Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽的制作方法

Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽，其氨基酸序列由Tocilizumab模拟表位肽(KTMSAEEFDNWL)的C端和CH12偶联模拟表位肽(WHTEILKSYPHE)的C端通过连接肽(GGGSGGS＝SGGGSGGG)(“＝”表示二硫键)连接而成。3个多肽可以运用化学合成法进行合成，结构为线性。用该偶联肽制备的双特异性抗体，不仅能识别IL?6R，而且能识别EGFRvIII，从而同时抑制IL?6和EGF的活性，产生Tocilizumab单抗与CH12单抗相加的效果，同时克服了需要多次被动免疫的问题。本发明的偶联肽为预防和治疗类风湿性关节炎以及其他疾病提供了新的药物途径。
【专利说明】
Toci I izumab/GH12偶联模拟表位肽
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域中的模拟抗原肽，具体是一种T〇CiliZUmab/CH12偶 联模拟表位肽。
【背景技术】
[0002] 类风湿关节炎(RA)是一种慢性、系统性、多向性的炎性自身免疫性疾病，主要累及 手足小关节，最大的特征就是持续性的滑膜炎，症状包括关节疼痛、关节肿胀以及进展性的 关节破坏，最终导致患者的残疾。
[0003] 目前，用于治疗类风湿关节炎的药物主要包括激素，非留体抗炎药，改善病情的抗 风湿药物(DMARDs)和新兴的生物制剂。相对于传统药物，生物制剂直接作用于主要的炎症 因子，可更迅速、有效地缓解症状，抑制关节结构破坏。目前，用于治疗RA的生物制剂有单克 隆抗体(单抗）、细胞因子以及拮抗剂，包括抗T淋巴细胞表面分化抗原单抗、抗白介素-2受 体(IL-2R)单抗、抗CD54受体单抗、抗肿瘤坏死因子(TNF)-a抗体、重组人白细胞介素-1受体 诘抗剂等。
[0004] 2010年，Tocilizumab(ROACTEMRA)抗体经FDA批准用于治疗类风湿关节炎。 To c i 1 i z umab是一个新型的革E1向IL-6R的单克隆抗体，通过将鼠抗人的IL-6 R抗体的互补决 定区移至人IgGl抗体的框架上从而减少在病人身上可能发生的免疫原性反应，从抗原的结 合位置和抑制IL-6功能这两方面来说，人源化抗体同最初的鼠抗体和抗IL-6R的嵌合性抗 体是一样的。而人源化抗体的免疫原性更小且半衰期更长。Toci lizumab能够特异性结合可 溶性IL-6受体和膜IL-6受体，并且抑制可溶性IL-6和膜IL-6的信号传导，它在2005年获得 了日本的药物许可证明，用于治疗Castelman综合症。Toci lizumab单克隆抗体是第一个临 床试验证明单用疗效好于抗TNF的单抗以及MTX单抗的抗体(Jones G，Sebba A，Gu J et al.Comparison of tocilizumab monotherapy versus methotrexate monotherapy in patients with moderate to severe rheumatoid arthritis: the AMBITION study.Ann Rheum Dis，69:88;96,2010;Kremer JM，et al.Tocilizumab inhibits structural joint damage in rheumatoid arthritis patients with inadequate responses to methotrexate:results from the double-blind treatment phase of a randomized placebo-controlled trial of tocilizumab safety and prevention of structural joint damage at one year.Arthritis Rheum.63(3):609_21，2011)D 同时，该抗体与 DMARDs同用也显示了其超越DMARDs单用的治疗效果（Weinblatt M，et al.Safety of Tocilizumab monotherapy and TCZ plus DMARDs in a US RA population with inadequate response to biologies or DMARDs:The ACT-STAR study.London:EULAR, 2011)。因此Tocilizumab的应用前景可能优于抗TNF生物制剂。
