一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用的制作方法

本发明涉及一种检测细胞内外源半胱氨酸、同型半胱氨酸荧光探针，具体涉及以1,8-萘酰亚胺为母核的新型荧光探针的制备方法及应用。

背景技术：

小分子硫醇在保持细胞内环境的氧化还原环境以及阻止活性氧簇过量表达从而导致的细胞损伤起到很关键的作用。细胞内的小分子生物巯醇，包括谷胱甘肽(glutathione，gsh)、半胱氨酸(cysteine，cys)以及同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)。其中半胱氨酸作为谷胱甘肽、辅酶a的重要组成部分，非正常的半胱氨酸浓度会导致组织或细胞损害，导致许多疾病的产生，例如肝损伤、老年痴呆症、帕金森综合症等等。而同型半胱氨酸作为心血管疾病和阿尔茨海默氏症等疾病的重要指标，受到广大研究人员的重视。由于荧光探针具有高效、安全、活体实时检测的优点，在近几年中有许多文献报道利用荧光探针检测细胞内外源的小分子生物硫醇。

萘酰亚胺作为一种双光子染料，具有较大的量子产率以及较长的斯托克斯位移，深受广大研究人员喜爱，经过对萘酰亚胺3、4位的修饰，可用于检测各种活性小分子以及细胞内的蛋白质等等。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种以1,8-萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备方法与用途，其中检测活性位点为硝基烯烃。

本发明采用的技术方案是：

一种如式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针，其结构式为：

本发明提供了式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将式(ⅱ)所示化合物在哌啶与硝基甲烷存在下，在无水乙醇中25-80℃下反应8-12h，反应液分离纯化，获得所述式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针。

式(ⅱ)所示化合物反应生成式(i)所示化合物的反应路线如下：

进一步，本发明所述式(ⅱ)所示化合物与硝基甲烷、哌啶的物质的量比为1:1.2-2:1.2-2。

更进一步，本发明所述反应液分离纯化为：反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行高效薄层层析分离，以体积比15：1的二氯甲烷甲醇混合液为展开剂，洗脱目标产物，获得式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针。

此外，本发明所述式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针在检测半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用。所述半胱氨酸为0～2mmol/l半胱氨酸水溶液。

进一步，本发明所述式(i)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针在检测细胞内半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用。所述半胱氨酸为细胞内0～1mmol/l半胱氨酸水溶液。

更进一步，本发明所述细胞为肝癌细胞hepg2。

本发明所述的半胱氨酸浓度的荧光检测的方法为：以化合物(i)作为荧光探针，与pbs缓冲溶液中的半胱氨酸溶液进行反应，生成荧光物质(ⅲ)，测定在激发波长为480nm下的荧光强度变化，从而获得半胱氨酸浓度。

上述反应过程反应式如下：

其次，在hepg2细胞内检测半胱氨酸浓度的方法为：在hepg2细胞内加入半胱氨酸或者n-乙基马来酰亚胺进行孵化，一段时间后，加入化合物(i)然后孵化半小时后进行荧光成像，激发波长为488nm，发射波长为520nm到610nm。

本发明荧光探针的结构中以3号位的取代基的推拉电子能力的改变以及硝基作为一个荧光淬灭基团从而导致荧光的淬灭。当半胱氨酸与化合物(i)反应后，硝基与萘酰亚胺的共轭体系被破坏，荧光恢复，从而达到荧光从关-开的效果。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明选用的1,8-萘酰亚胺结构是个双光子荧光团，具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移。我们合成的化合物(i)以硝基烯烃为活性位点，对半胱氨酸以及同型半胱氨酸具有良好的选择性，而对gsh则无明显反应；反应时间短，最低检测下限为1.5μm，为研究细胞中内源的半胱氨酸的生理作用提供一种有效的研究工具。

附图说明

图1为本发明中探针(i)的核磁氢谱。

图2为本发明中探针(i)的核磁碳谱。

图3为本发明中探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针40μm)中加入25倍当量半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽水溶液下的紫外吸收光谱以及荧光发射光谱图。

图4为本发明中探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针10μm)中激发波长为480nm条件下加入不同浓度半胱氨酸水溶液的荧光光谱。

图5为本发明中探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针10μm)中激发波长为480nm条件下加入不同氨基酸水溶液的荧光光谱。

图6为本发明中探针(i)在肝癌细胞(hepg2)中的共聚焦荧光成像效果图，实验分成三组，a组：在37℃、5％co2条件下，hepg2细胞中加入0.5mm半胱氨酸，培养半小时后用新鲜培养基洗涤，然后加入20μm探针(i)孵化半小时，最后用pbs洗涤三次进行荧光成像。b组：在37℃、5％co2条件下，hepg2细胞中加入20μm探针(i)孵化半小时，最后用pbs洗涤三次进行荧光成像。c组:在37℃、5％co2条件下，hepg2细胞中加入2mmn-乙基马来酰亚胺孵化1小时后用新鲜培养基洗涤，随后加入20μm探针(i)培养半小时后，用pbs洗涤三次进行荧光成像。荧光共聚焦显微镜成像激发波长为488nm，发射波长为520-610nm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

探针(i)的合成

在25ml圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.024g，0.4mmol)、哌啶(0.034g，0.4mmol)、8ml无水乙醇，40℃下加热反应12小时，蒸干溶剂，用薄层层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1，得到产物为0.03g，产率为27％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。

¹hnmr(500mhz,dmso)δ8.67(d,j＝12.6hz,1h),8.49(d,j＝7.8hz,1h),8.30(d,j＝7.4hz,2h),8.11(d,j＝12.6hz,1h),7.48(t,j＝7.6hz,1h),4.00(t,j＝7.3hz,2h),1.57(m,2h),1.33(m,2h),0.92(t,j＝7.3hz,3h).¹³cnmr(126mhz,dmso)δ177.54,164.03,162.68,140.93,140.30,132.11,131.65,131.37,130.73,128.92,123.09,121.15,113.74,102.42,38.74,29.94,19.86,13.76.

