一种n端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
【专利摘要】本发明公开了一种N端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法，属于生物工程领域。本发明的方法包括融合猪溶菌酶基因的设计和大肠杆菌表达系统的表达及复性。经抗菌活性检测，本发明中的融合猪溶菌酶不仅对革兰氏阳性菌具有明显抗性，同时也可以杀灭多种革兰氏阴性菌，为提高溶菌酶的抗菌活性提供了很好的案例。本发明中的融合猪溶菌酶制备工艺具有简单、高效的特点，产物可达电泳纯，纯度在90％以上。
【专利说明】
一种N端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种N端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法，属于生物工程 领域。
【背景技术】
[0002] 几十年来，抗生素通过抑制病原微生物增殖，减少其代谢毒素对动物的毒害作用 而在防治动物的疾病、促进动物的生长、提高畜禽产品的产量等方面起到了积极的作用。但 是长期的使用抗生素，尤其是饲养过程中使用抗病药物、促生长添加剂等，会造成药物的残 留超标，产地的环境污染，导致肌肉的品质和加工产品的质量下降。除此之外，禽畜长期使 用抗生素作饲料添加剂，可使某些菌群变为耐药菌株，从而带来预防与治疗人畜某些疾病 的困难。
[0003] 欧盟监管委员会决定，自2006年1月起在动物养殖业中禁用抗生素生长促进剂。从 2013年12月开始，美国FDA发布了《兽医饲料指令》，要求有执照的兽医监督抗生素的使用， 计划从2014年起，用3年时间禁止在牲畜饲料中使用预防性抗生素，最大限度地减少食用牲 畜带给消费者抗生素耐药性问题。韩国也计划在2018年7月全面禁止饲用抗生素的使用。
[0004] 随着细菌对抗生素耐药性和抗生素的残留问题日益严重，研究和开发绿色饲料添 加剂产品已经成为世界性的研究课题，大量研究表明，中草药提取物、微生物制剂、酶制剂、 益生元、抗菌肽、酸化剂等新型饲料添加剂能有效减少或者替代饲用抗生素的使用。其中， 溶菌酶来自动物体内，因为其同源性和高效性而备受人们亲睐。
[0005] 猪溶菌酶是猪体内抵抗外源微生物侵染的一道重要屏障，是其非特异性免疫的重 要组成部分。鉴于猪在畜牧业中的重要地位，猪溶菌酶的规模化生产问题已经提上日程。然 而，与其他C-型溶菌酶的作用类似，猪溶菌酶的抗菌谱主要集中在革兰氏阳性菌，对革兰氏 阴性菌基本没有抑菌作用，这也限制了它的应用。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明利用蛋白酶将猪溶菌酶水解成不同的片段，利用超滤 和色谱等技术，得到了对革兰氏阴性菌具有明显抗性的活性肽，并得到了抗菌肽的氨基酸 序列A-W-V-A-W-K(SEQ ID N0.1所示）。并利用融合表达的技术手段，将一个或者多个拷贝 的该抗菌肽与猪溶菌酶进行N端融合，得到了既能抗革兰氏阳性菌，又可以杀灭革兰氏阴性 菌的猪溶菌酶产品。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为:A-W-V-A-W-K(如SEQ ID NO. 1所示）。所述抗菌肽属于碱性肽，与抗菌肽数据库(The Antimicrobial Peptide Database)等数据库比对，此种抗菌肽是首次被报道。该抗菌肽对大肠杆菌、铜绿 假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌均有明显抑制作用。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种融合溶菌酶，所述融合溶菌酶是将一个或者多个 拷贝的抗菌肽编码基因与猪溶菌酶编码基因的N端融合得到的；所述抗菌肽的氨基酸序列 如SEQ ID N0.1 所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述多个拷贝，是2-20个拷贝。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述多个拷贝，是2-6个拷贝。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述融合，是将多拷贝的抗菌肽编码基因依次连接， 然后与猪溶菌酶编码基因的N端融合。抗菌肽编码基因与猪溶菌酶编码基因之间直接融合， 不加其他核苷酸，或者是采用加连接肽或者酶切位点的融合方式。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述多个拷贝的抗菌肽编码基因之间是直接依次连 接，基因之间不加其他核苷酸。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述猪溶菌酶是NCBI上genebank号为AAA86644.1的 猪溶菌酶。