一株BB菌在降低赤泥pH值中的应用的制作方法

文档序号：12850951阅读：388来源：国知局

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株bb菌在降低赤泥ph值中的应用。

背景技术：

赤泥是氧化铝工业中产生的主要固体废渣，一般平均每生产1吨氧化铝会附带产生1～2吨赤泥。中国是世界上最大的氧化铝生产国之一，每年排放的赤泥高达数万吨，而大多数赤泥都被运输到堆场筑坝堆存，这不仅造成严重的资源浪费、大量土地被占用，环境也会受到不同程度的污染。因为赤泥在堆存时，赤泥内的有害成分会随着水流向下渗透，使土壤和地下水受到污染，进而影响植被生长和土地利用，同时赤泥表层粉尘飞扬还会对大气造成污染。近几年，国内已出现了多例赤泥堆场溃坝事故，对附近环境及居民安全造成了很大的威胁。赤泥典型的化学性质是其浸出液的ph值较高，不同堆场的赤泥ph值平均大于10.5，我国几家大型氧化铝企业生产过程中排放的赤泥浸出液ph值范围均在10.29～12.24之间，而其较高的ph值是制约其综合利用的关键因素。因此，如何加强赤泥堆场的环境治理和生态重建已成为我国当前所面临的紧迫任务之一，也是我国实现可持续发展战略应优先关注的问题之一，而降低赤泥ph值是进行下一步利用及生态恢复的关键前提。

赤泥堆场生态恢复是最具前景且行之有效的赤泥大规模处置方式。生态恢复能够显著降低赤泥表层风力和水力侵蚀，减少环境污染，有利于赤泥基质有机碳库的建立，并提供适宜的生态景观。然而，赤泥的强碱性严重限制了先锋植物的生长，因此在进行赤泥堆场生态恢复时必须先对赤泥进行改良，降低赤泥ph值，使其具备植物生长的基本条件。

国内外针对赤泥堆场ph值的降低进行了一些相关研究，很多物质被用来改良赤泥理化特性降低赤泥ph值，包括磷石膏、有机肥等。然而，基质改良所需改良剂较多，成本较高，不易大规模推广使用，改良剂的添加会造成潜在的环境风险。

近年来，hamdy等人在赤泥土壤中发现了可以降低赤泥ph的微生物，添加营养物质或干草改良剂可以使微生物生长，并产生可以降低赤泥ph值的有机酸[mkhamdyandfswilliams,bacterialameliorationofbauxiteresiduewasteofindustrialaluminaplants[j].journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2001,27:228～233]，但是没有检测出这种微生物的具体种类。krishna等人在赤泥污染土壤修复中发现塔宾曲霉(aspergillustubingensis)也具有降低赤泥ph的效果[krishnap,reddyms,patnaiksk.aspergillustubingensisreducesthephofthebauxiteresidue(redmud)amendedsoils[j].water,air,&soilpollution,2005,167(1):201-209]。

因此，需要从众多微生物中筛选出更多种的能够用来降低赤泥ph值的微生物，以拓宽微生物的应用范围，提高其应用价值。

技术实现要素：

本发明目的是提供一株bb菌在降低赤泥ph值中的应用，对赤泥进行改良，具有效果好、不会造成赤泥的二次污染等优势，应用前景良好。

为实现上述目的，本发明采用一株pannonibacterphragmitetusbb菌，pannonibacterphragmitetusbb菌(以下简称bb菌)从湖南省长沙市原长沙铬盐厂铬重污染土壤中分离得到，其保藏号为cgmccno.3052、保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心、保藏时间为2009年5月5日。

本发明提供一株bb菌在降低赤泥ph值中的应用。

一株bb菌在降低赤泥ph值中的应用，包括以下步骤：

步骤一：将bb菌接种于灭菌后的第一液体培养基中，于30℃、175rpm·min^-1振荡培养至od600达到1.8，得到初始bb菌液；

步骤二：将初始bb菌液按第二培养基总体积的20％的接种量接种于第二液体培养基中，得到含bb菌的处理液；

步骤三：将含bb菌的处理液按比例加入到赤泥中，所述赤泥与含bb菌的处理液的比例为1g:(0.8～2)ml。

进一步地，所述赤泥与含bb菌的处理液的比例为1g:2ml。

进一步地，所述第一液体培养基组分为3.0g/l的葡萄糖、5.0g/l的酵母膏及3g/l的nacl，其余为水。

进一步地，所述第二液体培养基组分为2.5～15g/l的葡萄糖、1.5～9g/l的酵母膏，其余为水。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明利用耐盐碱微生物bb菌的代谢作用对赤泥进行改良，其对赤泥高碱性环境有极强的耐受能力，可以将赤泥ph值降低3个单位以上，同时能够有效增加赤泥中有机质含量，为后续的生态恢复奠定基础。该方法不需要使用化学试剂或能量，成本较低，不会造成赤泥的二次污染，是一种环境友好型修复方法。

附图说明

图1是本发明bb菌在培养过程中的生长曲线图。

图2是本发明bb菌在培养过程中第二液体培养基的ph值变化图。

图3是本发明bb菌在振荡培养时第二液体培养基中有机酸种类及含量曲线。

图4是本发明bb菌在静置培养时第二液体培养基中有机酸种类及含量曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

赤泥取自河南省郑州市上街区赤泥堆场，测得赤泥的原始ph值是11.57，有机质含量为1.13％，样品采集后装入样品袋内于4℃冰箱中保存待用。第一液体培养基：3.0g/l的酵母膏，5.0g/l的葡萄糖，3g/l的nacl，其余为水。第二液体培养基：2.5～15g/l的葡萄糖、1.5～9g/l的酵母膏，其余为水。培养基中酵母膏作为bb菌生长的氮源，葡萄糖作为bb菌生长的碳源。

