一种罗丹明荧光纳米复合粒子及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医学荧光分析【技术领域】，公开了一种罗丹明荧光纳米复合粒子及其制备方法和应用。该荧光纳米复合粒子的制备包括以下步骤：先将罗丹明6G溶解于蒸馏水中，再用巯基化学物功能化得到罗丹明6G巯基功能化的化学物，利用硅源前驱物在高温和高压下水解与缩合，制备得到罗丹明荧光纳米复合粒子。该荧光复合物不易泄露，经过多次水洗，仍有较强的荧光特性。通过改变硅源前驱物、NH3·H2O两者的比例可以制备出不同粒径大小的二氧化硅包覆荧光素。本发明的复合荧光物其外壳二氧化硅有生物亲和性，可以用于蛋白质的标记，成为纳米生物标记的新型材料。该荧光纳米颗粒的标记方法也为生物医学和分子生物学提供了一种新型的分析方法。
【专利说明】一种罗丹明荧光纳米复合粒子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学荧光分析【技术领域】，具体涉及一种具有高稳定性和抗漂白性的罗丹明荧光纳米复合粒子及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]在生物学与医学研究领域里，探索和发展高灵敏度的非同位素检测方法一直是研究者十分关注的课题，其中荧光分析法是一种重要的非同位素方法，荧光标记生物分子(如蛋白质)在生物学研究和医学研究各领域里发挥了重要的作用。但传统的荧光分析方法存在一些难以克服的缺陷，1、多数荧光试剂存在光漂白的现象，导致荧光信号不稳定；2、荧光泄露现象严重；3、荧光试剂及其光解产物对活体细胞有一定的毒副作用；4、传统的生物分子荧光标记方法，只能在生物分子的活性基团上连接少数的几个荧光分子，分析灵敏度有限。随着纳米技术的发展，结合了纳米技术与材料制备技术而发展起来的复合荧光染料颗粒的制备为生物医学领域的研究提供了新的材料、技术和方法。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种荧光泄漏少，光化学稳定性高的罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法；
[0004]本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的罗丹明荧光纳米复合粒子；
[0005]本发明的再一目的在于提供上述罗丹明荧光纳米复合粒子的应用。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，包括以下操作步骤:
[0007](I)将摩尔比为1:5~5:1的巯基化合物与罗丹明6G(Rhodamine6G)溶解在蒸馏水中反应，得到混合液；
[0008](2)将步骤(1)所得混合液在保护气体氛围下，在低温5°C~15°C且黑暗条件中进行反应；
[0009](3)加入硅源前驱物、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于温度50°C -150°C条件和1.5-4.5个标准大气压条件下进行反应，所述硅源前驱物与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为300:1~900:1 ;
[0010](4)将步骤(3)所得产物离心分离、洗涤，得到罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0011]步骤(1)所述巯基化合物为巯基乙醇、巯基乙酸、苯硫酚或半胱氨酸。
[0012]步骤(3)所述硅源前驱物为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或硅酸钠。
[0013]步骤(1)所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为100:1~200:1。
[0014]步骤(2)所述保护气体为氮气或氩气。
[0015]步骤(3)所述硅源前驱物、氨水和蒸馏水的体积比为1:1: 20~1: 4: 50。
[0016]一种根据上述方法制备的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0017]上述罗丹明荧光纳米复合粒子在生物标记领域中的应用，特别是在细胞标记中的应用。
[0018]上述的罗丹明荧光纳米复合粒子在生物标记领域中的应用，特别是在细胞标记中的应用。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0020]本发明罗丹明荧光纳米复合粒子具备良好的生物安全性，易与各种生物分子通过多种方式偶联，可以用来标记生物大分子，不会对生理活动造成危害；通过外壳材料的包被可以避免外界环境因素对粒子中荧光染料Rhodamine6G的漂白作用，其光学稳定性比传统的标记法有明显提高；包裹作用还能使更多的发光分子连接在生物分子上起到信号放大作用；该复合粒子不仅保持了染料分子的光学活性，而且染料在较大浓度下不会发生自聚、泄漏现象；本发明纳米荧光复合型材料可应用于检测生命体系内的痕量活性物质，以便在细胞和单分子水平上获取生命过程的化学与生物信息，了解生物分子及其结构与功能的关系，对生命活动机理的阐释和疾病的早期诊断具有非常重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是罗丹明荧光复合粒子的TEM图(透射电子显微镜图)。
[0022]图2是罗丹明及罗丹明荧光复合粒子的荧光泄露图，a为罗丹明单体的荧光泄露，b为罗丹明荧光复合粒子的荧光泄露。
[0023]图3是罗丹明荧光纳米复合粒子的激光共聚焦图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025]实施例1
[0026](I)将摩尔比为1:5的巯基乙醇与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为100:1 ；
[0027](2)将步骤(1)所得混合液在氮气氛围下，在低温5°C且黑暗条件中进行偶合反应12h,得至Ij Rhodamine6G_APS 溶液；
[0028](3)加入硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于45°C温度下搅拌反应12h，得到悬浊液；所述硅源前驱物正硅酸乙酯与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为300:1 ;硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水的体积比为1:1: 20;
[0029](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径50nm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0030]经TEM粒径检查，其罗丹明荧光纳米复合粒子粒径在50nm左右，粒子的分散性好，如图1所示。
[0031]实施例2
[0032](I)将摩尔比为1:5的巯基乙酸与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为100:1 ；
[0033](2)将步骤⑴所得混合液在氮气氛围下，在低温15°C且黑暗条件中进行偶合反应 12h，得到 Rhodamine6G-APS 溶液；
