一株异养硝化、产菌丝球真菌及其培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】一株异养硝化、产菌丝球真菌是青霉属Penicilliumsp.L1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为：CGMCC?No.8615；该真菌的培养方法是：将Penicilliumsp.L1接种于培养基中，20-38℃，80-150rpm振荡培养，获得青霉属Penicilliumsp.L1；该真菌用于含有氨氮微生物污水中单株脱除水体中的氨氮，并能在有机或无机碳源条件下进行脱氮。本菌株L1能够在好氧条件下较好地利用氨氮作唯一氮源，进行硝化活动，并将氮素形式最终转化为氮气。
【专利说明】一株异养硝化、产菌丝球真菌及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种异养硝化、产菌丝球真菌及其培养方法和应用，进一步地说，是一 种用于处理废水中含氨氮微生物的一株异养硝化真菌菌株及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002] 含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题，生物脱氮是目前被公认为废水脱氮 中最经济、最有效的方法之一。目前普遍采用的生物脱氮技术特点是，脱氮过程是由两类不 同的微生物一自养硝化菌和异养反硝化菌通过各自的硝化与反硝化的偶联代谢作用使氨 氮转化为氮气。
[0003] 近几十年来，从土壤、深海火山口、污泥、湖水等处分离得到了多种具有硝化活性 的异养微生物，包括有细菌、放线菌和真菌等，被称为异养硝化菌。这是一类具有重要应用 价值的微生物资源，它们可以利用很多基质，包括无机氮和有机氮，如铵、胺、酰胺、N-烷基 羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。
[0004] 异养硝化菌易于培养，增殖较快，底物利用范围广，在废水生物脱氮系统中可以稳 定存在。异养硝化过程和自养硝化过程相比，可以在较低的温度和溶氧浓度（〇.5~2.8mg/ L)下发生，并且对废水的水质要求更宽，C/N比在2.0以上都可以发生，因此在有机物浓度 和氨氮浓度都较高的污水处理中，异养硝化脱氮和自养硝化脱氮相比具有一定的优势。因 此采用异养硝化菌开发设计简捷的废水脱氮新工艺，可实现生物脱氮工艺的快速启动和稳 定运行，提高脱氮效率，降低运行成本，有望克服传统处理工艺中存在的问题，实现废水高 效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题作出贡献。
[0005] 而某些真菌，在水溶液中生长时伴随有搅拌或震荡，其菌丝体则会缠绕在一起，形 成紧密的小球，俗称为菌丝球。菌丝球有区别于其他菌种所没有的某些优越的性能。如吸 附性能，当与细菌混合培养时，细菌可吸附在菌丝球上，使细菌不容易流失，从而增强细菌 某些降解性能；生物沉降性，当环境静置时，菌丝球则会沉降在最底部，易于与水体分离； 另外还有脱色、脱除金属离子等作用。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一株异养硝化、产菌丝球真菌及其培养方 法和应用。
[0007] 本发明所提供的一株异养硝化、产菌丝球真菌，其所述真菌是青霉属 sp. L1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为：CGMCC No.8615。
[0008] 本发明所提供的一种用于上述的异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述方 法是：将sp. L1接种于培养基中，20-38°C，80-150rpm振荡培养；其中所述 培养基为： 牛肉膏 3 g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨 10 g/L，蒸馏水 lOOOmL，调节 PH 7.2-7.4，121°C 灭菌 20分钟；或者 碳源蔗糖0.5-5 g/L，氮源硫酸铵0.1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/L，KCl 0.5g/L， MgS04 · 7H20 0· 5g/L，FeS04 · 7H20 0· 01g/L，H20 1000mL，调 pH 为 7· 0-7. 4，121°C 灭菌 20 分钟；或者 碳源蔗糖0.5-10 g/L，苯胺0.1-2 g/L，氮源硫酸铵0.1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/ L，KC1 0· 5g/L，MgS04 · 7H20 0· 5g/L，FeS04 · 7H20 0· 01g/L，H20 1000mL，调 pH 为 7. 0-7. 4， 121°C灭菌20分钟；或者 碳源蔗糖〇. 5-10g/L，苯酚0. 1-1 g/L，氮源硫酸铵0. 1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/L， KC1 0.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，FeS04.7H20 0.01g/L，H20 1000mL，调pH为 7.0-7.4，121°C 灭菌20分钟。
