一种两性羧酸双核铜金属配位聚合物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种两性羧酸双核铜金属配位聚合物，该两性羧酸双核铜金属配位聚合物是重复结构单元为下式(Ⅰ)所示的铜配位聚合物。所述的铜配位聚合物用1?(3,5?二羧酸苄基)?4,4’?溴化联吡啶与铜盐反应合成。本发明所述的双核铜金属配位聚合物具有良好的水溶性，可检测胃癌患者外周血中高表达的五种miRNA，
【专利说明】
一种两性羧酸双核铜金属配位聚合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化学领域，具体涉及金属配位聚合物。
【背景技术】
[0002] microRNA(miRNA)是一类由18~25个核苷酸组成，并且参与基因调控的内源性RNA 分子。miRNA在诸多生物过程(如细胞分化、增值、凋亡以及疾病过程等）中起重要的角色性 作用。不同发育阶段、不同组织中miRNA的表达水平有着显著差异。近年来有科学家研究发 现，很多疾病的发生与miRNA的表达水平息息相关，如2015年Shu&Liu等发现胃癌患者外周 血中有5种miRNA(miR-185，miR-20a，miR-210，miR25和miR-92b)表达显著上调，并推断此5 种miRNA很可能作为潜在的胃癌诊断的生物标记物。因此，miRNA作为对疾病预测及诊断的 新型生物标记物受到了科研工作者广泛的关注，对不同物种中miRNA表达进行识别对预防 和诊断相关疾病具有重要意义。
[0003] 识别miRNA最常见的方法有特异性强的northern blot(诺瑟杂交法），高效快速的 microarrays(基因芯片），灵敏度高的qRT_PCR(实时荧光定量PCR)，但这些方法得需经过逆 转录过程来识别，过程复杂，成本高且耗时。近年来所报道RCA(滚环扩增法），LAMP(环介导 等温扩增法)及LCR(连接酶链式反应)等方法虽一定程度上提高了识别灵敏度，但仍未克服 耗时且尚成本等缺点。
[0004] Cu(II)作为一种高效的荧光淬灭剂，在荧光光谱学原理作用下，基于Cu(II)构筑 的金属有机骨架常被应用于焚光物质的淬灭实验中，但大部分基于Cu( II)的金属有机骨架 具有水水溶性差等缺点，限制了这类材料在miRNA检测方面的研究。
[0005] 众所周知，季铵盐官能团因其较大的极性，使得此类化合物具有较好的水溶性。将 季铵盐官能团引入到金属配位聚合物中能够显著的增强此类金属配位聚合物的水溶性。将 季铵盐基团和羧酸基团同时引入构筑两性羧酸配体，不仅能发挥羧酸较强的配位能力和多 样的配位模式的优势，而且也能有效的克服羧酸金属配位聚合物溶解性较差的缺陷。目前， 含有羧酸和季铵盐基团的配体研究较少，而关于此类金属配位聚合物作为荧光探针识别 miRNA的研究更是鲜见文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种两性羧酸双核铜金属配位聚合物，该金属 配位聚合物具有良好的水溶性，可检测胃癌患者外周血中高表达的miRNA。
[0007] 本发明解决上述问题的技术方案是：
[0008] -种两性羧酸双核铜金属配位聚合物，该两性羧酸铜金属配位聚合物是重复结构 单元为下式（I)所示的的铜配位聚合物，该铜配位聚合物的红外光谱数据(KBr)为：V3439 (s)，1629(m)，1566(w)，1404(s)，1154(s), 1072(8),954(111),860(8),546(8)01^,晶胞参数 分别为:β:=1.6..512(3)Α，办=18.3..6:0(.4).Α，.￡Γ=19.38.6(4)Α，α=90。，β=9〇。，γ =90。，
[0010] 本本发明所述的两性羧酸双核铜金属配位聚合物的重复结构单元的分子式为 [Cu2(dcbb)2(0H) 2(H20)6] · 2H20,式中的dcbb为 1-(3,5-二羧酸苄基)-4,4'_联吡啶，上述双 核铜金属配位聚合物在常温下为蓝色块状晶体，其重复结构单元中含有两个Cu(II)离子， 两个Cu离子和两个1-( 3，5-二羧酸苄基)-4，4 联吡啶配体分子单元组成的环状结构，每个 Cu2+分别通过与来自一个配体羧基上的氧进行单齿配位和另一个配体吡啶环上的N原子进 行配位，还通过与三个水分子中的氧进行配位形成的五配位的三角双锥配体构型。
[0011] 本发明所述的两性羧酸铜金属配位聚合物采用本领域常用的制备方法，如，将1-(3,5_二羧酸苄基)-4,4'_溴化联吡啶与铜盐反应得到。本发明人推荐的方法，由以下步骤 组成：
[0012] (1)将1-(3，5-二羧酸苄基)-4，4 溴化联吡啶溶解在体积浓度为99%的甲醇中， 调整溶液pH为6.0~7.0，得到配体溶液；
