一种硅量子点/环糊精铜荧光簇及其制备方法和在检测巯基化合物中应用与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种硅量子点/环糊精铜荧光簇的制备方法及采用该荧光簇检测巯基化合物。

背景技术：

半胱氨酸是人体中一种重要的巯基氨基酸，有能力形成二硫键，有助于蛋白质结构构建和蛋白质折叠。食品工业中，半胱氨酸是良好的水果保鲜剂和食品添加剂。半胱氨酸衍生物谷胱甘肽也是一种巯基化合物，能消除人体自由基，可以提高人体免疫力，维护健康，抗衰老。因此精确测定半胱氨酸类巯基活性物质的含量具有现实意义。

对于巯基化合物的检测常需要一些大型仪器，比如高效液相色谱、液质联用、气质联用等，测量昂贵耗时。而荧光检测方法操作方便，具有高灵敏度。目前已有使用荧光分析方法实现对半胱氨酸的检测，wang等制备了磷氮共掺杂的碳量子点(sensorsandactuatorsb-chemical,2018:1627-1634)，与金纳米棒结合后发生荧光猝灭，fe³⁺和h2o2产生的羟基自由基可诱导金纳米棒腐蚀，导致碳量子点荧光恢复，加入半胱氨酸会抑制蚀刻进度，进而实现半胱氨酸的定量检测，但该方法过程较复杂，涉及贵金属，成本较高。borghei等(journaloffluorescence,2017,27(2):529-536)利用巯基和金属的强作用力形成的cys-cuncs团簇，团簇荧光强度与半胱氨酸浓度密切相关，从而实现定量检测半胱氨酸；但半胱氨酸在低浓度时量增荧光增强，但高浓度时量增荧光反而减弱，故不能连续检测，应用受限。“基于钙黄绿素-铜(ⅱ)荧光体系测定乙酰半胱氨酸”，杨晓红等利用二价铜离子能与钙黄绿素配位，使体系的荧光强度降低，巯基与cu²⁺的亲和力强，可从钙黄绿素-铜(ⅱ)的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来，使钙黄绿素游离出来荧光强度得以恢复，从而检测乙酰半胱氨酸的浓度。目前采用黄绿素-铜(ⅱ)的络合物或其它铜离子络合物方法检测巯基化合物时，铜离子会对测试结果直接干扰，另外铜离子还能与其它氨基酸形成络合物，其它氨基酸也会对巯基化合物检测结果产生干扰，限制其实际使用。

荧光分析方法中，荧光探针有着举足轻重的作用。常用的有机荧光探针亮度低或光稳定性差，降低了荧光传感器的灵敏度和稳定性，而半导体硅的量子点具有发光效率高、稳定性优越的特点，使得高性能的荧光传感器成为可能性。利用硅量子点/环糊精铜自组装形成荧光簇，荧光簇荧光强度随巯基化合物的含量增加而增强，从而实现高效便捷地定量测定巯基化合物的含量。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种硅量子点/环糊精铜荧光簇的制备方法及应用，利用表面有氨基修饰的硅量子点siqds-(nh2)n上氨基与β-环糊精铜cu2-β-cd桥上铜的配位作用，自组装形成siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇，利用荧光簇的荧光强度变化定量测定水溶性巯基化合物。这种方法成本低、操作简单和环境友好，且具有较宽的检测限。

本发明的依据是硅量子点溶液中加入巯基化合物，和初始硅量子点的荧光强度一致；而siqds-(nh2)n和cu2-β-cd形成荧光簇后，加入巯基化合物，荧光强度增强，且荧光强度的增量与巯基化合物的含量成比例。

本发明提供的一种siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的制备方法，按照下述步骤进行：

(1)制备含多氨基的硅量子点siqds-(nh2)n

烧瓶中加入适量的kh-550和去离子水，磁力搅拌水解，加入抗坏血酸溶液，继续搅拌30min，再转移到聚四氟乙烯内衬的高压水热釜中，放入120-180℃的马弗炉中保温12-24h；

(2)制备β-环糊精铜cu2-β-cd

配制10ml氢氧化钠和β-环糊精的混合溶液，再向其中加入硫酸铜溶液15ml，迅速形成氢氧化铜蓝色沉淀，室温下搅拌12h后，过滤除去氢氧化铜沉淀，滤液中加入乙醇，溶液中逐渐出现蓝色沉淀，静置后将其过滤，固体用少量乙醇洗涤，在40℃条件下干燥，得到蓝色固体粉末即为产物；

