一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及溶酶体pH荧光探针，具体是一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，以及该探针在检测细胞内溶酶体pH中的应用。

背景技术：

体内pH值与细胞和细胞器的很多重要的生理过程紧密相关。不同的细胞和细胞器有不同的pH平衡值。溶酶体是一种典型的酸性细胞器，其pH值范围为4.5-5.5，异常的溶酶体pH值变化与一种被称为溶酶体贮积症的基因遗传病有关。因此有必要对溶酶体内酸性pH值的变化进行灵敏、准确的实时监测，这对于从分子水平上研究细胞的生理和病理过程具有重要的意义。

迄今为止，文献报道的溶酶体pH荧光探针大多数为单光子荧光探针，通常局限于短波激发(400-560nm)，光损伤和光漂白较大；同样也会对细胞造成光损伤和自体发光，无法应用于实时高分辨检测活组织pH。溶酶体为亚细胞器，检测亚细胞器的pH值容易受到细胞内部环境影响，准确检测亚细胞器内的pH变化就需要高的空间分辨率。而近十年出现的双光子技术由于可以同时吸收两个光子，使其激发波长位于近红外区(700-900nm)，在实现深层透射的同时，避免了紫外光对生物组织的损伤及背景荧光的干扰，可满足亚细胞器(如溶酶体)高分辨检测这一要求。然而具有双光子吸收性能的溶酶体pH荧光探针的报道多为非比率型双光子溶酶体pH荧光探针。这种基于荧光强度变化的单一信号输出容易受到细胞内部环境、探针负载不均、仪器稳定性等因素干扰无法实现定量检测；相反比率型荧光探针借助两个荧光峰的比值变化，结合比率荧光成像可有效地消除这些干扰因素，实现定量检测的目标。因此，迫切需要发展有效的比率型双光子溶酶体pH荧光探针，实现对溶酶体pH波动的灵敏检测。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，该溶酶体pH荧光探针应呈现比率荧光发射特性，能实现准确定量检测；目的之二是提供该探针的用途，即在利用双光子成像技术在检测细胞内溶酶体pH变化中的应用。

本发明提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针，其结构式为：

本发明提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷按摩尔比1～1.5:1:10～15溶于N,N-二甲基甲酰胺，100～140℃加热反应20～28小时；

(2)向反应液中加入饱和Na₂CO₃溶液调节溶液pH值至弱碱性，搅拌至少0.5小时，用CH₂Cl₂萃取3次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥后，减压蒸馏得到粗品；

(3)粗品经硅胶柱分离，得到纯品。

其合成路线如下：

所述步骤(1)中2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷的摩尔比为1.2:1:12，反应温度100，反应时间24小时。

所述步骤(2)中搅拌时间为1小时。

本发明的探针具有良好的细胞膜通透性，可靶向定位于溶酶体，并能应用于细胞内溶酶体pH的检测。

与现有的pH荧光探针相比，本发明合成的探针具有以下优点：(1)利用封管作为反应容器减少了溶剂使用量，有利于环境保护；(2)大的Stokes位移，有利于减小造影过程中激发光的干扰；(4)具有合适的pK_a值，适宜于检测溶酶体内pH变化；(5)良好的选择性，本探针对H⁺的响应不受常见金属离子和氨基酸的干扰；(6)本探针是基于分子内电荷转移(ICT)原理设计，在质子化和去质子化的过程中呈现比率荧光发射特性，实现准确定量检测；(7)在自然光和紫外灯下溶液颜色变化明显，可以通过肉眼观察；(8)该探针具有良好的双光子吸收性能，不仅可以单、双光子靶向标记溶酶体，同时能够利用双光子技术高分辨检测溶酶体内pH的变化。(9)本探针合成步骤简单，成本低廉，具有较大的实用价值。

附图说明

图1.本发明实施例1中探针在不同pH值条件下的紫外吸收光谱图。

图2.本发明实施例1中探针在自然光下识别H⁺前后颜色变化。

图3.本发明实施例1中探针在不同pH值条件下的荧光光谱图。

图4.本发明实施例1中探针在紫外灯下识别H⁺前后颜色变化。

图5.本发明实施例1中探针的荧光强度比值(F_454nm/F_514nm)与pH值的变化曲线图。

图6.本发明实施例1中探针在常见金属离子和氨基酸存在下对H⁺的选择性。

图7.本发明实施例1中探针的pH响应机理。

图8.本发明实施例1中探针与市售绿色溶酶体探针(Lyso Tracker Green DND-26)在pH值7.4的条件下共同孵育30min的单光子和双光子成像图。

图9.本发明实施例1中探针与HeLa细胞在不同pH值(pH 6.0,5.5,5.0,4.5,4.0)的条件下共同孵育30min的双光子成像图。

具体实施方式

实施例1

本发明探针的合成步骤如下：

(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑0.446g，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛0.237g和三甲基氯硅烷按摩尔2.28ml溶于N,N-二甲基甲酰胺，100℃加热反应24小时。