[0013] (2)采用乙醚扩散法，将乙醚慢慢扩散入配体溶液中，静置三天后溶液析出化学式 为[Na(dcbb) (H2O)]的中间产物A，所述化学式[Na(dcbb) (H2O)]中dcbb为1_(3，5_二羧酸节 基)-4，4 ' -联P比啶；
[0014] (3)将所述的中间产物A溶于水溶液中，加入1/2中间产物A摩尔量的硝酸铜，室温 静置三天后得到化学式为[Cu(dcbb) 2 (H20) ] [Cu (dcbb)2 ] 2的中间产物B;
[0015] (4)将中间产物B溶于水中，加入含5-氟尿嘧啶的DMF溶液，升温至100°C反应48~ 96h，然后降温至室温析出蓝色晶体，收集晶体并用乙醚洗净并真空干燥即得到所述的两性 羧酸双核铜金属配位聚合物。
[0016] 本发明的所述的两性羧酸铜金属配位聚合物具有检测胃癌患者外周血中5种高表 达microRNA的性能。检测原理如下:化合物首先通过静电、JT-JT堆积和(或)氢键作用与P-DNA (带有荧光标记物质的miRNA的逆转录DNA)结合形成复合体系并产生荧光淬灭现象。在加入 miRNA后，miRNA与P-DNA通过碱基互补配对的作用形成结构稳定的杂化双链DNA/RNA。由于 杂化双链变大的横截面和螺旋骨架的保护作用，使得杂化双链与化合物的相互作用减弱， 并与化合物分离开来，体系的荧光也随着PET机制消失而复苏，实现了对miRNA的检测。
[0017] 本发明的所述的双核铜金属配位聚合物可以用于检测胃癌患者外周血中5种高表 达microRNA，具体检测方法包括以下步骤：
[0018] (1)化合物结合P-DNA的荧光淬灭性能
[0019] 用100nM Tris-HCl缓冲溶液将100μΜ的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将 化合物溶解在l〇〇nM Tris-HCl缓冲溶液配成500μΜ(含50nMP-DNA)的溶液为滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度 的变化(λ ΘΧ = 480ηπι)直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率Qe用公式1.1计算。
[0020] Qe=(1-Fm/Fo) X100% (1.1)
[0021] 其中Fo为P-DNA初始荧光强度;Fm是加入化合物1后体系荧光淬灭达到饱和时的荧 光强度。
[0022] 配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验采用此方法完成。
[0023] (2)复合体系在miRNA存在时的荧光复苏能力
[0024] 荧光复苏时间的确定:在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液（ΙΟμΜ)加入到荧 光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中达到最小浓度25ηΜ，监测荧光强度随时间 的变化，确定体系荧光复检测miRNA的时间。
[0025] 荧光复苏效率的测定：以复合体系的检测时间为标准，记录复合体系荧光强度随 miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率Re用公式1.2计算。
[0026] Re = Ft/Fm-1 (1.2)
[0027] 其中Ft为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。
[0028] 检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection， L0D)〇
[0029] L0D = 3〇/S (2.3)
[0030] 其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。
[0031 ]与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0032] (1)本发明产物原料来源广泛，容易获得；
[0033] (2)本发明产物合成方法的反应条件温和，时间短，可在一般溶剂中合成，无需惰 性气体保护;产率为70%以上，纯度达100%;
[0034] (3)本发明所述的双核铜金属配位聚合物中季铵盐的引入显著增强了金属配位聚 合物的水溶性，为金属配位聚合物活性的研究提供了前提条件，结构中出现的孔洞对金属 配位聚合物具有miRNA识别能力具有较大的影响。实验结果证明，本发明所述的双核铜金属 配位聚合物对胃癌患者外周血中111丨1?-185、111丨1?-2(^、111丨1?-210、111丨1?25和111丨1?-9213五种高表达 microRNA具有良好的检测作用。
【附图说明】