(3)siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的制备

将浓度为20g/l的siqds-(nh2)n和1×10^-3mol/l的cu2-β-cd按体积比为1:0.1-1:0.5充分混合进行自组装10-30min，在15～25℃室温条件下进行，自组装结束即得siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液。

作为优选，步骤(1)中950g/lkh550液体和去离子水的水解体积配比为2:18-4:16，混合总体积与抗坏血酸溶液体积比为4:1，抗坏血酸的浓度为0.05-0.1mol/l。

作为优选，步骤(2)混合液中氢氧化钠浓度为0.2-0.5mol/l，β-环糊精浓度为0.01-0.02mol/l；硫酸铜浓度为0.02-0.04mol/l。

上述的siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇可用于巯基化合物的定量检测，优选合成的硅量子点的最大激发波长为360nm。

其应用按如下步骤进行：

在上述siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液中加入不同浓度巯基化合物溶液(0-240μm)，溶液总体积保持一致且静置10-30min时间，然后测量体系的荧光发射光谱。以巯基化合物的浓度为横坐标，荧光增强率的10³倍为纵坐标，拟合线性方程，计算检测限。

作为优选，上述巯基化合物为l-半胱氨酸(l-cys)，d-半胱氨酸(d-cys)或谷胱甘肽(gsh)中的一种。

由上述技术方案可知：本发明首先采用kh-550为原料，通过水热法，制备氨基修饰的硅量子点siqds-(nh2)n；然后利用氨基氮上的孤对电子与β-环糊精铜桥上铜的配位作用，自组装形成siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇。在荧光簇的应用过程中，由于巯基化合物上巯基与β-环糊精铜配位能力更强，在siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液中，加入巯基化合物后，其原有的硅量子点/环糊精铜荧光簇解体，释放出自由的siqds-(nh2)n，从而使得溶液荧光增强。荧光强度的增量与巯基化合物的添加量成比例，因而，可实现溶液中巯基化合物的荧光检测。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了荧光法定量测定水溶性巯基化合物的方法，数据可靠稳定，方法操作简捷、制备容易、成本低，是一种环境友好型的测定方法。

(2)本发明提供的荧光法实现对巯基化合物特异性检测，其他常见离子和化合物几乎不产生干扰。

(3)本发明提供的测定巯基化合物的浓度范围在0-240μm，检测限为0.48μm。

附图说明

图1为不同浓度的l-半胱氨酸条件下荧光簇的相对荧光强度；

图2为不同浓度的l-半胱氨酸和荧光增强率的线性关系；

图3为不同浓度的d-半胱氨酸条件下荧光簇的相对荧光强度；

图4为不同浓度的d-半胱氨酸和荧光增强率的线性关系；

图5为不同浓度的谷胱甘肽条件下荧光簇的相对荧光强度；

图6为不同浓度的谷胱甘肽和荧光增强率的线性关系；

图7为共存物质(l-cys和未标明的干扰物均为300μm)的干扰测定图；

图8ph＝6条件下，硅量子点以及cu²⁺、cu²⁺和l-cys存在下的荧光光谱；

图9ph＝8条件下，硅量子点以及cu²⁺、cu²⁺和l-cys存在下的荧光光谱；

图10为siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的afm图；

图11为siqds-(nh2)n量子点的afm图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

(1)制备含多氨基的硅量子点siqds-(nh2)n

烧瓶中加入950g/lkh-550和去离子水，体积比2:18，共20ml，磁力搅拌水解，加入浓度为0.05mol/l的抗坏血酸溶液5ml继续搅拌30min，再转移到聚四氟乙烯内衬的高压水热釜中，放入120℃的马弗炉中保温24h；

(2)制备β-环糊精铜cu2-β-cd

配制10ml氢氧化钠和β-环糊精的混合溶液，混合溶液中，氢氧化钠的浓度为0.2mol/l，β-环糊精的浓度为0.01mol/l；再向其中加入0.02mol/l硫酸铜溶液15ml，迅速形成氢氧化铜蓝色沉淀，室温下搅拌12h后，过滤除去氢氧化铜沉淀，滤液中加入乙醇，溶液中逐渐出现蓝色沉淀，静置后将其过滤，固体用少量乙醇洗涤，在40℃条件下干燥，得到蓝色固体粉末即为产物；