(2)向反应液中加入饱和Na₂CO₃溶液调节溶液pH值至弱碱性后，搅拌1小时，用CH₂Cl₂萃取3次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥后，减压蒸馏得到粗品。

(3)粗品经硅胶柱分离，得到纯品。¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ12.59(m,1H)，8.47(d,J＝1.2Hz,1H),8.24(d,J＝7.6Hz,1H),7.83(d,J＝16.4Hz,1H),7.77-7.79(dd,J＝1.2Hz,1H),7.64-7.69(dd,J＝8.2Hz,2H),7.59(d,J＝7.2Hz,1H),7.45-7.49(m,2H),7.22-7.26(m,2H),7.13-7.20(m,2H),4.59(t,J＝5.4Hz,2H),3.81(t,J＝5.4Hz,2H),3.46(t,J＝4.8Hz,2H),3.31(t,J＝4.6Hz,2H),3.12(s,3H)ppm.MS(MALDI-TOF)m/z 412.2022[M+H]⁺

实施例2

将实施例1中的探针用DMSO配制浓度为1mM的储备液。实验中用水/DMSO(V/V＝4/1)体系将探针稀释，使其终浓度30μM。用1mol/L的HCl调节该体系的pH值，记录不同pH条件下的紫外吸收光谱图(图1)。随着pH值由6.8降低到2.5，359nm处的吸收峰逐渐下降，396nm处的吸收峰依次增强，同时在380nm处存在一个明显的等电点。图2显示溶液颜色由无色变为黄色，左图是未加样品的无色溶液，右图为样品中加过HCl的黄色溶液。

实施例3

同样用水/DMSO(V/V＝4/1)体系将探针稀释到10μM进行荧光光谱滴定，固定激发波长为360nm，记录不同pH条件下的荧光发射光谱。如图3所示，在pH 6.8的中性条件下，该探针的最大荧光发射位于454nm处，随着pH的降低，454nm处的荧光发射逐渐降低，在514nm处出现一个新的荧光发射并显著增强，呈现显著的比率荧光发射特性(F_454nm/F_514nm)。同时在500nm处出现一个清晰的等电点。在紫外灯照射下，溶液的颜色由左面样品的蓝色变为右面样品的绿色(图4)。根据荧光强度比值(F_454nm/F_514nm)与不同pH值的拟合曲线计算pK_a值为4.46(图5)。

实施例4

考察实施例1中的探针(10μM)在常见金属离子和氨基酸存在时，对H⁺的选择性。如图6所示，分别在不同pH(pH 7.0,4.5和2.0)条件下，对常见金属离子和氨基酸几乎没有响应，证明该探针对H⁺具有很高的选择性。图6中各物质的顺序和浓度依次为：(1)blank；(2)K⁺(150mM)；(3)Na⁺(150mM)；(4)Mn²⁺(0.2mM)；(5)Zn²⁺(0.2mM)；(6)Ca²⁺(10mM)；(7)Cd²⁺(0.2mM)；(8)Co²⁺(0.2mM)；(9)Pb²⁺(0.2mM)；(10)Ni²⁺(0.2mM)；(11)Mg²⁺(2mM)；(12)Hg²⁺(0.2mM)；(13)Fe²⁺(0.2mM)；(14)Fe³⁺(0.2mM)；(15)Al³⁺(0.2mM)；(16)组氨酸(0.2mM)；(17)；亮氨酸(0.2mM)；(18)甘氨酸(0.2mM)；(19)精氨酸(0.2mM)；(20)赖氨酸(0.2mM)；(21)缬氨酸(0.2mM)；(22)丝氨酸(0.2mM)；(23)维生素C(2mM).

实施例5

将实施例1中的探针、市售绿色溶酶体探针与HeLa细胞在pH值7.4条件于37℃、5％CO₂的孵育箱中共同孵育30min，分别在单光子显微镜和双光子显微镜下观察荧光成像。固定激发波长分别为760nm和488nm，发射波段分别收集蓝色通道(420-460nm)和绿色通道(500-550nm)。如图8所示，与市售探针对比本探针可应用于溶酶体pH成像；第一行为双光子成像图，第二行为单光子成像图，双光子成像图荧光强度明显强于单光子成像图，说明本探针在双光子显微镜下强的穿透能力。

实施例7

将实施例1中的探针与HeLa细胞在分别在不同pH(6.0,5.5,5.0,4.5,4.0)的条件下在37℃、5％CO₂的孵育箱中共同孵育30min，然后用相应pH值的PBS缓冲溶液洗涤三次，在双光子显微镜下观察，固定激发波长为760nm，分别收集蓝色通道(420-460nm)和绿色通道(500-550nm)荧光。实验结果表明，pH 6.0时细胞发出明亮的蓝光和绿光，而随着pH值减小细胞蓝色荧光猝灭，绿色荧光明显增强，呈现比率荧光发射特性(图9)。