一种检测内源性H2S的有机硅纳米染料探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物化工领域，涉及可用于构建生物体内利用光声来检测内源性H₂S的新型有机硅纳米染料探针，具体涉及一种检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针及其制备方法和应用。

背景技术：

氟化硼络合二吡咯甲川类(Boron-dipyrromethene，简称BODIPY)荧光染料是一类性能优异的新型荧光分子染料，这类染料具有很高的摩尔消光系数，能够提高染料光敏性能。具有较高的荧光量子产率。其光谱性质相当稳定，不易受溶剂极性和pH值的影响。可应用于生物分子标记，如DNA领域。其荧光光谱峰宽较小，这个优点使得染料在应用到分析领域的时候检测灵敏度更高。具有较好的光热稳定性和化学稳定性，避免受外界干扰而迅速光降解，保证了光信号的稳定。具有较小的分子质量与较低的细胞毒性。目前合成此类染料的研究工作仍存在不足，如水溶性差、检测范围比较局限大部分用于检测外源性的小分子等。

分子探针用两亲性聚合物可以显著改善分子的水溶性，用有机硅烷试剂包裹的纳米分子探针形成的核壳结构比较稳定，可以显著改善分子探针在水中的稳定性。光声成像作为一种把激发光信号转换为声波信号的成像方式，相对于传统光学成像技术，具有更深的组织穿透深度，更高的活体空间分辨等诸多优势，因而在生物和医学领域作为一种非侵入的成像工具得到了广泛的应用。目前开发针对目标分子可激活型的光声探针依然面临很大的挑战。

技术实现要素：

本发明第一个目的是提供一种检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针。

本发明第二个目的是提供一种检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针制备方法。

本发明第三个目的是提供一种检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针利用光声分析手段在检测活体中内源性硫化氢上的应用。

本发明的技术方案如下：

一种检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针，所述有机硅纳米染料探针结构：小分子探针BODPA包裹于由mPEG-DSPE2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)形成的胶束的疏水内腔中，外层为由PEG亲水长链和N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三正丁基溴化铵形成的硅壳；

所述化合物BODPA的结构式为：

R：Me(BODPA1)

：COOH(BODPA2)

进一步，所述有机硅纳米染料探针内部为染料分子BODPA和PEG疏水内腔，外部为PEG亲水长链与硅层。

更进一步，所述纳米球的粒径为0～100nm。

根据本发明所述检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针，所述检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针利用的是光声的分析手段来检测内源性硫化氢。

本发明还提供一种所述检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针，包括如下步骤：

BODIPY经过Vilsmeier-Haack醛基化反应后，再与吲哚盐或者吲哚羧酸盐缩合，在mPEG-DSPE和TBNBr中经自组装，得到所述检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针。

本发明还提供一种所述检测内源性H₂S的有机硅纳米染料探针在检测内源性H₂S的应用，特别是在检测活体中内源性H₂S的应用。

本发明独创性的利用BODIPY染料、两亲性聚合物和有机硅烷试剂，设计合成了一系列利用光声分析手段检测内源性H₂S的有机硅纳米探针，克服了现有技术所存在的缺点和不足。

本发明是BODIPY经过Vilsmeier-Haack醛基化反应，与吲哚盐或者吲哚羧酸盐缩合，mPEG-DSPE,TBNBr自组装等过程，得到可利用光声分析手段检测内源性H₂S小分子的有机硅纳米探针Si@BODPA。如图3所示。

本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明是利用mPEG-DSPE和TBNBr显著提高分子探针的水溶性和稳定性，并且首次实现了利用光声分析手段快速检测体外和活体中的硫化氢。

本发明有益的技术效果：

本发明是利用mPEG-DSPE和TBNBr显著提高分子探针的水溶性和稳定性及分子探针与硫化氢的反应速度，并且首次实现了光声分析体外和活体中的硫化氢。

附图说明

图1为本发明合成的有机硅纳米染料探针Si@BODPA结构及检测内源性硫化氢的原理。Si@BODPA与NaSH反应，BODPA上Cl原子被-SH取代，紫外吸收发生红移，到达近红外区，产生光声信号。

图2为有机硅纳米染料探针Si@BODPA结构示意图。

图3为合成有机硅纳米染料探针Si@BODPA的路线图。

图4中A是有机硅纳米染料探针Si@BODPA与硫化氢反应的紫外变化图。反应后紫外吸收发生了红移，到达近红外区，从而可以产生光声信号。

图4中B是使用不同当量的硅烷试剂对探针与硫化氢反应速度的影响。硅烷试剂用量越多，探针和硫化氢反应的速度越快，当硅烷的用量是探针的180倍时，反应可以在15秒内反应完。

图5为探针加入NaSH前后光声信号的变化。加入硫化氢后探针产生的光声信号是原来的44倍。

图6为光声探针Si@BODPA的选择性效果图。探针只会选择性的和硫化氢反应，产生光声信号而不会和其他活性氧，活性氮，活性硫反应，且半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽不会影响探针和硫化氢的反应。

图7为光声探针Si@BODPA在小鼠肿瘤部位原位注射与内源性硫化氢作用的效果图。说明探针在活体肿瘤原位注射可以和内源性硫化氢反应产生光声信号。

图8为BODPA2的氢谱，用的氘代氯仿。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.05-1.09(t,J＝8Hz,3H),1.52(s,3H),1.78(s,6H),2.41(q,J＝8Hz,2H),2.71(s,3H),4.30(s,2H),7.29(s,1H),7.42-7.44(m,2H),7.49-7.56(m,4H),7.61-7.63(m,4H),8.01-8.05(d,J＝16Hz,1H).

图9为BODPA2的碳谱，用的是氘代氯仿。¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ12.8,13.9,14.1,17.3,22.7,27.5,31.6,31.8,51.8,110.5,114.6,122.0,122.3,123.3,128.9,129.2,129.4,129.6,130.5,131.8,135.4,136.2,139.3,140.1,140.6,141.6,142.5,144.0,144.6,168.8,181.1.

图10为BODPA2的质谱。HRMS:calculated for C₃₃H₃₂BClF₂N₃O₂[M-Br]⁺: 585.2280,found:585.2272.

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，本领域技术人员应当理解，所述实施例仅用于示例，而不对本发明构成任何限制。

术语：

实施例1化合物BODPA2的合成

N₂气体保护下，在30ml绝对无水乙醇中加入A(386mg,1mmol)和B(298mg,1mmol；R＝COOH)回流五小时，冷却，旋干溶剂，柱层析提纯得到466mg黑色固体，产率70％。(A为本实验室自制，自制方法参考专利号：ZL 201410766204.6，B为购买)

实施例2化合物Si@BODPAs的合成

BODPAs(0.3μmol)快速加入到溶解mPEG-DSPE(19.1mg)的3mL 0.85N稀盐酸溶液中，超声10分钟，再加入一定量的TBNBr硅烷试剂，搅拌24小时，透析两天，得到光声探针溶液。

TBNBr分别称5.73mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝30/100,w/w),17.19mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝90/100,w/w),34.38mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝180/100,w/w)and 51.57mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝270/100,w/w),得到Si@BODPA30,Si@BODPA90,Si@BODPA180and Si@BODPA270。