实施例2

探针(i)的合成

在25ml圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.041g，0.68mmol)、哌啶(0.058g，0.68mmol)、8ml无水乙醇，80℃下加热反应8小时，蒸干溶剂，用薄层层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1，得到产物为0.041g，产率为36.9％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。

实施例3

探针(i)的合成

在25ml圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.024g，0.4mmol)、哌啶(0.034g，0.4mmol)、8ml无水乙醇，25℃下加热反应12小时，蒸干溶剂，用薄层层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1，得到产物为0.02g，产率为18％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。

实施例4

探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针40μm)中各加入25倍当量(以下当量皆指相对于探针)半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽水溶液下的紫外吸收光谱以及荧光发射光谱图测定。

准确称取一定量的探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的探针母液，用移液枪吸取10μl加入到5ml中乙腈中，随后取200μl上述溶液加入到196μlpbs缓冲液(10mm，ph＝7.2)，分别加入4μl超纯水、25倍当量半胱氨酸、25倍当量同型半胱氨酸、25倍当量谷胱甘肽，常温下反应半小时后，测定混合液的紫外吸收光谱以及荧光发射光谱图，结果见图3。

实验证明，由于硝基基团的吸电子能力，萘酰亚胺类染料的3位通过碳碳双键与硝基形成共轭，导致探针本身的吸收变强以及荧光变弱。当探针与半胱氨酸反应后，硝基与萘酰亚胺的共轭被破坏，紫外可见光吸收降低同时荧光发射强度变强。

实施例5

探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针10μm)中加入不同当量半胱氨酸时激发波长为480nm的荧光检测效果。

准确称取一定量的探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的探针母液，用移液枪吸取20μl加入到10ml中乙腈中，随后取200μl上述溶液加入到196μlpbs缓冲液(10mm，ph＝7.2)，分别加入0、0.5、1、2、3、5、6、7.5、9、10、15、25、40、50、75、100、200倍不同当量半胱氨酸，常温下反应半小时后，在激发波长为480nm下测定混合液荧光发射光谱，结果见图4。

实验证明，在不断增加半胱氨酸浓度的情况下，由于碳碳双键被巯基亲核加成而破坏，硝基淬灭萘酰亚胺的荧光能力降低，荧光增强。

实施例6

探针(i)在pbs/乙腈混合液(ph＝7.2，v:v＝1:1,探针10μm)中的其它氨基酸的干扰性。

准确称取一定量的探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的探针母液，用移液枪吸取20μl加入到10ml中乙腈中，随后取200μl上述溶液加入到196μlpbs缓冲液(10mm，ph＝7.2)，分别加入不同种类氨基酸，包括苯丙氨酸(phe)、丝氨酸(ser)、赖氨酸(lys)、甘氨酸(gly)、谷氨酸(glu)、甲硫氨酸(met)、脯氨酸(pro)、缬氨酸(val)、色氨酸(trp)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、苏氨酸(thr)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)，加入量为探针的100倍当量，常温下反应半小时后，测定其荧光值。激发波长为480nm，发射波长为550nm，荧光谱图见图5。

实验证明，探针(i)对于氨基酸的抗干扰能力十分好，即对半胱氨酸以及同型半胱氨酸的专一性比较好。

实施例7

探针(i)在肝癌细胞(hepg2)中的成像分析

实验分成三组，a组：在37℃、5％co2条件下，hepg2细胞中加入半胱氨酸溶液(终浓度为0.5mm)，培养半小时后用新鲜培养基洗涤，然后加入探针(i)(终浓度20μm)孵化半小时，最后用pbs洗涤三次进行荧光成像。b组：在37℃、5％co2条件下，hepg2细胞中加入探针(i)(终浓度为20μm)孵化半小时，最后用pbs洗涤三次进行荧光成像。c组，hepg2细胞中加入n-乙基马来酰亚胺(终浓度为2mm)孵化1小时后用新鲜培养基洗涤，随后加入探针(i)(终浓度为20μm)培养半小时后，用pbs洗涤三次进行荧光成像。荧光共聚焦显微镜成像激发波长为488nm，发射波长为520-610nm。图6为细胞荧光共聚焦荧光成像效果图。

实验证明，首先，探针(i)能够很好的进入细胞内，其次，当增加细胞内半胱氨酸的浓度时，能够明显看到比较强的荧光，但是，当加入n-乙基马来酰亚胺去除细胞内的半胱氨酸时，探针加入细胞内则基本没有荧光，证明该探针能检测到内源性的半胱氨酸。