[0005] 虽然临床上各种单克隆抗体的生物疗法推进了类风湿关节炎等自身免疫病或其 他难治性疾病的治疗，但单克隆抗体在免疫治疗中仍旧存在着许多不足之处:①抗体免疫 治疗中为维持抗体的足够效价，必须反复进行免疫;②反复免疫导致抗体的使用费用非常 昂贵;③抗体治疗的副作用也限制了其应用范围，主要为易发感染和药物超敏反应。所以， 通过主动免疫诱导机体产生所需的抗体成为研究者新的选择，其能克服被动免疫需重复进 行和非人源部分对人体的免疫伤害等缺点。
[0006] 为了克服单克隆抗体的这些应用问题，国外学者提出了模拟表位肽的设计。模拟 表位肽，又称镜像表位，是一种能刺激机体产生特异性免疫的多肽，它的最小结构是6~20 个氨基酸长度。模拟表位肽能激活机体的免疫系统，产生主动免疫靶向靶分子，从而起到治 疗疾病的作用，从而避免了单克隆抗体临床上的问题。模拟表位肽的序列有可能和自然表 位的序列不同，但两者的空间结构类似，免疫动物后产生的多克隆抗体不仅能结合模拟表 位肽，而且能结合自然表位，介导进一步的生物学行为。通过免疫模拟表位肽，诱导机体自 身产生抗体祀向目标分子。其成本低廉，安全性好，特异性高(Riemer AB，Jensen-Jarolim E.Mimotope vaccines: epitope mimics induce anti-cancer antibodies. Immunol Lett 20070ct 31；113(l):l-5)〇
[0007] 中国专利公开号104945485A(【公开日】2015-09-30 )公开了 一种抗IL-6受体 Toci 1 izumab的模拟表位肽。用该模拟表位免疫刺激机体产生的抗体，不仅能识别模拟表 位，还能够识别IL-6受体从而抑制IL-6的活性，产生与Tocil i zumab单抗同样的效果，同时 克服了需要多次被动免疫的问题。
[0008] 一些类风湿性疾病与恶性肿瘤具有明显的相关性，如皮肤炎与各种实体肿瘤、干 燥综合征与淋巴瘤、系统性硬化与肺腺癌等，长期使用免疫抑制剂也可导致肿瘤的发生。类 风湿关节炎患者合并恶性肿瘤的情况国内外均有报道，其具体发病机制不详。近年来的相 关报道显示，RA患者不但与血液和淋巴系统肿瘤如白血病、淋巴瘤等有一定的相关性，而且 与实体肿瘤如肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等也有一定的关联。RA患者可先有恶性肿瘤，以后出 现类风湿关节炎，也有的患者在患类风湿关节炎若干年后发生恶性肿瘤，也有两种病变同 时发生并有平行的病程。
[0009] RA与恶性肿瘤之间的关系较明确，加强这方面的认识和探索对诊断和治疗有着重 要意义，然而目前在诊断和治疗中还缺乏相应的药物。
[0010] 有鉴于此，特提出本发明。

【发明内容】

[0011] 为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种T〇CiliZUmab/CH12偶联模拟 表位肽，其免疫动物后所得的多克隆抗体能靶向两类疾病的特异性靶点，并抑制这两个靶 点的信号通路及恶性表型，进而达到治疗效果。
[0012] 本发明提供的T〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所 示，由SEQ ID N0:2所示的Tocilizumab模拟表位肽的C端与SEQ ID N0:3所示的CH12模拟表 位肽的C端通过SEQ ID N0:4所示的连接肽连接而成;其中，
[0013] Tocilizumab模拟表位肽段:N基端-C末端KTMSAEEFDNWL(SEQ ID N0:2);
[0014] CH12模拟表位肽段:N基端-C末端WHTEILKSYPHE(SEQ ID N0:3);
[0015] 连接肽:N基端-C末端GGGSGGS = SGGGSGGG(SEQ ID从):4)，其中"="表示二硫键。
[0016] SEQ ID NO: 1的氨基酸序列如下：
[0017] KTMSAEEn)NWLGGGSGGS = SGGGSGGGEHPYSKLIETHW，两边的氨基酸K 和氨基酸 W为多 肽N基端，连接肽两端的氨基酸L和氨基酸E为多肽C末端，连接肽为GGGSGGS = SGGGSGGG，= 表-?硫键。
[0018] CH12是一个尚处于实验阶段的抗EGFRvIII的单克隆抗体，其能结合只在肿瘤或一 些恶性疾病中表达的EGFRvIII和过表达的EGFR(与正常表达水平的EGFR不结合），从而抑制 下游的信号通路。