[0009] 如上述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，所述培养方法中的青霉 sp. L1在固体平板培养基上呈现的菌落是圆形，初期为白色，质地疏松，3? 5天后，呈墨绿色，表面呈粉状；菌落直径约为3. 5-3. 8cm，厚度为l-2mm。
[0010] 所述培养方法中的青霉sp. L1在固体平板培养基上呈现的菌落是 菌丝，菌丝发达，具隔，有分枝；分生孢子梗较短；分生孢子从小梗顶端溢出，几个不等，有 帚状体分支。
[0011] 所述培养方法中的青霉Penicillium sp. L1在液体培养基中产生一定数量菌丝 球，大小不等，最大直径约2. 5_，静置时会沉入瓶底，培养液则透明澄清。
[0012] 本发明所提供的一种用于上述异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用是脱 除污水中的氨氮；并能利用有机氮源或无机氮源进行生长。
[0013] 如上述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的应用，所述应用的最佳脱氮条件是蔗糖 作碳源，硫酸铵作氮源，适宜C/N为8~80,适宜pH为3. (Γ10. 0,温度2(T40°C，摇床转速120 转每分钟。
[0014] 如上述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用的最佳温度进一步为 30°C，最佳初始pH值进一步为7.0。
[0015] 如上述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用的最佳C/N为41。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的L1平板图片。
[0017] 图2是本发明的L1菌丝球图片。
[0018] 图3是本发明显微镜下的孢子图片。
【具体实施方式】
[0019] 下面对本发明的【具体实施方式】作出进一步的说明。
[0020] 本发明所提供的一株异养硝化、产菌丝球真菌是从太原市焦化废水处理厂的废水 池的活性污泥中分离得到，被命名为L1，具体地说，该菌株是青霉属sp. L1， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 8615 ;保 藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101 ; 保藏时间是2013年12月20日。
[0021] 本发明中的菌株是一种具有脱氮生物活性的真菌，单株能够脱除水体中的氨氮并 能在有机或无机碳源条件下脱氮。在脱氮过程中，未检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。
[0022] 本发明一种用于上述的异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述方法是：将 sp. L1接种于培养基中，20-38°C，80-150rpm振荡培养获得。
[0023] 其中所述培养基为： A、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，NaCl 5g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，121°C灭菌 20分钟。
[0024] B、察氏培养基(蔗糖 3g，NaN03 0.3g，Κ2ΗΡ04 0· lg，KC1 0.05g，MgS04 · 7H20 0.05g，FeS04*7H20 0.001g，H20 100mL。临用时在已熔化的培养基中加入链霉素溶液，以 抑制细菌和放线菌的生长，每l〇〇ml培养基中加1%的链霉素液0. 3ml) C、异养氨化培养基：改良的察氏培养基(蔗糖〇.9782g，（NH4)2S04 0 . 47 2g，Κ2ΗΡ04 0· lg，KC1 0· 05g，MgS04 · 7H20 0· 05g，FeS04 · 7H20 0· 001g，H20 100ml，调 pH 为 7. 0-7. 4。） 上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂2. 0%。
[0025] 以焦化废水处理厂的废水池的活性污泥为样品，取10mL污泥，接入灭过菌的上述 牛肉膏蛋白胨A中，于30°C，120r/min摇床内震荡富集培养三天。然后再接入上述的察氏 培养基B中，继续培养三天。取富集培养的菌悬浮液lml于10ml比色管中，加无菌水至标 线混匀，稀释到梯度10'再从梯度ΚΓ 1取lml于10ml比色管中，加无菌水至标线混匀，稀 释到梯度ΚΓ2,依次类推。稀释至十个梯度，各取0.2 ml稀释菌液涂布于异养氨 化琼脂平板培养基上。将涂布好的平板放入生化培养箱中，于30°C下培养三天。选取合适 浓度梯度的平板，无菌条件下，将平板上每种菌落分别单独挑入装有异养氨化液体培养基 的小试管中，于30°C，120r/min摇床中继续培养。