(3)siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的制备

将浓度为20g/l(si含量计)的siqds-(nh2)n和1×10^-3mol/l的cu2-β-cd按体积比为1:0.1充分混合进行自组装10min，自组装结束即为siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液。

实施例2

(1)制备含多氨基的硅量子点siqds-(nh2)n

烧瓶中加入kh-550和去离子水，体积比3:17，共20ml，磁力搅拌水解，加入浓度为0.08mol/l的抗坏血酸溶液5ml继续搅拌30min，再转移到聚四氟乙烯内衬的高压水热釜中，放入150℃的马弗炉中保温18h；

(2)制备β-环糊精铜cu2-β-cd

配制10ml氢氧化钠和β-环糊精的混合溶液，其中，氢氧化钠的浓度为0.35mol/l，β-环糊精的浓度为0.015mol/l；再向其中加入0.03mol/l硫酸铜溶液15ml，迅速形成氢氧化铜蓝色沉淀，室温下搅拌12h后，过滤除去氢氧化铜沉淀，滤液中加入乙醇，溶液中逐渐出现蓝色沉淀，静置后将其过滤，固体用少量乙醇洗涤，在40℃条件下干燥，得到蓝色固体粉末即为产物；

(3)siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的制备

将浓度为20g/l的siqds-(nh2)n和1×10^-3mol/l的cu2-β-cd按体积比为1:0.2充分混合进行自组装20min，自组装结束即为siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液。

实施例3

(1)制备含多氨基的硅量子点siqds-(nh2)n

烧瓶中加入kh-550和去离子水，体积比4:16，共20ml，磁力搅拌水解，加入浓度为0.1mol/l的抗坏血酸溶液5ml继续搅拌30min，再转移到聚四氟乙烯内衬的高压水热釜中，放入180℃的马弗炉中保温12h；

(2)制备β-环糊精铜cu2-β-cd

配制10ml氢氧化钠和β-环糊精的混合溶液，其中，氢氧化钠的浓度为0.5mol/l，β-环糊精的浓度为0.02mol/l；再向其中加入0.04mol/l硫酸铜溶液15ml，迅速形成氢氧化铜蓝色沉淀，室温下搅拌12h后，过滤除去氢氧化铜沉淀，滤液中加入乙醇，溶液中逐渐出现蓝色沉淀，静置后将其过滤，固体用少量乙醇洗涤，在40℃条件下干燥，得到蓝色固体粉末即为产物；

(3)siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的制备

将浓度为20g/l的siqds-(nh2)n和1×10^-3mol/l的cu2-β-cd按体积比为1:0.5充分混合进行自组装30min，自组装结束即为siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液。

其中图10为siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的afm(原子力显微镜)图；图11为siqds-(nh2)n量子点的afm(原子力显微镜)图。从图中可以看出，荧光簇呈几百纳米不规则米粒状，siqds-(nh2)n量子点平均粒径为5.625nm。

实施例4

siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇的应用

在实施例31.5ml浓度0.0067g/ml(si含量计)的siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液中分别加入0-240μm不同浓度l-cys，d-cys以及gsh的溶液1.5ml，溶液总体积保持一致且静置30min时间后，360nm激发，测定体系的荧光发射光谱，图1，3，5分别为l-cys，d-cys，gsh在荧光簇检测条件下的相对荧光光谱。以巯基化合物的浓度(0-240μmol/l)为横坐标，荧光增强率的10³倍为纵坐标(荧光增强率＝(aμm相对荧光强度-0μm相对荧光强度)/0μm相对荧光强度*100％)，拟合线性方程，计算检测限，图2，4，6分别为l-cys，d-cys，gsh的浓度和荧光增强率的关系图，拟合的线性方程相似，有一致的检测限(0.48μmol/l)，说明检测机理一样。另外，对比图2和图4发现，荧光簇中环糊精铜虽是手性主体材料，但巯基化合物手性对检测结果没干扰。

实施例5

siqds-(nh2)n/cu2-β-cd对l-cys的荧光测定

实施例3中的siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液360nm激发，最大荧光发射峰处的峰高设定为1。在上述荧光簇溶液中加入l-cys(浓度为0.24μμ)，静置10min后，360nm激发，最大荧光发射峰的峰高相对于siqds-(nh2)n/cu2-β-cd为1.19。