单克隆抗体CH12在多种肿瘤的动物模型中都能有效抑制肿瘤的细胞恶性 表型，显示出了很好的应用前景（参见文献：Xu W，et al.Combination of an anti-EGFRvIII antibody CH12with Rapamycin synergistically inhibits the growth of EGFRvIII+PTEN-glioblastoma in vivo . Oncotarget.2016Mar 26.doi:10.18632/ oncotarget.8407；Xu ff et al. Synergistic antitumor efficacy against the EGFRvIII+HER2+breast cancers by combining trastuzumab with anti-EGFRvIII antibody CHI2.Oncotarget.2015Nov 17；6(36):38840-53；Jiang H et al.The monoclonal antibody CH12augments 5_fluorouracil-induced growth suppression of hepatocellular carcinoma xenografts expressing epidermal growth factor receptor variant III.Cancer Lett.2014Jan 1；342(1):113-20；Yang Y et al. The monoclonal antibody CH12enhances the sorafenib-mediated growth inhibition of hepatocellular carcinoma xenografts expressing epidermal growth factor receptor variant III .Neoplasia· 2012Jun; 14(6): 509-18) D鉴于EGFR/EGFRvIII在类风 湿关节炎等恶性疾病以及恶性肿瘤中可能存在的重要致病机制，本发明以EGFR及其突变体 作为治疗祀点，对识别该祀点的单克隆抗体CH12进行模拟表位设计，并与Toci 1 izumab模拟 表位偶联，获得了上述偶联模拟表位肽，以期实现其抗体能够双靶点结合治疗的效果。
[0019] 设计时:T〇Cilizumab模拟表位肽的C端连连接肽的N端，CH12偶联模拟表位肽的C 端连连接肽的C端。而在实际制作中，可选的一种实施方式是:Tocili zumab模拟表位肽连同 连接肽的一半是一同通过化学合成法完成的(KTMSAEEFDNWLGGGSGGS)，同理，CH12偶联模拟 表位肽连同连接肽的另一半是一同通过化学合成完成的(WHTEILKSYPHEGGGSGGGS)，最后两 段用二硫键连起来。
[0020]通过线性连接肽将Tocilizumab模拟表位肽和CH12模拟表位肽进行偶联，中间的 连接肽为线性，具有较高灵活性和摆动性的特点。这样的结构激活免疫系统能产生双特异 性抗体，该抗体能同时革G向IL-6R和EGFRvII I。这样的设计产生的抗体能取代两个不同的单 克隆抗体，发挥两个单克隆抗体相加的作用。在未来可能的临床应用中，减少药物使用的次 数，减少药物的使用成本，提高安全性。
[0021] 本发明还提供了一组功能性基因序列，转录后翻译获得的多肽可以用于构成上述 Toci 1 izumab/CH12偶联模拟表位肽，其包括Toci 1 izumab模拟表位肽的编码基因，CH12偶联 模拟表位肽的编码基因，以及连接肽的编码基因。在多肽的氨基酸序列已知的情况下，每个 氨基酸残基对应的密码子可以是一种或多种，基于此，可以根据需要采用现有技术手段做 出不同的密码子连接组合，每条多肽对应的多个密码子组合形成的不同编码基因，均在本 发明的保护范围之内。
[0022] Tocilizumab模拟表位肽的编码基因，优选为5'_aag acg atg agt get gag gag ttt gat aat tgg ctg ggt gga ggt tcg_3'(SEQ ID NO:5)。
[0023] 0112模拟表位肽的编码基因，优选为5'-七88〇3七3(^838 31:1：(^8 338 1：(31:七&七 ccg cat ggg ggt gga ggt tcg_3'（SEQ ID N0:6)。
[0024] 上述的T〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽的编码基因也在本发明的保护范围之 内。该编码基因同样可以为不同的密码子组合形成的多条DNA序列中的任意一条。
[0025] 本发明还提供了含有上述编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、转基 因细胞系或宿主囷。
[0026]上述1'〇〇;[1丨21111^13/0112偶联模拟表位肽作为抗原在制备诱导抗体产生的药物中 的应用也在本发明的保护范围之内。
[0027] Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽上的Tocilizumab模拟表位肽和CH12模拟表位 肽能同时发挥其生物学功能，作为免疫原激活免疫系统产生双特异性抗体，该抗体能同时 靶向 IL-6R 和 EGFRvIII。
[0028]本发明还提供了一种多克隆抗体，是由以上所述的Tocilizumab/CH12偶联模拟表 位肽免疫动物制备获得。所述抗体能够特异性识别IL-6R和EGFRvII I。
