一种水溶性未变性胶原及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种水溶性未变性胶原及其制备方法，包括：首先由绝干质量比为1/20?1/2的丁二酰亚胺与聚羧酸制得聚羧酸?NHS酯；再由绝干质量比为1/20?1/2的聚羧酸?NHS酯与天然胶原反应，制备溶性未变性胶原。本发明能获得同时具有良好流动性和高热稳定性的水溶性未变性胶原。
【专利说明】
一种水溶性未变性胶原及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种水溶性未变性胶原，以及水溶性未变性胶原制备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，约占体内蛋白质总量的30 %。从动 物组织中经提取、分离与纯化可制备出天然胶原。天然胶原保持着完整的三股螺旋结构，因 而赋予胶原许多优良性能，例如良好的力学性能、较低的抗原性和优异的生物相容性，能够 促进血小板凝结，还有优良的保湿性能和促进表皮细胞生长繁殖的优异性能等。作为一种 性能优良的天然高分子材料，胶原在烧伤创伤治疗、美容、矫形、组织修复等方面得到了广 泛应用。
[0003] 目前制备未变性胶原的主要方法是酸酶结合法，该法得到的胶原具有接近中性pH 的等电点，因此只有在酸性条件下才能溶解并保持溶液态。若将胶原置于中性水溶液中，将 发生等电点沉淀。故酸酶结合法提取得到的胶原虽然是亲水的，但并不溶于水。然而，在胶 原应用的许多场合下，无法回避中性环境中使用的问题。即要求溶液态胶原在中性条件下 以溶液态稳定存在，同时要求胶原分子的天然三股螺旋结构不被改变或破坏，以保留良好 的生物活性。
[0004] 为解决这些问题，中国专利申请"水溶性未变性天然胶原的制备方法"（CN 1597742A)提出了改善胶原水溶性的方法，即利用酰化剂庚二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻甲二 苯酸酐将胶原的部分氨基封闭，增加侧链的羧基含量，促使其等电点向较低的方向移动，从 而增强其在中性条件下的溶解性能。原理上讲，这属于利用小分子酸酐对胶原侧链实施酰 化改性。
[0005] 中国专利申请"胶原凝胶"（CN 1264390A)利用碳化二亚胺将聚阴离子与胶原进行 反应形成凝胶。原理上讲，这属于利用大量的碳化二亚胺将两种成分进行交联，使体系丧失 流动性从而得到凝胶。该专利在水溶液中使用碳化二亚胺，极易发生水解反应而形成尿素 衍生物，使其反应活性极低，需要使用大量的碳化二亚胺才能使体系凝胶，成本很高;其次， 凝胶属于稳定的三维网络结构，其内部所残留的反应物等杂质难以清除;再者，该法制得的 胶原只能以凝胶态存在，并无溶液态的流动性，无法用于需要胶原具备良好流动性的场合。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种水溶性未变性胶原。
[0007] 本发明是这样实现的：一种水溶性未变性胶原制备方法，包括以下内容：
[0008] (1)制备聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯:在10-50mL二甲基亚砜(DMS0)中，加入聚羧 酸，搅拌溶解;加入丁二酰亚胺(NHS)，搅拌溶解后，再加入碳化二亚胺(EDC)，搅拌，反应9-18h;然后加入无水乙醇或丙酮析出沉淀，将沉淀分别用无水乙醇、正己烷洗涤，然后真空干 燥，即得聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯；其中，丁二酰亚胺与聚羧酸的重量比为1/20~1/2; 碳化二亚胺与丁二酰亚胺的重量比为1/3~1/1;
[0009] (2)制备溶性未变性胶原:将天然胶原溶解于pH 2.5-4.5的盐酸溶液中，得到浓度 为1-lOmg/mL的胶原溶液;将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，获得浓度 为10-100mg/mL的聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液;然后一直维持温度在4-10°C，将聚羧 酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液加入胶原溶液，并搅拌反应12-24h，再用去离子水透析l-3d; 冷冻干燥，即得水溶性未变性胶原;其中，聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯与天然胶原的重量 比为1/20~1/2。
[0010] 进一步地，所述步骤(2)中，温度为4-8°C。
[0011] 本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种水溶性未变性胶原制备方法。