由此可知，巯基化合物可使得siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液荧光增强。

对比例1

siqds-(nh2)n对l-cys的荧光测定

将浓度为0.02g/ml的siqds-(nh2)n，360nm激发，最大荧光发射峰处的峰高设为1.0；浓度为0.02g/ml的siqds-(nh2)n中加入l-cys(浓度0.24μm)，360nm激发，最大荧光发射峰的峰高相对于siqds-(nh2)n体系也为1.0，说明l-cys的加入并未使得siqds-(nh2)n荧光增强，因此，siqds-(nh2)n不能用于l-cys的荧光测定。

对比例2

(1)制备含多氨基的硅量子点siqds-(nh2)n，同实施例1。

(2)siqds-(nh2)n-cu(ⅱ)的制备；

siqds-(nh2)n溶液的ph呈较强的碱性，将浓度20g/l的siqds-(nh2)n和0.002mol/l的cuso4按体积比2:1混合，得到的混合液的ph值在8～9之间，由于是弱碱性条件，cu²⁺可能以cu(oh)2的纳米粒子或胶束存在，cu(ii)能与量子点的氨基氮上的孤对电子配位，形成siqds-(nh2)n-cu(ⅱ)；

如果将siqds-(nh2)n溶液用hcl溶液预调呈弱酸性，将浓度20g/l(si含量计)的siqds-(nh3⁺)n和0.002m的cuso4体积比2:1混合，混合液ph值在5～6之间，由于cu²⁺与siqds-(nh3⁺)n都是带正电荷，所以仅以siqds-(nh3⁺)n形态存在，量子点荧光不会发生淬灭。

(3)采用siqds-(nh2)n-cu(ⅱ)对l-cys的荧光测定

向siqds-(nh2)n-cu(ⅱ)溶液中加入l-cys，l-cys的浓度为0.24μm，360nm激发，测得siqds-(nh2)n-cu(ⅱ)的荧光谱图。

检测结果：

在弱酸条件下加入铜(ii)，量子点荧光没淬灭，反而略有增加，加入l-cys后荧光恢复(如图8所示)，无法用于l-cys的荧光测定。

在碱性条件下加入铜(ii)，荧光猝灭，但加入l-cys后荧光无变化(如图9所示)。cu(oh)2的纳米粒子或胶束cu(ii)能与量子点的氨基氮上的孤对电子配位，发生能量转移，导致荧光淬灭。但加入l-cys荧光无变化，这是由于半胱氨酸l-cys的巯基与cu(ii)的结合能力低于氨基，所以不会有荧光响应。而cu2-β-cd的cu(ii)是以特有的铜桥键形式存在，它与巯基结合能力大于氨基，因而能对巯基化合物有荧光响应，且铜离子不会对测试结果直接干扰。

实施例6

巯基化合物的检测的干扰实验

在实施例3中的siqds-(nh2)n/cu2-β-cd荧光簇溶液中加入l-cys(浓度为300μm)，静置40min后，360nm激发，最大荧光发射峰处的峰高设为1.0；在上述加有l-cys(浓度为300μm)的荧光簇溶液中，再分别加入k⁺，na⁺，mg²⁺，cu²⁺，so4^2-，co3^2-，cl^-，trp，phe，asp，lys，ala，glu，thr，组成共存体系，各物质的浓度均为300μm，上述溶液体系静置40min后，360nm激发，最大荧光发射峰相对峰高值分别为0.9909，1.0100，1.0194，0.6133，0.9877，1.0074，1.0262，0.9931，1.0425，1.0295，1.0951，1.0750，1.0384，1.0503，1.0818；作图得到图7，等摩尔浓度的其他氨基酸会导致荧光强度稍增，误差在3.8-9.5％之间；等摩尔浓度的离子干扰在1.0％左右，但cu²⁺在300μm会对结果有很大干扰，但由于人体血液中游离cu²⁺的浓度和食物中cu²⁺的浓度极低，当以3μm的cu²⁺干扰检测时，检测误差<2％，因此，实际检测中cu²⁺对检测干扰很小。

实施例中未注明具体的条件，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明中所用方法，若无特别限定说明，均为本领域的常规方法。以上所述仅为本发明的较好实施方式，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例作的修改，均包含在本发明的保护范围之内。