[0029] 本发明还提供上述多克隆抗体在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治 疗类风湿性关节炎。
[0030] 本发明还提供上述多克隆抗体在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治 疗肿瘤。
[0031] 优选地，所述肿瘤为组织细胞淋巴瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌或脑胶质瘤。
[0032] 本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0033] 本发明通过偶联两个不同的模拟表位肽，发现免疫动物后所得到的多克隆抗体能 靶向两个疾病特异性的靶点IL-6R和EGFRvIII，并抑制着两个靶点的信号通路及恶性表型。 由此证明由偶联模拟表位肽所引起的主动免疫能同时产生与Toe i 1 izumab (R0ACTEMRA)和 CH12单克隆抗体类似的治疗效果，并且特异性高(靶向疾病特异性靶点）、成本低(多肽合成 价格低廉）、安全(多肽合成过程无感染源）、不需要反复用药(类似疫苗，只需免疫3-4次)和 副作用小(不涉及种属异质性），因此优于单克隆抗体生物治疗。
【附图说明】
[0034] 图1是运用免疫印迹实验检测多克隆抗体是否能结合受体过表达细胞系或肿瘤细 胞系表达的IL-6R和EGFRvII I电泳结果。顶部标注为Tocilizumab的电泳结果图显示单抗 Tocilizumab与IL-6R结合情况，顶部标注为pur if ied pAb的电泳结果图显示纯化的多克隆 抗体与IL-6R结合情况，顶部标注为CH12的电泳结果图显示单抗CH12与EGFR/EGFRvIII结合 情况，顶部标注为purifiedpAb的电泳结果图显示纯化的多克隆抗体与EGFR/EGFRvIII结 合情况。
[0035]图2是运用免疫印迹实验检测多克隆抗体是否能结合类风湿关节炎或骨关节炎患 者滑膜组织表达的IL-6R和EGFRvIII的电泳结果。其中，顶部标注mimo-pAb的电泳图表示免 疫印迹法检测T 〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽免疫动物产生的多克隆抗体的结合检测 结果；顶部标注Tocilizumab的电泳图表示单抗Tocilizumab的结合检测结果；顶部标注 CH12的电泳图表示单抗单抗CH12的结合检测结果；EGFR相对位置条带为170KD附近， EGFRvIII相对位置条带为130KD附近，IL-6R相对位置条带为72KD及55KD附近，beta-actin 为内参蛋白。
[0036] 图3是运用免疫印迹实验检测多克隆抗体是否能结合类风湿关节炎或骨关节炎患 者成纤维滑膜细胞表达的IL-6R和EGFRvII I的电泳结果。图中标注同图2。
[0037] 图4是运用免疫荧光实验检测多克隆抗体所引起的类风湿关节炎患者成纤维滑膜 细胞表达的IL-6R和EGFRvIII内化降解结果照片。图中，第一排从左到右，依次为①核染色 剂DAP I②IL-6R结合的对照组多抗③IL-6R④核染色剂DAP I⑤与IL-6R结合的偶联模拟肽组 多抗⑥IL-6R;第二排从左到右，依次为①核染色剂DAPI②与EGFRvIII结合的对照组多抗③ EGFRvIII④核染色剂DAPI⑤与EGFRvIII结合的偶联模拟肽组多抗⑥EGFRvIII; control pAb表示对照组多抗，mimo-pAb表示本发明偶联模拟表位肽免疫动物制备的多抗(模拟肽组 多抗），DAPI表示为细胞核染色剂。
[0038] 图5是运用免疫印迹实验检测偶联模拟表位肽制备的多克隆抗体对于类风湿关节 炎患者成纤维滑膜细胞EGF和IL-6信号通路抑制情况的实验结果。
[0039] 图6是运用细胞计数试剂盒观察偶联模拟表位肽制备的多克隆抗体对于类风湿关 节炎患者成纤维滑膜细胞EGF和IL-6刺激后增殖的影响柱形图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
[0041 ] Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽制备和鉴定流程基本包括：
[0042] 1、合成Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽；
[0043] 2、T〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽免疫动物；
[0044] 3、纯化动物血清，得到多克隆抗体；
[0045] 4、运用免疫印迹法检测纯化到的多克隆抗体结合过表达细胞系和肿瘤细胞系表 达的IL-6R和EGFRv III的能力；