[0012] 本发明是这样实现的：一种水溶性未变性胶原，包括以下原料:重量比为1/20~1/ 2的聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯和天然胶原；
[0013] 所述聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯由以下成分酯化得到：重量比为1/20~1/2的丁 二酰亚胺和聚羧酸；
[0014] 所述聚羧酸为聚谷氨酸或聚苹果酸。
[0015] 进一步地，所述聚谷氨酸分子量为20000~1000000。
[0016] 进一步地，所述聚苹果酸分子量2000~4000。
[0017] 本发明的优点在于：制得的水溶性未变性胶原同时具备良好流动性和高热稳定 性，并使胶原等电点显著下降从而赋予胶原中性条件下的水溶性。
【附图说明】
[0018] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0019] 图1是发明中溶性未变性胶原的差示扫描量热曲线图。
[0020] 图2是发明中溶性未变性胶原的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。
[0021]图3是发明中溶性未变性胶原的等电点测定曲线图。
【具体实施方式】
[0022] 一种水溶性未变性胶原，包括以下原料:重量比为1/20~1/2的聚羧酸-N-羟基丁 二酰亚胺酯和天然胶原；
[0023]所述聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯由以下成分酯化得到：重量比为1/20~1/2的丁 二酰亚胺和聚羧酸;所述聚羧酸为聚谷氨酸或聚苹果酸。所述聚谷氨酸分子量为20000~ 1000000。所述聚苹果酸分子量2000~4000。所述聚谷氨酸的酯化度<20 %。所述天然胶原 的氨基取代度<18 %。
[0024]所述水溶性未变性胶原制备方法，包括以下内容：
[0025] (1)制备聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯（聚羧酸-NHS酯）：在10-50mL二甲基亚砜 (DMS0)中，加入聚羧酸500-2000mg，搅拌，溶解完全;加入丁二酰亚胺(NHS)，搅拌溶解后，再 加入碳化二亚胺(EDC)，搅拌，反应9-18h;然后加入无水乙醇或丙酮析出沉淀聚羧酸-N-羟 基丁二酰亚胺酯，而大部分的碳化二亚胺留在溶剂中不会析出，将沉淀分别用无水乙醇、正 己烷洗涤，除去产物中残留的少量H)C，然后真空干燥沉淀，即得聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺 酯;其中，丁二酰亚胺与聚羧酸的重量比为1/20~1/2,以避免聚羧酸的酯化度过大，造成改 性天然胶原时胶原发生凝胶化，碳化二亚胺与丁二酰亚胺的重量比为1/3~1/1;
[0026] (2)制备水溶性未变性胶原:将天然胶原溶解于pH 2.5-4.5的盐酸溶液中，得到浓 度为1-lOmg/mL的胶原溶液;将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，获得浓 度为lO-lOOmg/mL的聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液;然后一直维持温度在4-10°C，优选 为4-8°C，将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液加入胶原溶液，并搅拌反应12-24h，再用去离 子水透析l-3d;冷冻干燥，即得溶性未变性胶原;其中，聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯与天然 胶原的重量比为1/20~1/2。将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯干重与胶原干重的比例控制在 1/20-1/2，可以避免聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯与胶原过度反应生成凝胶;将反应的温度 控制在10°C以下，可以避免胶原发生热变性。反应后的体系必须经过透析处理，彻底除去生 成的NHS，使体系中不含任何残留杂质，使得到的溶性未变性胶原是完全没有毒性的。
[0027]其中，天然胶原为三条多肽链构成的，具有三股螺旋结构的天然未变性胶原大分 子，分子量约为30万。天然胶原与聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(聚羧酸-NHS酯）的反应式如 下，聚羧酸以聚谷氨酸大分子为例：
