[M+化]+ ;UV MeOH max nmQog O(MeOH) :233(3.88); IRmax K 化 3465，2973，2927，1664，1450cm-i;氨谱（DMS0-d6，600MHz ):7.J = II. 7Hz，H-4)，6.69(lH，t，J=11.4Hz，H-3)，6.17(lH，m，H-5)，6.06(lH，m，H-17)，5.97(lH， m，H-18)，5.8iaH，m，H-ll)，5.71(lH，d J=10.5Hz，H-10)，5.67(lH，m，H-19)，5.59aH，d，J = 11.4Hz，H-2)，5.54(lH，m，H-9)，5.48(2H，m，H-8，16)，4.96aH，m，H-23)，4.56(lH，br.s， H-7),3.93(lH,br.s,H-15),2.91(2H,m,H-6),[2.13(lH,m)&2.00(lH,m),H-20],[1.98(IH, m)&1.87(lH,m),H-12],[1.68(lH,m)&1.61(lH,m),H-14]a.59(2H,m,H-22)a.44(2H,m,H- 21)，1.22(3H，d，J = 6.2Hz，H-24)，如附图l所示；碳谱（DMS0-d6，125MHz):166.0( = C0)， 143.4(C-3)，142.1(C-5)，135.3(C-16)，133.9(C-19)，130.6(C-8)，130.3(C-18)，130.1(C- 17),129.7(C-9),128.4(C-10),128.1(C-4),125.2(C-ll),117.8(C-2),72.2(C-7),70.8 (C-23),69.4(C-15),65.0(C-13),44.1(C-14),36.0(C-6),35.3(C-22),32.1(C-20),31.3 (C-12)，25.4(C-21)，20.4(C-24)，如图 2 所示。
[0034] 实验例本化合物对茶叶致病真菌的抑制作用
[0035] 本化合物对茶叶致病真菌茶叶轮斑病菌化Stalotiopsis theae和茶叶炭痘病菌 Colletotrichum gloeosporioides的抑制作用测定采用纸片抑制法，最低抑菌浓度MIC (minimum inhibi to巧concen化at ion)采用纸片稀释法。纸片抑制法在PDA平板中央接种 直径6mm的指示病原菌菌饼，距离指示菌2cm处放置滤纸片。将25yg化合物加到无菌滤纸片 上，接种后的平板在28°C培养7天，DMSO作为空白对照。抑菌结果见图3和4。
[0036] 化合物通过二倍稀释法用DMSO配制成3.125到10化g/化的工作浓度。在PDA平板中 央接种直径6mm的指示病原菌菌饼，距离指示菌2cm处放置滤纸片。在滤纸片上加入20iU不 同浓度的化合物。接种后的平板在28 °C培养7天。DMSO作为空白对照。最低抑菌浓度MIC为能 抑制可见菌体生长的最低化合物浓度。实验重复=次，结果表明，本化合物对茶叶轮斑病菌 和茶叶炭痘病菌的MIC值为50化g/disc。
【主权项】
1. 具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物，其特征在于其化学名为7，13-(^(：1〇-macrolactin A，分子式为:C24H32O4,结构式为：2. 如权利要求1所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的制备方法，其特征 在于包括以下步骤： 1) 取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B5菌种接种至液体培养基中培养后，离心除去 菌体，得发酵液;所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B5已于2012年09月27日保藏于中 国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为 CCTCC NO：Μ 2012384〇 2) 将步骤1)所得发酵液上大孔树脂柱，分别用水和95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱 液，回收乙醇，浓缩液萃取后，回收溶剂，得萃取物； 3) 将步骤2)所制得的萃取物上硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集含所述具有抗 茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的流份； 4) 将步骤3)所制得的流份上反相碳-18柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，收集含所述具有 抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的流份，得所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内 酯化合物粗品； 5) 将步骤4)所制得的具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物粗品进行高效液相 制备，收集主峰，回收溶剂，干燥后即得所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物。3. 如权利要求2所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的制备方法，其特征 在于在步骤1)中，所述液体培养基的组成为:0.5%可溶性淀粉，1 %酵母提取物，1 %Κ2ΗΡ〇4， 0.5%NaN03，pH 6.8~7.0。4. 如权利要求2所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的制备方法，其特征 在于在步骤1)中，所述培养的条件为200rpm，37°C培养36h。5. 如权利要求2所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物的制备方法，其特征 在于在步骤2)中，所述萃取是采用乙酸乙酯萃取。6. 如权利要求1所述具有抗茶叶致病真菌活性的大环内酯化合物在制备抗茶叶致病真 菌生物农药中应用。
【文档编号】A01P3/00GK105924451SQ201610268176
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】汤熙翔, 丘鹰昆, 晏霞, 易志伟, 吴振
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会