[0034](3)加入硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于95°C温度下搅拌反应lh，得到悬浊液；所述硅源前驱物正硅酸乙酯与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为300:1 ;硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水的体积比为1:1: 20;
[0035](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径80nm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0036]经荧光泄露检查，其罗丹明荧光纳米复合粒子粒径1800秒，荧光强度只减少13%，如图2所示。
[0037]实施例3
[0038](I)将摩尔比为1:5的巯基乙酸与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为100:1 ；
[0039](2)将步骤⑴所得混合液在氮气氛围下，在低温10°C且黑暗条件中进行偶合反应 12h，得到 Rhodamine6G-APS 溶液；
[0040](3)加入硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于65°C温度下搅拌反应8h，得到悬浊液；所述硅源前驱物正硅酸乙酯与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为500:1 ;硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水的体积比为1: 3: 30;
[0041](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径IOOnm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0042]经激光共聚焦检查，其罗丹明荧光纳米复合粒子具有明显的红色荧光，如图3(a)。
[0043]实施例4 [0044](I)将摩尔比为5:1的苯硫酚与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为200:1 ;
[0045](2)将步骤(1)所得混合液在氮气氛围下，在低温12°C且黑暗条件中进行偶合反应 Ih,得到 Rhodamine6G_APS 溶液；
[0046](3)加入硅源前驱物正硅酸甲酯、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于55°C温度下搅拌反应5h，得到悬浊液；所述硅源前驱物正硅酸甲酯与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为800:1 ;硅源前驱物正硅酸甲酯、氨水和蒸馏水的体积比为1: 3: 40;
[0047](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径50nm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0048]经激光共聚焦检查，其罗丹明荧光纳米复合粒子具有明显的红色荧光，如图3(b)
[0049]实施例5
[0050](I)将摩尔比为4:1的半胱氨酸与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为150:1 ;
[0051](2)将步骤(1)所得混合液在氩气氛围下，在低温5°C且黑暗条件中进行偶合反应5h,得至Ij Rhodamine6G_APS 溶液；
[0052](3)加入硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于85°C温度下搅拌反应10h，得到悬浊液；所述硅源前驱物正硅酸乙酯与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为700:1 ;硅源前驱物正硅酸乙酯、氨水和蒸馏水的体积比为1: 4: 40;
[0053](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径50nm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0054]实施例6[0055](1)将摩尔比为1:1的半胱氨酸与罗丹明6G溶解在蒸馏水中，得到混合液；所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为180:1 ；
[0056](2)将步骤(1)所得混合液在氩气氛围下，在低温10°C且黑暗条件中进
[0057]行偶合反应6h，得到Rhodamine6G_APS溶液；
[0058](3)加入硅源前驱物硅酸钠、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于75°C温度下搅拌反应3h，得到悬浊液；所述硅源前驱物硅酸钠与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为400:1 ;硅源前驱物硅酸钠、氨水和蒸馏水的体积比为1: 3: 30;
[0059](4)将步骤(3)所得悬浊液离心分离(离心转速为8000rm/min)，用无水乙醇和蒸馏水各洗涤两次，得到粒径50nm左右的罗丹明荧光纳米复合粒子。
[0060]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤: (1)将摩尔比为1:5~5:1的巯基化合物与罗丹明6G溶解在蒸馏水中反应，得到混合液； (2)将步骤(1)所得混合液在保护气体氛围下，在低温5°C~15°C且黑暗条件中进行反应； (3)加入硅源前驱物、氨水和蒸馏水，置于密闭避光的容器中，于温度50°C_150°C条件和1.5-4.5个标准大气压条件下进行反应，所述硅源前驱物与步骤(1)所述罗丹明6G的摩尔比为300:1~900:1 ; (4)将步骤(3)所得产物离心分离、洗涤，得到罗丹明荧光纳米复合粒子。
2.根据权利要求1所述的一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于:步骤(I)所述巯基化合物为巯基乙醇、巯基乙酸、苯硫酚或半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述硅源前驱物为正硅酸 乙酯、正硅酸甲酯或硅酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于:步骤⑴所述蒸馏水和罗丹明6G的摩尔比为100:1~200:1。
5.根据权利要求1所述的一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述保护气体为氮气或氩气。
6.根据权利要求1所述的一种罗丹明荧光纳米复合粒子的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述硅源前驱物、氨水和蒸馏水的体积比为1:1: 20~1: 4: 50。
7.一种根据权利要求1~6任一项所述方法制备的罗丹明荧光纳米复合粒子。
8.根据权利要求7所述的罗丹明荧光纳米复合粒子在生物标记领域中的应用。
【文档编号】C09K11/02GK104004511SQ201410183249
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】胡云睿, 张念椿, 冯衍秋, 陈武凡, 冯前进, 龚剑, 张志德, 卢广文, 朱祥林 申请人:南方医科大学