[0029]以上述反应式为例，聚谷氨酸的酯化度= aAa+b)*100%，为获得溶性未变性胶 原，聚谷氨酸的酯化度不应超过20%，天然胶原的氨基取代度=m/k*100%(k为一个胶原分 子上具有的氨基总数，对不同的胶原该值有所差别），为获得溶性未变性胶原，胶原的氨基 取代度不应超过18 % ; a+b = m+n =酯化前每个聚谷氨酸分子上所有羧基总数，取决于聚谷 氨酸的分子量。
[0030] 使用聚苹果酸时，聚苹果酸的酯化度不应超过20%;为获得溶性未变性胶原，胶原 的氨基取代度不应超过18%。
[0031] 实施例1
[0032] (1)将lOOOmg的聚苹果酸加入20mL的DMS0溶液中，搅拌，直至聚苹果酸完全溶解。 加入50mg的NHS，搅拌，再加入50mg的EDC，常温下反应18h，加入无水乙醇使产物析出。用无 水乙醇洗涤2次，正己烷洗涤1次后，真空干燥，得聚苹果酸-NHS酯。经测定，聚苹果酸-NHS酯 的酯化度为2.8%。
[0033] (2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中（pH 2.5)，得浓度为5mg/ml的胶原溶液;将聚苹 果酸-NHS酯溶解于DMS0中，浓度为100mg/mL;取胶原溶液20ml，加入聚苹果酸-NHS酯溶液 500yL(l/2)，搅拌，常温下反应18h;用去离子水透析2d，冷冻干燥后得到溶性未变性胶原。 经测定，溶性未变性胶原仍保留有天然结构，氨基取代度为6.1%，等电点为4.2,热变性温 度为 46.3 °C。
[0034] 实施例2
[0035] (1)将500mg的聚谷氨酸加入10mL的DMS0溶液中，搅拌，直至聚谷氨酸完全溶解;加 入100mg的NHS，搅拌，再加入33mg的EDC，常温下反应9h，加入无水乙醇使产物析出；用无水 乙醇洗涤2次，正己烷洗涤2次后，真空干燥，得聚谷氨酸-NHS酯。经测定，聚谷氨酸-NHS酯的 酯化度为5.3%。
[0036] (2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中（pH 3.0)，浓度为10mg/ml;聚谷氨酸-NHS酯溶 解于DMS0中，浓度为50mg/mL;取胶原溶液40ml，加入聚谷氨酸-NHS酯溶液1200yL(l/5)，搅 拌，常温下反应12h;用去离子水透析ld，冷冻干燥后得到溶性未变性胶原。经测定，溶性未 变性胶原仍保留有天然结构，氨基取代度为9.4%，等电点为3.6，热变性温度为47.2°C。 [0037] 实施例3
[0038] (1)将1200mg的聚谷氨酸加入30mL的DMS0溶液中，搅拌，直至聚苹果酸完全溶解； 加入300mg的NHS，搅拌，再加入200mg的EDC，常温下反应13.5h，加入丙酮使产物析出；用无 水乙醇洗涤3次，正己烷洗涤1次后，真空干燥，得聚谷氨酸-NHS酯。经测定，聚苹果酸-NHS酯 的酯化度为8.7%。
[0039] (2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中（pH 4.0)，浓度为2.5mg/ml;聚谷氨酸-NHS酯溶 解于DMS0中，浓度为25mg/mL;取胶原溶液100ml，加入聚谷氨酸-NHS酯溶液1000μLΧ?/10)， 搅拌，常温下反应20h;去离子水透析3d，冷冻干燥后得到溶性未变性胶原。经测定，溶性未 变性胶原仍保留有天然结构，氨基取代度为11.6%，等电点为3.7，热变性温度为47.8°C。
[0040] 实施例4
[00411 (1)将2000mg的聚谷氨酸加入50mL的DMS0溶液中，搅拌，直至聚谷氨酸完全溶解； 加入lOOOrng的NHS，搅拌，再加入800mg的EDC，常温下反应15h，加入丙酮使产物析出；用无水 乙醇洗涤3次，正己烷洗涤2次后，真空干燥，得聚谷氨酸-NHS酯。经测定，聚谷氨酸-NHS酯的 酯化度为15.3%。
[0042] (2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中（pH 4.5)，浓度为111^/1111;聚谷氨酸-册^酯溶解 于DMS0中，浓度为10mg/mL;取胶原溶液30ml，加入聚谷氨酸-NHS酯溶液150yL(l/20)，搅拌， 常温下反应24h。用去离子水透析3d，冷冻干燥后得到溶性未变性胶原。经测定，溶性未变性 胶原仍保留有天然结构，氨基取代度为14.7%，等电点为3.9,热变性温度为48.1°C。
[0043] 将实施例4制得的溶性未变性胶原分别进行差示扫描量热曲线、SDS-PAGE凝胶电 泳和等电点测定表征，与酸酶结合法提取的天然未变性牛皮酸溶胶原进行对比，具体如下：
[0044] 图1为胶原的差示扫描量热曲线图，标识A曲线为本发明的溶性未变性胶原，标识B 曲线为酸酶结合法提取的天然未变性牛皮酸溶胶原，从图1可见，天然未变性牛皮酸溶胶原 的变性温度为38.8°C，而本发明的溶性未变性胶原的变性温度提高至48.1°C，热稳定性明 显提尚。