[0046] 5、运用免疫印迹法检测纯化到的多克隆抗体结合类风湿关节炎滑膜组织表达的 I L_6R 和 EGFRv III 的能力；
[0047] 6、运用免疫印迹法检测纯化到的多克隆抗体结合类风湿关节炎成纤维样滑膜细 胞表达的IL-6R和EGFRv III的能力；
[0048] 7、运用免疫印迹法检测纯化到的多克隆抗体对于类风湿关节炎成纤维样滑膜细 胞IL-6和EGF信号通路的影响；
[0049] 8、运用细胞计数试剂盒观察纯化到的多克隆抗体对于类风湿关节炎成纤维样滑 膜细胞IL-6和EGF引发增殖的影响。
[0050] 生物材料及试剂来源：
预染蛋白Marfei· Formentas公司 TEMED Signm 公司 DMSO MPBiO 公习 牛血清白蛋白(BSA) Sigma公司 PVDF'膜 Milliporc 公司 丙炼· S先胺 Amersham-Pharmacia 公司 十二烷基硫酸钠 (SDS> Sigma公司 过繞酸铵 _Sigma公司_ 蛋白定:i；试剂盒（BCA法） Thermo Hsher公司 CCK-8细胞增殖检测试剂盒 Promega公司 Montage ProSep G 抗体纯化试 ΜΠΠροιχ、公司 剂盒 p-Aki (Scr473) Cell Signa丨ing Technology 公司 Akl Cell Signa丨ing Technology 公司 p-p44/42 Erk(Thr202/Tyr404) Cell Signaling Technology 公司
[0052] p44/42 Erk Cell Signaling Technology 公司 STAT3 Cell Signa丨ing Technology 公习 p -STAT3(Tyr7〇5) Cell Signaling Technology 公'3] p38 Cell Signaling Technology 公'3] p-p38(lyrI80) Cell Signaling Technology 公司 BCL-XL Cell Signaling Technology 公司 JNK Cell Signaling Techno丨ogy 公司 p-JNK(lyrl80) Cell Signaling Techno丨ogy 公司 EGFR Cell Signaling Technology 公司 β-Actin 中杉金桥生物公司 Norlhcrnlighis546 anli-ral IgG R&D 公司 Tocilizumab (1L-6R 单克隆抗 ROCHE 公司 体） (.?12 (EGFR单克隆抗体） 上海市肿瘤研究:所
[0053] 一、Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽免疫动物
[0054] (l)Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽的准备
[0055] 多肽的合成和偶联由北京赛百胜（SBS)公司进行，纯度>98%。设置相似长度的多 肽为对照组多肽(对照肽为：
[0056] MTLHSNSTTSPLGGGSGGGS = SGGGSGGGFPNISSSWVHSP，其偶联的方法方式同本发明） 以T〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽（以下简称偶联肽)和对照肽作为免疫的抗原，每次免 疫的剂量为200yg蛋白，应用的佐剂为完全弗式佐剂（第一次免疫）和不完全弗式佐剂(第 二、三、四次免疫）。
[0057] (2)Wistar大鼠的准备
[0058] Wistar大鼠由维通利华公司提供，饲养地点为北京大学医学部动物中心，SPF级 Wi star大鼠，8周龄，雌性。大鼠分2组，1组为偶联肽组(免疫Toe i 1 i zumab/CHl 2偶联模拟表 位肽），1组为对照肽组(免疫对照组多肽）。
[0059] (3)Wistar大鼠的免疫
[0060] Wistar大鼠用皮下注射免疫，在第1、22、43、65天免疫，共4次，每次免疫后7天眼内 眦取血。全血4 °C放置24hr后，4000rpm离心15min，取上清，分装后-20 °C保存。
[0061 ]二、大鼠抗血清的纯化
[0062] 大鼠多克隆抗体的纯化用Millipore公司的Montage ProSep G抗体纯化试剂盒进 行纯化。
[0063] (1)大鼠血清用试剂盒提供的Buffer A进行1:1的稀释，加入纯化柱后，500g室温 离心20min。
[0064] (2)用Buffer A 15ml对纯化柱洗涤一次，500g室温离心20min。
[0065] (3)用Buffer B 10ml洗脱结合上的多克隆抗体，500g室温离心20min。
[0066] (4)用Buffer C ΙδΟμΙ中和Buffer B〇
[0067] (5)用去盐浓缩柱处理多克隆抗体体系，然后用PBS进行稀释，分装后_20°C保存。 [0068]三、免疫印迹法(Western Blot)检测纯化后的多克隆抗体与过表达细胞系和肿瘤 细胞系EGFRvIII和IL-6R的结合能力