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述猪溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述融合溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示， 命名为6SP-SSL。是将六分子的上述抗菌肽(六肽）的编码基因依次连接之后与猪溶菌酶编 码基因的N端进行融合所得，两段基因之间不加切割位点。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述融合溶菌酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0017] 本发明的第三个目的是提供含有所述融合溶菌酶编码基因的基因表达框、重组载 体、重组菌。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-28a( + )为表达载体构建得到 的。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌，是以大肠杆菌为宿主构建得到的。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种表达所述融合溶菌酶的方法，所述方法是将融合 溶菌酶编码基因克隆到表达载体中得到重组载体，然后将重组载体转化到宿主菌中，以得 到的重组菌表达融合溶菌酶。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET-28a( + )、宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)〇
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述表达融合溶菌酶，是在30°C、200r/min条件下， 利用0 . lmmol/L的IPTG诱导8h，离心发酵液获得菌体，然后获得菌体中的重组蛋白包涵体， 对包涵体进行复性，得到具有生物活性的融合溶菌酶。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述复性是采用稀释法对融合蛋白进行复性。复性 液为PH8.0的50mM Tris-HC1，0.15M NaCl，5mM EDTA，1M Urea，0.5M Arg，2mM GSH(还原型 谷胱甘肽），〇.5mM GSSG(氧化型谷胱甘肽）。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，复性后的蛋白用分子量为3000Da的超滤膜超滤，然 后用截留分子量为3500的半透膜对pH 8.0的50mM Tris-HCl和0.15M NaCl溶液透析，之后 冷冻干燥。
[0025] 本发明的第五个目的是提供所述融合溶菌酶的应用，是作为饲料添加剂。
[0026] 本发明的第六个目的是提供一种抑制多种革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的方 法，是使用所述的融合溶菌酶。
[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述革兰氏阳性菌，为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆 菌、溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌等;所述革兰氏阴性菌，为大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺 炎克雷伯氏菌和沙门氏杆菌等。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] (1)本发明将新发现的对革兰氏阴性菌具有明显抗性的活性肽(A-W-V-A-W-K)与 猪溶菌酶进行融合，得到了融合溶菌酶。得到的融合溶菌酶，对枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、 金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革兰氏 阴性菌均有明显的杀菌作用，拓宽了猪溶菌酶的抗菌谱。
[0030] (2)本发明获得的融合溶菌酶可作为饲料添加剂使用，有望在将来替代抗生素和 解决食品安全问题中发挥重要作用。
[0031] (3)本发明工艺具有简单、快速、高效的特点，所涉及的各种缓冲液配方均可以在 实验手册中查到，制备得到的产品纯度高，复性后的产品可达电泳纯，纯度在90%以上。
【附图说明】
[0032]图1:融合溶菌酶的SDS-PAGE ;M，蛋白Marker; 1，猪溶菌酶;2，融合溶菌酶。
【具体实施方式】
[0033]实施例1:融合溶菌酶的生产
[0034] 1、将六分子的从猪溶菌酶中分离得到的六肽(A-W-V-A-W-K，SEQ ID N0.1)的编码 基因依次连接之后与猪溶菌酶编码基因的N端进行融合，任何两段基因中间不加切割位点， 融合后的基因序列如SEQ ID从).4所示，命名为63?-33匕