[0045] 图2中，标识3曲线为本发明的溶性未变性胶原，标识2曲线为酸酶结合法提取的天 然未变性牛皮酸溶胶原，从图2可见，与天然未变性牛皮酸溶胶原一样，本发明的溶性未变 性胶原由α1，α2及β链组成，说明溶性未变性胶原仍保留有天然结构。此外，本发明的溶性未 变性胶原的高分子量部分(>β链)明显增多，说明部分胶原分子之间存在交联键。
[0046] 图3中，标识Α曲线为本发明的溶性未变性胶原，标识Β曲线为酸酶结合法提取的天 然未变性牛皮酸溶胶原，可见，天然未变性牛皮酸溶胶原的等电点约为6.95,而本发明的溶 性未变性胶原的等电点下降至约3.92。等电点的下降，可以明显改善胶原在中性条件下的 水溶性。
[0047]本发明首先制备聚羧酸-NHS酯，再与天然胶原反应，使天然胶原侧链的氨基与聚 羧酸活性酯上的NHS酯基进行反应形成共价交联键，使多个胶原分子交联在一起。一方面， 共价交联作用可提高胶原的热稳定性;另一方面，交联反应封闭了胶原的氨基，而接上去的 聚羧酸又可为胶原增加大量羧基，从而促使胶原等电点显著下降，赋予胶原中性条件下的 水溶性。
[0048]本发明将丁二酰亚胺与聚羧酸的绝干质量比控制在1/20-1/2;在溶性未变性胶原 的制备中，聚羧酸-NHS酯与胶原的绝干质量比控制在为1/20-1/2,从而能获得同时具有良 好流动性和高热稳定性的溶性未变性胶原。
[0049]综上所述，本发明具有以下优点：
[0050] 1、本发明能对天然胶原同时实现酰化改性与交联改性，避免了传统改性方法使溶 性未变性胶原热稳定性降低的弊端，而且在改善水溶性(使胶原等电点下降）的同时明显提 高胶原热稳定性(使胶原热变性温度提高），使胶原产品在加工、储存、运输、销售等环境下 不易发生变性；
[0051] 2、本发明提供了一种具有良好流动性的溶性未变性胶原，可满足胶原需具备良好 流动性的各类化妆品、美容注射材料及生物医学材料的要求；
[0052] 3、本发明产品最终应用形式为水溶性溶液态胶原，而非固态或凝胶态胶原，因而 可用透析的方法将反应生成的杂质彻底除去，只留下纯净的溶性未变性胶原；
[0053] 4、接枝在胶原分子上的聚羧酸本身为一种生物相容性好的大分子，完全适用于化 妆品与生物医学材料领域。
【主权项】
1. 一种水溶性未变性胶原制备方法，其特征在于:包括以下内容： (1) 制备聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯:在10-50mL二甲基亚砜中，加入聚羧酸，搅拌，溶 解完全;加入丁二酰亚胺，搅拌溶解后，再加入碳化二亚胺，搅拌，反应9-18h;然后加入无水 乙醇或丙酮析出沉淀，将沉淀分别用无水乙醇、正己烷洗涤，然后真空干燥，即得聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯；其中，丁二酰亚胺与聚羧酸的重量比为1/20~1/2;碳化二亚胺与丁二 酰亚胺的重量比为1/3~1/1; (2) 制备溶性未变性胶原:将天然胶原溶解于pH 2.5-4.5的盐酸溶液中，得到浓度为1-10mg/mL的胶原溶液;将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，获得浓度为10-100mg/mL的聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液;然后一直维持温度在4-10°C，将聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液加入胶原溶液，并搅拌反应12-24h，再用去离子水透析l-3d;冷冻干 燥，即得溶性未变性胶原;其中，聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯与天然胶原的重量比为1/20 ~1/2 〇2. 如权利要求1所述的水溶性未变性胶原制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，温度 为 4-8°C。3. -种水溶性未变性胶原，其特征在于:包括以下原料:重量比为1/20~1/2的聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯和天然胶原； 所述聚羧酸-N-羟基丁二酰亚胺酯由以下成分酯化得到：重量比为1/20~1/2的丁二酰 亚胺和聚羧酸； 所述聚羧酸为聚谷氨酸或聚苹果酸。4. 如权利要求3所述的一种水溶性未变性胶原，其特征在于：所述聚谷氨酸分子量为 20000~1000000。5. 如权利要求3所述的一种水溶性未变性胶原，其特征在于:所述聚苹果酸分子量2000 ~4000〇
【文档编号】C08H1/00GK105949477SQ201610348502
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】张敏, 杨俊晖, 陈礼辉, 黄六莲
【申请人】福建农林大学