[0069] (1)蛋白的抽提
[0070] 分别取一平皿或培养瓶中生长良好的拖1^、1]937、11^1?^、!11111746?1^111、!111117- 几-61?^431^549和了?-1细胞去除培养液，用适量预冷的？85洗涤细胞，在培养皿中加入600 μL PBS，用细胞刮刮下细胞，收集到Eppendorf管中，8000rpm离心lmin，弃上清;沉淀加入现 配的细胞裂解液1〇〇μ1，按体积比1:100加入蛋白酶抑制剂，吹打悬浮沉淀，冰上放置30min， 12000rpm离心15min，收集上清，BCA法测蛋白浓度。
[0071] (2)配制PAGE电泳用胶：
[0072]分离胶配方：
[0074] 浓缩腔配方：
[0077]浓缩胶加在分离胶的上方，并插入加样梳，室温放置15min。待积层胶凝固以后，即 可拔出加样梳备用。
[0078] ( 3 )上样：细胞提取蛋白加入6 X蛋白电泳上样液混勾，沸水浴处理1 5min。 1 OOOOrpm离心5min，取20yg上样进行蛋白电泳。
[0079] (4)电泳:恒定电压进行电泳。首先80V电压约30min使蛋白样品至浓缩胶和分离胶 界面后转为120V电压约1~1.5hr直至蛋白跑至分离胶底部。
[0080] (5)电转:恒定电流250mA约2.5hr进行湿式电转法将蛋白转移至预先经甲醇活化 的PVDF膜上。
[0081 ] (6)封闭：用TBST配制5 %牛血清白蛋白封闭液于室温条件下封闭lhr，摇床上轻 摇。
[0082] (7)孵育一抗:将多克隆抗体（lOμg/ml)与PVDF膜共同孵育，4°C条件下于摇床上轻 摇过夜。
[0083] (8)漂洗:用TBST漂洗一抗，在摇床上轻摇漂洗，每次15min，共3次。
[0084] (9)孵育二抗:根据一抗来源选择二抗，所用浓度为1:10000,室温下于摇床上轻摇 lhr，二抗均是由中心实验室提供的荧光抗体。
[0085] (10)漂洗:用TBST漂洗二抗，在摇床上轻摇漂洗，每次15min，共3次。
[0086] (11)扫描:将漂洗完后的PVDF膜平铺到蛋白印迹扫描仪上，点击Odyseey软件，进 行扫描并保存实验结果。
[0087]结果提示偶联肽免疫动物产生的多克隆抗体能够结合过表达细胞系和肿瘤细胞 系表达的EGFRvIII和IL-6R。参见图1，顶部标注为Tocilizumab的电泳结果图显示单抗 1'〇(^1丨21111^13与11^-61?结合情况，顶部标注为。111^;1^6(1口413的电泳结果图显示上述纯化的多 克隆抗体与IL-6R结合情况，IL-6R相对位置条带为72KD及55KD附近，黑色条带显示结合，颜 色越深代表结合浓度越高。图1中顶部标注为CH12的电泳结果图显示单抗CH12与EGFR/ EGFRvIII结合情况，顶部标注为purified pAb的电泳结果图显示上述纯化的多克隆抗体与 EGFR/EGFRvII I结合情况，EGFR相对位置条带为170KD附近，EGFRvII I相对位置条带为130KD 附近，黑色条带显示结合，颜色越深代表结合浓度越高。
[0088] 四、Western Blot检测类风湿关节炎滑膜组织EGFRvIII或IL-6R的表达
[0089]滑膜组织蛋白的提取方法基本同细胞总蛋白的提取方法，基本方法为:取-80°C冻 存的RA和0A患者来源的滑膜组织等待至室温，剪刀剪取一块约5mm3滑膜组织至EP管中，并 称重，随后按质量体积比为1:5的比例，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上用小剪 刀充分剪碎组织块，后用组织匀浆器匀浆，转速4000rpm，共3次，每次30秒，直至成均匀的组 织悬液，整个过程均在冰上操作，随后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。Western blot 方法同步骤二.。
[0090]结果提示偶联肽免疫动物产生的多克隆抗体能够检测到类风湿关节炎患者滑膜 组织中表达的EGFRv III和IL-6R，参见图2。
[0091] 五、Western Blot检测类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞EGFRvIII或IL-6R的表达 [0092]方法同三，所用细胞为类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。
[0093]结果提示偶联模拟表位肽免疫动物产生的多克隆抗体能够检测到类风湿关节炎 患者成纤维样滑膜细胞中表达的EGFRvIII和IL-6R(参见图3)。
[0094] 六、免疫焚光法（Immunofluorescence)观察多克隆抗体对类风湿关节炎成纤维样 滑膜细胞受体内化的影响