[0035] 图1是本发明所述两性羧酸双核铜金属配位聚合物的重复结构单元的X-射线单晶 衍射表征的分子结构图。
[0036] 图2是本发明所述两性羧酸双核铜金属配位聚合物浓度与荧光标记的不同miRNA 的荧光强度变化曲线图，图中，（a)为P185-DNA，（b)为P21Q-DNA，（c)为P 25-DNA，（d)为P2Qa-DNA， (e)为P92b-DNA〇
[0037] 图3是本发明所述两性羧酸双核铜金属配位聚合物形成的复合体系与荧光标记的 不同miRNA(25nM)在不同时间的荧光强度变化曲线图，（a)为P 185-DNA，（b)为P21Q-DNA，（c)为 P25-DNA，（ d)为P2Qa-DNA，（ e)为P92b_DNA。
[0038] 图4是本发明所述两性羧酸双核铜金属配位聚合物形成的复合体系与荧光标记的 不同miRNA在不同浓度的存在下的荧光强度变化曲线图，图中，（a)为P 185-DNA，浓度为T185; (b)为P21Q-DNA，浓度为T21Q ; ( C )为P25-DNA，浓度为Τ25 ; (d)为P2Qa-DNA，浓度为T2Qa ; (e)为P92b-DNA，浓度为T92b。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1
[0040] 1、两性羧酸双核铜金属配位聚合物的制备
[0041 ]步骤一、将0.4mmol (166. Omg)配体1-(3，5-二羧酸苄基)-4，4' -溴化联吡啶分散在 体积浓度为99%的甲醇中，用0.1 mM NaOH溶液将pH调至6.5，得到1-(3，5-二羧酸苄基)-4， 4'_溴化联吡啶溶液；。
[0042]步骤二、采用乙醚扩散法，将乙醚慢慢扩散入1-(3,5_二羧酸苄基)_4,4'_溴化联 吡啶溶液中，静置三天后析出浅绿色的钠盐晶体，收集晶体得到分子式为[Na(dcbb)(H20)]n 的中间产物A;对中间产物A进行研究分析，其结果如下:元素分析C38H5QCUN4〇 2() · 4.5H20，理 论值义 44.42，!15.79，~5.45;计算值：〇44.58，!15.60，~5.06;红外光谱(1(81(1丨8。，〇11-l)v3412(s)，3053(s)，1617(s)，1570(s)，1495(w)，1416(m)，1385(s)，1362(s)，1221(w)， 1158(w),1075(w),822(m),780(m),723(m),644(w)；
[0043] 步骤三、将0.2mmo 1 (74.8mg)中间产物A溶于水(70mL)溶液中，得到浅黄色中间产 物A澄清溶液，在中间产物A溶液中加入含硝酸铜0. lmmo 1 (24mg)的水溶液2mL，搅拌5min后 进行过滤，滤液室温挥发，三天后得到深蓝色晶体，收集晶体得到分子式为[Cu(dcbb) 2 (H20) ] [Cu (dcbb)2 ] 2中间产物B ;对中间产物B进行研究分析，其结果如下：元素分析 Cii4H78Cu3Ni2〇25.14.5H2〇,理论值：C 55·48，Η 4·37，Ν 6.81;计算值：C 55·09，Η 3·90，Ν 6.51;红外光谱(仙1乜8。，〇11-1>3402(8)，3116(8)，1636(8)，1618(8)，1570(8)，1458(111)， 1412(s)，1362(s)，1220(m)，1161(m)，1076(w)，821(s)，781(s)，720(s)，640(w)。
[0044] 步骤四、将4.5mmo 1 (1 Omg)中间产物B溶于1 OmL 85 °C水中得浅蓝色中间产物B溶 液，在中间产物B溶液中加入含5-氟尿嘧啶1 Ommo 1 (13mg)的DMF溶液2mL，溶液装入30mL厚壁 耐压瓶中进行程序升温（lh，25°C到100°C)，于100°C反应72h，之后再进行程序降温(48h， 100°C到30°C)析出蓝色结晶，收集晶体用乙醚洗净并真空干燥，得蓝色块状结晶6.2m(经测 算产率:70%)g。
[0045] 2、两性羧酸双核铜金属配位聚合物的鉴定
[0046] 通过下述元素分析、IR光谱和X-射线单晶衍射分析鉴定，上述步骤1所得到的蓝色 块状晶体为本发明所述的两性羧酸六核铜金属配位聚合物，其重复单元的分子式为[Cu 2 (dcbb)2(0H)2(H20)6] · 2H20,式中的式中的dcbb为1-(3,5-二羧酸苄基)-4,4'_联吡啶，所述 重复单元的化学结构式如（I)所示。鉴定结果如下：
[0047] (1)元素分析理论值:C 46·96，Η 4·56，Ν 5.76;计算值:C 47·09，Η 4·60，Ν5·84。
[0048] (2)红外光谱（KBr disc，cm-l)v3439(s)，1629(m)，1566(w)，1404(s)，1154(s)， 1072(s)，954(m)，860(s)，546(s)。