[0026] 每隔24h，从上述小试管中取0. 5ml培养液至洁净白瓷盘中，分别滴入一滴纳氏试 齐[J、Griess-Ilosvay试剂和二苯胺试剂，以不接菌种的空白培养基作对照，进行脱氮及硝化 活性确认。若滴入纳氏试剂后，呈现的黄色越浅，说明水样中剩余的氨氮含量越少，即菌体 氨氮的降解或转化效果越好。若滴入Griess-Ilosvay试剂后，显红色乃至褐色，则说明水 样中有亚硝酸盐，即菌体经硝化作用产生了亚硝酸盐，颜色越深亚硝酸盐含量越高。滴入二 苯胺试剂，若显蓝色，说明有硝酸盐存在，即菌体硝化过程有硝酸盐产生，且蓝色越深硝酸 盐含量越高。实验记录数据并进行初步定性分析，确认脱氮效果较好的异养硝化菌。经富 集、分离纯化实验，得到一批氨氮去除效果较好，硝化过程能够产生少量Ν0 χ-Ν的菌株。选 取其中1株脱氮效果最好的菌株，经大连宝生物有限公司代替进行的26S rDNA-ITS区基因 序列分析，鉴定该菌株为青霉属sp.命名L1。
[0027] 青霉sp. L1菌落形态特征（附图1):菌株L1在固体平板培养基 上呈现的菌落特征：菌落为圆形，初期为白色，质地疏松，3到5天后，呈墨绿色，表面呈粉 状。菌落直径约为3. 5-3. 8cm，厚度为l_2mm。
[0028] 青霉sp. L1菌体形态特征（附图2):菌丝发达，具隔，有分枝；分生 孢子梗较短；分生孢子从小梗顶端溢出，几个不等，有帚状体分支。
[0029] 青霉sp. L1菌体形态特征（附图3):在液体培养基中，产生一定数 量菌丝球，大小不等，最大直径约2. 5_，静置时会沉入瓶底，培养液则透明澄清。
[0030] 菌株Z2的脱氮活性：菌株Z7具有异养脱氮的能力，并且在脱氮过程中几乎不积累 硝酸盐和亚硝酸盐。
[0031] 最佳脱氮条件：鹿糖作碳源，硫酸铵作氮源，最佳C/N为41，最适pH为7. 0,温度 30°C，摇床转速120转每分钟。
[0032] 菌株L1能够在好氧条件下较好地利用氨氮作唯一氮源，进行硝化活动，并将氮素 形式最终转化为氮气。
[0033] 本发明所述的菌株Z2应用在污水处理领域，在氨氮浓度130mg/L的环境中，经过 36h生长，可将氨氮降解至5. 61mg/L，氨氮去除率高达95. 68%，最快脱除速率为13. 80mg/L/ h，整个过程中几乎没有亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累。
[0034] 当溶液中氨氮l〇〇mg/L，同时存在苯酚1000mg/L，经过5天降解，溶液中氨氮浓度 剩余10. 61mg/L，苯酚浓度剩余843. 84mg/L。课件L1对高浓度苯酚有着很好的耐受性，并 且对苯酚还有着一定的降解能力。
[0035] 当溶液中氨氮l〇〇mg/L，同时存在苯胺1000mg/L，经过5天降解，溶液中氨氮浓度 剩余17. 94mg/L，苯胺浓度剩余352. 56mg/L。显示出L1对高浓度苯胺有着很好的耐受性， 而且对其有着较好的降解能力。
[0036] 污水中通常含有一些有毒的有机物，L1对苯、苯胺等有着较好的耐受性，在实际应 用中有着较好的应用前景。
[0037] 检测方法 NH4+-N :采用纳氏试剂光度法 NCV-N :采用N-(l-萘基）_乙二胺光度法 no3_-n :采用紫外分光光度法 TN :T0C-TN测定仪 以上方法均参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》（第四版）。
[0038] 应用实施例如下： (1)青霉sp. L1的硝化性能检测如下： 配制模拟废水I，以硫酸铵为唯一氮源，初始浓度为130mg/L，碳氮质量比为16,在pH 为7. 0?7. 4,以1 %的接种量接种于100mL新鲜液体培养基，30°C、120r/min摇床内振荡培 养。经24h培养，将氨氮降解至101. 57mg/L ;经36h后，最终氨氮浓度降为5. 61mg/L，降解 率为95. 68%，最快降解速率高达13. 8mg/L/h。
[0039] 模拟废水 I :蔗糖 4. 891 g/L，（NH4)2S04 0· 472 g/L，K2HP04 0· 5 g/L，NaCl 0· 5 g/ L，MgS04 · 7H20 0· 5 g/L，FeS04 · 7H20 0· 01 g/L，调 pH 为 7. 0 ?7. 4。
[0040] (2)碳氮比对青霉LI硝化性能影响 培养基中的氮源浓度保持为130mg/L不变，调整培养基中的碳源质量，使碳氮比分 别为24、32、41、48、56，其余条件不变。以2%的接种量接种于10〇1^新鲜液体培养基， 30°C、120r/min摇床内振荡培养。32h后测量溶液中氨氮的剩余浓度。所对应浓度分别为 63.42mg/L、30.57mg/L、14.78 mg/L、13.77mg/L 和 12.89mg/L。显示出 L1 在较高的碳氮比 下有着对氨氮更好的降解效果。