[0095] (1)将类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞细胞接种到confocal皿中（1.0 X 104)，37 °C 5 % C〇2培养至70 % -90 %。
[0096] (2)用 PBS 洗 3 次，每次 10min。
[0097] (3)细胞用4%多聚甲醛于室温固定15min。
[0098] (4)用 PBS 洗 3 次，每次 10min。
[0099] (5)用10%羊血清(溶于PBS/pH 7.3)，室温封闭lhr。
[0100] (6)用 PBST 洗 3 次，每次 10min。
[0101] (7)多克隆抗体(10μg/ml)室温孵育lhr。
[0102] (8)用 PBST洗3次 XIOmin。
[0103] (9)加 Northernlights546anti-rat IgG抗体（1:100)及DAPI(1:1000)，均稀释于 PBS，室温孵育30min。
[0104] (10)用 PBS 洗 3 次，每次 15min。
[0105] (11)用甘油封片。
[0106] (12)用普通荧光显微镜观察，照相。
[0107] 结果提示多克隆抗体能使类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞表面的受体发生 内化降解。参见图4,红色为结合的多克隆抗体，绿色为IL-6R或EGFR受体。阴性对照多肽组 的多抗（control-pAb)与IL-6R和EGFR几乎不结合(DAPI:用于细胞核染色；control-pAb红 光微弱;EGFRvIII和IL-6R绿色荧光强），偶联肽多抗组，显示多抗的结合率非常高(mimo-pAb红色荧光强;EGFRvIII和IL-6R绿色荧光弱，显示受体发生内化降解）。
[0108] 七、Western Blot检测多克隆抗体对IL-6和EGF刺激引起的类风湿关节炎患者成 纤维样滑膜细胞信号通路的影响
[0109] (1)取一平皿生长良好的RA-FLS细胞，传代至9个6cm培养皿，培养细胞至长满整个 平皿。
[0110] (2)倾去含血清的培养基，用无血清培养基饥饿48hr。
[0111] (3)倾去无血清的培养基，加入阳性对照组:Tocilizumab和CH12(10μg/ml)，多克 隆抗体(分为5个浓度梯度：10μg/ml、lμg/ml、0. lμg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml)，37°C孵育 3hr〇
[0112] (4)3hr 后加入 EGF+IL-6(100ng/ml)。细胞因子刺激 30min。
[0113] (5)适量预冷的roS洗涤细胞，在培养皿中加入600μ1 roS，用细胞刮刮下细胞，收 集到Eppendorf管中，8000rpm离心lmin，弃上清;沉淀加入现配的细胞裂解液100μΙ，按体积 比1:100加入蛋白酶抑制剂，吹打悬浮沉淀，冰上放置30min; 12000rpm离心15min，收集上 清，BCA法测蛋白浓度。细胞提取蛋白加入6 X蛋白电泳上样液混匀，沸水浴处理15min。 1 OOOOrpm离心5min，取30yg上样进行蛋白电泳。
[0114] (6)孵育一抗:按1:1000浓度稀释信号通路相关抗体并与PVDF膜共同孵育，4 °C条 件下于摇床上轻摇过夜。
[0115] (7)漂洗:用TBST漂洗一抗，在摇床上轻摇漂洗，每次15min，共3次。
[0116] (8)孵育二抗:根据一抗来源选择二抗，所用浓度为1:10000,室温下于摇床上轻摇 lhr，二抗均是由中心实验室提供的荧光抗体。
[0117] (9)漂洗:用TBST漂洗二抗，在摇床上轻摇漂洗，每次15min，共3次。
[0118] (1〇)扫描:将漂洗完后的PVDF膜平铺到蛋白印迹扫描仪上，点击Odyssey软件，进 行扫描并保存实验结果。
[0119]结果参见图5,信号通路蛋白及大小在左方显示，上方为加入的细胞因子及抗体注 释。第1列不加任何细胞因子或抗体;第2列加入100ng/ml的EGF和IL-6;第3列加入100ng/ml 的EGF和IL-6,以及 10μg/ml的Tocilizumab单抗;第4列，加入 100ng/ml的EGF和IL-6,以及10 μg/ml的CH12单抗;第5~9列，加入100ng/ml的EGF和IL-6，以及分别对应10~0.001μg/ml浓 度的多克隆抗体。提示Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽免疫动物产生的多克隆抗体能够 抑制IL-6和EGF引起的类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞信号通路的活化。
[0120]八、CCK-8法检测多克隆抗体对IL-6和EGF引起的类风湿关节炎患者成纤维样滑膜 细胞增殖的影响