[0035] 2、将融合后的基因序列与表达载体pET_28a( + )连接，双酶切所用限制酶为BamH I 和Hind ΙΠ ，转入宿主E.coli BL21(DE3)中进行表达，在30°C、200r/min条件下，利用 O.lmmol/L的IPTG诱导8h，离心发酵液获得菌体。对其进行超声破碎获得重组蛋白包涵体。 [0036] 3、采用稀释法对上述获得的包涵体进行复性，所用到的溶液为pH 8.0的50mM Tris-HC1，0.15M NaCl，5mM EDTA，1M Urea，0.5M L-Arg，2mM GSH，0.5mM GSSG。
[0037] 4、对复性后的融合蛋白进行超滤，截留分子量为3000Da，之后采用截留分子量为 3500的半透膜对pH 8.0的50mM Tris-HCl和0.15M NaCl溶液透析，透析之后进行冷冻干燥， 获得具有生物活性的融合溶菌酶产品6SP-SSL。
[0038] 此外，采用类似的方法，分别将1、2、3、4、5个拷贝六肽的基因与猪溶菌酶编码基因 进行融合，得到了融合溶菌酶产品 1SP-SSL、2SP-SSL、3SP-SSL、4SP-SSL、5SP-SSL。
[0039] 实施例2:融合溶菌酶的抗菌性能检测
[0040] 融合溶菌酶的抑菌活性测定参照文献的方法进行。测试菌经过二级活化之后，以 1 %的接种量接种至含30mL TSB培养基的三角瓶中培养至OD600为0.6，取0.2mL菌液与0.4mL TSB培养基混合后加入0.2mL含有融合溶菌酶（猪溶菌酶SSL和六肽SP作对照）的PBS (0 · 05mo 1/L，pH 7 · 0)缓冲液混匀，使融合猪溶菌酶(或对照）的终浓度为8 · 3 X 1 (T8mo 1 /L。混 合体系于37 °C、200r/min条件下培养2h后，稀释涂布至TSB平板上，待长出菌落后进行计数。 计算抑菌系数log Νο/Λ，其中No是指空白组的菌落数，即只加 PBS溶液;见是实验组(或对照 组)的菌落数。结果如表1所示。其中A~F依次代表六肽拷贝数为1~6的融合溶菌酶。
[0041] 表1本发明融合溶菌酶的抑菌效果
[0042]
[0043] 本发明的融合猪溶菌酶，对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、溶壁微球菌、金黄色葡 萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌、沙门氏杆菌等革兰 氏阴性菌均有明显的杀菌作用，拓宽了猪溶菌酶的抗菌谱。
[0044]实施例3:融合溶菌酶的应用
[0045] 本发明的融合猪溶菌酶不仅可以抗多种革兰氏阳性菌，又可以杀灭多种革兰氏阴 性菌，包括多种病原菌，可以作为饲料添加剂替代抗生素的使用。
[0046] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种融合溶菌酶，其特征在于，所述融合溶菌酶是将一个或者多个拷贝的抗菌肽编 码基因与猪溶菌酶编码基因的N端融合得到的;所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 不。2. 根据权利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述多个拷贝，是2-20个拷贝。3. 根据权利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述融合，是将多拷贝的抗菌肽编 码基因依次连接，然后与猪溶菌酶编码基因的N端融合。4. 根据权利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述猪溶菌酶是NCBI上genebank号 为AAA86644.1的猪溶菌酶。5. 根据权利要求1-4任一所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述猪溶菌酶的氨基酸序列 如SEQ ID NO .2所示。6. 根据权利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述融合溶菌酶的氨基酸序列如 SEQIDN0.3**。7. 含有权利要求1-6任一所述融合溶菌酶的编码基因的基因表达框、重组载体或者重 组菌。8. -种表达权利要求1所述融合溶菌酶的方法，所述方法是将融合溶菌酶编码基因克 隆到表达载体中得到重组载体，然后将重组载体转化到宿主菌中，以得到的重组菌表达融 合溶菌酶。9. 权利要求1-6任一所述融合溶菌酶的应用。10. -种抑制多种革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，所述方法是 使用权利要求1-6任一所述的融合溶菌酶。
【文档编号】A61K38/47GK106046173SQ201610394616
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】陆健, 蔡国林, 朱德伟
【申请人】江南大学