[0041] (3)青霉sp. L1同时降解氨氮与苯胺的研究 在模拟废水I中另外添加苯胺，使苯胺浓度分别为200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/ L和1000mg/L。以2%接种量接种，30°C、120r/min摇床内振荡培养。5d后测量溶液中氨氮 和苯胺浓度。氨氮浓度分别为 3. 18mg/L、12. 43mg/L、13. 74mg/L、16. 55mg/L、17. 94mg/L ;苯 胺浓度分别为 149. 67mg/L、328. 78mg/L、545. 18mg/L、490. 49mg/L、352. 56mg/L。显示出 LI 同时降解氨氮与苯胺很好的能力。
[0042] (4)青霉sp. L1同时降解氨氮与苯酚的研究 在模拟废水I中另外另外添加苯酚，使苯酚浓度分别为200mg/L、600mg/L和lOOOmg/ L。以2%接种量接种，30°C、120r/min摇床内振荡培养。2d后，溶液中氨氮浓度分别剩余 9. 85mg/L、11. 37mg/L、10. 61mg/L ;5d 后，溶液中苯酚浓度分别剩余 95. 27mg/L、391. 59 mg/ L、843. 84mg/L。说明L1即使在高浓度苯酚存在的情况下依然保持较好的氨氮降解能力，并 且对苯酚还有着一定的降解能力。
【权利要求】
1. 一株异养硝化、产菌丝球真菌，其所述真菌是青霉属sp. L1，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为：CGMCC No. 8615。
2. -种用于权利要求1所述的异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述方法是： 将L1接种于培养基中，20-38°C，80-150rpm振荡培养；其中所述培养基 为： 牛肉膏 3 g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨 10 g/L，蒸馏水 lOOOmL，调节 PH 7.2-7.4，121°C 灭菌 20分钟；或者 碳源蔗糖0.5-5 g/L，氮源硫酸铵0.1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/L，KCl 0.5g/L， MgS04 · 7H20 0· 5g/L，FeS04 · 7H20 0· 01g/L，H20 1000mL，调 pH 为 7· 0-7. 4，121°C 灭菌 20 分钟；或者 碳源蔗糖0.5-10 g/L，苯胺0.1-2 g/L，氮源硫酸铵0.1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/ L，KC1 0· 5g/L，MgS04 · 7H20 0· 5g/L，FeS04 · 7H20 0· 01g/L，H20 1000mL，调 pH 为 7. 0-7. 4， 121°C灭菌20分钟；或者 碳源蔗糖〇. 5-10g/L，苯酚0. 1-1 g/L，氮源硫酸铵0. 1-2 g/L，其余成分1(2即04 lg/L， KC1 0.5g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，FeS04.7H20 0.01g/L，H20 1000mL，调pH为 7.0-7.4，121°C 灭菌20分钟。
3. 如权利要求2所述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述青霉 sp. L1在固体平板培养基上呈现的菌落是圆形，初期为白色，质地疏松，3? 5天后，呈墨绿色，表面呈粉状；菌落直径约为3. 5-3. 8cm，厚度为l-2mm。
4. 如权利要求2所述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述青霉 sp. L1在固体平板培养基上呈现的菌落是菌丝，菌丝发达，具隔，有分枝；分 生孢子梗较短；分生孢子从小梗顶端溢出，几个不等，有帚状体分支。
5. 如权利要求2所述的一种异养硝化、产菌丝球真菌的培养方法，其所述青霉 Penicillium sp. L1在液体培养基中产生一定数量菌丝球，大小不等，最大直径约2. 5mm, 静置时会沉入瓶底，培养液则透明澄清。
6. -种如权利要求1所述的一株异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用是脱除 污水中的氨氮；并能利用有机氮源或无机氮源进行生长。
7. 如权利要求6所述的一株异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用的最佳脱氮 条件是蔗糖作碳源，硫酸铵作氮源，适宜C/N为8~80,适宜pH为3. (Γ10. 0,温度2(T40°C，摇 床转速120转每分钟。
8. 如权利要求7所述的一株异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用的最佳温度 进一步为30°C，最佳初始pH值进一步为7.0。
9. 如权利要求7所述的一株异养硝化、产菌丝球真菌的应用，其所述应用的最佳C/N为 41。
【文档编号】C02F101/38GK104195048SQ201410117125
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】刘玉香, 李风雷, 范宝芸, 李亚青, 吕永康, 牛飞龙 申请人:太原理工大学