[0121 ]取生长状态良好的RA-FLS细胞接种于96孔板。每孔接种细胞数为5.0 X 103，每个 处理组设5个复孔，分组为：
[0122] 无血清组:为DMEM培养基（阴性对照）；
[0123] 血清阳性组:为DMEM培养基加10%FBS血清（阳性对照）；
[0124] IL-6 组：只加 IL-6(浓度为 100ng/ml);
[0125] EGF组：只加 EGF(浓度为 100ng/ml)
[0126] IL-6+EGF 组：加入 IL-6 和 EGF(浓度为 100ng/ml)
[0127] IL-6+EGF+CH12 组：加入 IL-6、EGF 和 CH12 单抗（IL-6 和 EGF 的浓度为 100ng/ml，CH12 单抗的浓度为l〇μg/ml)
[0128] IL-6+EGF+Tocilizumab 组：加入 IL-6、EGF 和 Tocilizumab 单抗（IL-6 和 EGF 的浓度 为100ng/ml，Tocilizumab单抗的浓度为10μg/ml)
[0129] IL-6+EGF+多克隆抗体(5个浓度)组:加入IL-6、EGF和多克隆抗体（IL-6和EGF的浓 度为 100ng/ml，多克隆抗体的浓度为 10μg/ml、lμg/ml、0 · lμg/ml、0 · 01μg/ml、0 · 001μg/ml)。
[0130] 不同处理条件作用于RA-FLS细胞72hr后弃培养基，每孔用无血清的培养基洗涤一 次，后每孔加入DMEM培养基100μΙ，每孔再加入20μ1 CCK8细胞增殖检测液，于5 %C02的37°C 细胞培养箱继续培养2hr，最终用酶标仪测定490nm波长的吸光度值，比色以空白细胞孔调 零。
[0131] 按下列公式计算细胞百分活率(Percentage of cell viability):
[0132] 细胞存活率％ = (平Aiffi麵疽）X 100%。
[0133] 结果参见图6,纵坐标为吸光度值，代表细胞增殖的系数，横坐标为组别。从左至右 依次为无血清组、血清阳性组、IL-6组、EGF组、IL-6+EGF组、IL-6+EGF+CH12组、IL-6+EGF+ Tocilizumab组、IL-6+EGF+多克隆抗体(5个浓度)组。结果提示偶联模拟表位肽免疫动物产 生的多克隆抗体能够抑制IL-6和EGF引起的类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞的增殖。
[0134] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1 .Tocilizumab/CH12偶联模拟表位肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示， 由SEQ ID N0:2所示的Tocilizumab模拟表位肽的C端与SEQ ID N0:3所示的CH12模拟表位 肽的C端通过SEQ ID NO:4所示的连接肽连接而成;其中， Toe i 1 i zumab 模拟表位肽:N 基端-C 末端 KTMSAEEFDNWL; CH12偶联模拟表位肽:N基端-C末端WHTEILKSYPHE; 连接肽:N基端-C末端GGGSGGS = SGGGSGGG，其中"="表示二硫键。2. -组功能性基因序列，转录后翻译获得的多肽可以用于构成权利要求1所述的 Tocilizumab/CHl 2偶联模拟表位肽，其特征在于，包括Tocilizumab模拟表位肽的编码基 因，CH12偶联模拟表位肽的编码基因，以及连接肽的编码基因。3. 权利要求1所述的T〇Cilizumab/CH12偶联模拟表位肽的编码基因。4. 含有权利要求3所述的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、转基因细胞 系或宿主囷。5. 权利要求1所述的Tocilizumab/CHl 2偶联模拟表位肽作为抗原在制备诱导抗体产生 的药物中的应用。6. -种多克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的Tocil izumab/CH12偶联模拟表位 肽免疫动物制备获得。7. 权利要求6所述的多克隆抗体在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗类 风湿性关节炎。8. 权利要求6所述的多克隆抗体在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿 瘤。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为组织细胞淋巴瘤、宫颈癌、肺 癌、肝癌或脑胶质瘤。
【文档编号】A61K39/395GK106046174SQ201610431258
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】杨麟
【申请人】杨麟