[0049] (3)X_射线单晶衍射:晶体学参数和部分键长如表1和表2所示。X-射线单晶衍射结 果表明，上述双核铜金属配位聚合物在常温下为蓝色块状晶体，其重复结构单元中含有两 个个Cu (II)离子，两个Cu原子和两个配体分子单元组成的环状结构，每个Cu2+分别通过与来 自一个配体羧基上的氧进行单齿配位和另一个配体吡啶环上的N原子进行配位，还通过与 三个水分子中的氧进行配位形成的五配位的三角双锥配体构型。晶胞参数分别为： (7=16.512(3) Α，?=18.360(4) A，c=19.386(4)人，.<1 = 9〇。，0 = 9〇。，7=9〇。。父-射线 单晶衍射表征结果如图1所示。
[0050] 表1 · [Cu2(dcbb)2(0H)2(H20)6] · 2H20的晶体学参数
[0051]
[0052] a R= | |F〇|-|Fc|/|F〇| ,b wR={w(F〇2-Fc2)2/w(F〇2) 2}1/2.c GOF={w((F〇2-Fc2)2)/ (n-p)} 1/2,
[0053] 表2.[012((1(^)2(0!02(!120) 6].2!120的部分键长(1)
[0056] 利用对称变换生成的原子:#1 :x，y+l，z;#2:x，y-l，z;#3:x-l，y+l，z;#4:x，y+l， z；#5:x+l,y-l,z.#6：-x,-y+l,-z+l.
[0057] 实施例2
[0058] 本实施例采用实施例1中得到的两性羧酸双核铜金属配位聚合物对五种miRNA识 别作用进行研究。
[0059] 本发明所述的金属配位聚合物溶解性:在25°C条件下，金属配位聚合物在10mL水 中的达到饱和状态时溶解了 2.6mg。
[0060] (1)通过miRBase数据库确认与胃癌外周血中表达异常的5种miRNA的成熟序列，人 工合成作为待检序列，即target RNAs。考虑到RNA相对的不稳定性，我们将target RNAs各 自对应的互补链置换成其互补DNA(complementary DNA，cDNA)，并对cDNAs序列进行焚光标 记，即probe DNAs。5种miRNA相互作为干扰序列。考察金属配位聚合物能否选择性识别5种 miRNA〇
[0061] (DmiR-185:
[0062] Target RNA序列（Ti85):5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3'
[0063] Probe DNA序列互补链（Pi85-DNA):5'-TCA GGA ACT GCC TTT CTC TCC A-FAM-3'
[0064] ② hsa_miR-20a
[0065] Target RNA序列（T2〇a) :5，-UAA AGU GCU UAU AGU GCA GGU AG-3'
[0066] Probe DNA序列互补链（P2〇a-DNA):5，-CTA CCT GCA CTA TAA GCA CTT TA-FAM-3'
[0067] ③hsa_miR-92b
[0068] Target RNA序列（T92b) :5，-UAU UGC ACU CGU CCC GGC CUC C-3'
[0069] Probe DNA序列互补链（P92b-DNA):5，-GGA GGC CGG GAC GAG TGC AAT A-FAM-3'
[0070] ④ hsa-miR-25
[0071] Target RNA序列（T25) :5，-CAU UGC ACU UGU CUC GGU CUG A-3'
[0072] Probe DNA序列互补链(P25-DNA):5'-TCA GAC CGA GAC AAG TGC AAT G-FAM-3'
[0073] ⑤ hsa-miR-210
[0074] Target RNA序列（T21。）：5，-CUG UGC GUG UGA CAG CGG CUG A-3'
[0075] Probe DNA序列互补链（P2iq-DNA):5'-TCA GCC GCT GTC ACA CGC ACA G-FAM-3'
[0076] (2)本发明所述金属配位聚合物检测砧1?-185，1^1?-2(^，1^1?-210，1^1?25和1^1?-92匕
[0077] (a)配制金属配位聚合物水溶液
[0078]将金属配位聚合物溶于蒸馏水中配制成浓度为250μΜ的溶液并用无菌过滤器对溶 液进行除菌，密封保存待用。
[0079] (b)检测的步骤
[0080] (I)化合物结合P-DNA的荧光淬灭性能
[0081 ] 用100nM Tris-HCl缓冲溶液将100μΜ的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液;将 化合物溶解在l〇〇nM Tris-HCl缓冲溶液配成500μΜ(含50nMP-DNA)的溶液为滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度 的变化(激发波长= 480nm，发射波长= 518nm))直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率Qe用 公式1.1计算。
[0082] Qe=(1-Fm/Fo) X100% (1.1)
[0083]其中Fo为P-DNA初始荧光强度;Fm是加入化合物1后体系荧光淬灭达到饱和时的荧 光强度。
[0084] 配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验采用此方法完成。
[0085] (II)复合体系在miRNA存在时的荧光复苏能力
[0086] 荧光复苏时间的确定:在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液（ΙΟμΜ)加入到荧 光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中达到最小浓度25ηΜ，监测荧光强度随时间 的变化，确定体系荧光复检测miRNA的时间。
[0087] 荧光复苏效率的测定：以复合体系的检测时间为标准，记录复合体系荧光强度随 miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率Re用公式1.2计算。
[0088] Re = Ft/Fm-1 (1.2)
[0089] 其中Ft为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。
[0090] 检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection， L0D)〇
[0091] L0D = 3〇/S (2.3)
[0092] 其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。
[0093] (5)实验结果
[0094] 如表3所示，金属配位聚合物对目标miRNA逆转录的荧光标记DNAP185-DNA，P 210- DNA，P25-DNA，P2Qa-DNA和P92b-DNA的荧光淬灭能力（图2)，形成的复合体系对11^-185，11^-210，111丨1?-25，1^1?-2(^和1^1?-9213的检测时间分别为5.3,7.0,4.7,6.3,4.71^11(见图3) ;荧光 复苏率(Re)分别为 0.51，2.33,2.12，1.81，1.22;检测限为0.71，0.43,0.52,0.83,0.9111]\1 (见图4)。该结果表明本发明所述的双核铜金属配位聚合物对五种胃癌病人外周血中过表 达的miRNA具有较好的检测作用。
[0095] 表3.双核铜金属配位聚合物对五种胃癌患者外周血中高表达的五种miRNA检测效 果
[0096]
【主权项】
1. 一种两性羧酸双核铜金属配位聚合物，该两性羧酸铜金属配位聚合物是重复结构单 元为下式（I)所示的的铜配位聚合物，该铜配位聚合物的红外光谱数据(KBr)为:V3439(s)， 1629(m)，1566(w)，1404(s)，1154(s)，1072(s)，954(m)，860(s) ,546(8)01^,晶胞参数分别 为：(67:=16.512(3) A，6=18.360(4) A，c= 19.386(4) A，α=90。，β=90。，γ =90。，2. 权利要求1所述的两性羧酸双核铜金属配位聚合物的制备方法，该方法由以下步骤 组成： (1) 将1-(3,5_二羧酸苄基)-4,4'_溴化联吡啶溶解在体积浓度为99%的甲醇中，调整 溶液pH为6.0~7.0，得到配体溶液； (2) 采用乙醚扩散法，将乙醚慢慢扩散入配体溶液中，静置三天后溶液析出中间产物A， A即[Na(dcbb) (H20) ]，dcbb为 1-(3，5-二羧酸苄基)-4，4'-联吡啶； (3) 将中间产物A溶于水溶液中，得到中间产物A溶液，加入1/2中间产物A摩尔量的硝酸 铜，室温静置三天后得到中间产物B，B即[Cu(dcbb) 2 (H20) ] [Cu (dcbb)2 ] 2; (4) 将中间产物B溶于水中得浅蓝色中间产物B溶液，在溶液中加入含5-氟尿嘧啶的DMF 溶液，升温至100 °C反应48~96h，然后降温至室温析出蓝色晶体，收集晶体并用乙醚洗净并 真空干燥即得到所述的两性羧酸双核铜金属配位聚合物。
【文档编号】C08G83/00GK105949474SQ201610404106
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】陈金香, 覃亮, 陈文华, 刘叔文, 谢宝平, 孙斌
【申请人】南方医科大学