主要试剂：酵母膏，分析纯，购自上海生工生物技术有限公司(中国)。

实施例一

本实施例的目的在于判定bb菌有无降低赤泥中ph值的可能性，因此在将bb菌用于赤泥之前，需要提前检测第二液体培养基中bb菌的生长情况、ph是否发生了变化、以及找到哪些因素引起了ph值变化。

在250ml的三角瓶内装入100ml的第一液体培养基，挑取bb菌接种于灭菌后的第一液体培养基中，于30℃、175rpm·min^-1振荡培养至od600达到1.8，作为初始bb菌液。

配置第二液体培养基：15g/l的葡萄糖、3g/l的酵母膏，其余为水。在4个500ml三角瓶内分别装240ml第二液体培养基并灭菌，编号0-1、0-2、b-1和b-2，在无菌操作台中分别向b-1和b-2中加入60ml的初始bb菌液，0-1和0-2不加菌作为对照。并将0-1和b-1置于175rpm·min^-1、30℃的恒温振荡培养箱中培养，0-2和b-2在30℃恒温培养箱中静置培养。在培养过程中分别按下列时间取样：4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、72h、84h、96h、108h、120h，取样均在无菌操作台中进行。每次取样10ml，其中9ml用于0-1、0-2、b-1和b-2的od600和ph值检测，1ml用于b-1和b-2的有机酸测定。

1.1bb菌在培养过程中的生长曲线测定

图1为bb菌在培养过程中的生长曲线图。如图1所示，不加菌的0-1和0-2在培养过程中几乎没有菌体生长，od600都接近于零；加菌静置培养的b-2处理至培养结束bb菌都没有大量生长，可能是由于静置培养使培养液内氧含量较低，bb菌需要较长的适应期。加菌振荡培养的b-1在前72h内只有微量的菌体出现，72h后开始生长，84h后大量繁殖进入指数增长阶段，而96～108h增长速度变缓，108～120h之间趋于稳定。通过对比0-1和b-1可以看出，bb菌株在强碱条件下可以很好的生长，可以用于ph值较高的赤泥环境中。同时通过对比b-1和b-2可以发现，振荡培养对bb菌的生长非常重要。

1.2bb菌在培养过程中第二液体培养基的ph值变化测定

图2为bb菌在培养过程中第二液体培养基的ph值变化图。如图2所示，在整个培养过程中，静置培养的0-2和b-2处理ph变化情况几乎一致，最终都稳定在10.1。从bb菌的生长曲线分析中得出，振荡处理对bb菌的影响很大，由于加菌静置培养的b-2处理在培养过程中bb菌没有大量生长，其ph值下降也不明显。而加菌振荡培养的b-1处理，经过72h的适应期后，随着bb菌的大量繁殖，其ph值开始迅速下降，96h时降至8.3，之后趋于稳定。无菌振荡培养0-1在0-72h之间ph值由11.91降至9.61，之后趋于稳定。

1.3bb菌在培养过程中第二液体培养基中有机酸种类及含量测定

在对第二液体培养基中进行有机酸含量测定前，需要对样品进行处理。处理方法如下：采用无水乙醇沉淀蛋白质法，吸取所取1ml样品于2ml离心管内，在小型台式离心机中12000rpm条件下离心10min，取上清液400μl，按1:4的比例加入1.6ml无水乙醇，在室温下静置3h。然后在在小型台式离心机中12000rpm条件下离心10min，将上清液用0.22μm滤膜过滤并置于样品瓶内，用超高液相色谱(uplc)测定样品中有机酸的种类及含量。

色谱柱为acquityuplchsst3(2.1×100mm，1.8μm)(i.d,waters,usa)，流动相为kh2po4缓冲溶液(1.0mol·l^-1磷酸调节ph值至2.0)和乙腈。梯度洗脱程序如下：0～3.5min，99％kh2po4缓冲溶液；3.5～4.0min，kh2po4缓冲溶液减少至80％；4.0～5.5min，加快kh2po4缓冲溶液减少速率，由80％减至20％；5.5～15.0min，增加kh2po4缓冲溶液的比例至99％。流速为0.07ml·min^-1，进样量10μl，uv检测波长210nm，柱温30℃。

图3为bb菌在振荡培养时第二液体培养基中有机酸种类及含量曲线。图4为bb菌在静置培养时第二液体培养基中有机酸种类及含量曲线。如图3和图4所示，振荡培养中检测到草酸、乙酸和柠檬酸三种酸，静置培养时只检测到草酸和柠檬酸，酸的产生明显增加了培养基中有机质的含量。两种培养方式中草酸的含量均较高，但在整个培养过程中振荡培养内草酸含量均高于静置培养；柠檬酸的含量在两种培养方式中均较低，整体上呈增加的趋势。在振荡培养中还检测到了乙酸的存在，但在前72h内其含量均为零，72h后才检测到乙酸的存在，至培养结束其含量都稳定在1.33mg/l。整个培养过程中，振荡培养和静置培养内的总酸量均不断增加，且振荡培养内的总酸量高于静置培养。

采用spassstatistics21进行pearson相关性分析，结果见表1和表2。由表1可知，

振荡培养时，液体培养基中ph值和草酸、乙酸及总酸之间相关系数较大，均达到了极显著相关水平(p<0.01)。由表2可知，静置培养时，液体培养基中ph值和草酸及总酸之间的相关系数较高，达到了极显著水平(p<0.01)。而两种培养方式中液体培养基中ph与柠檬酸之间均没有达到显著水平，相关性较差。表明液体培养基中ph值的下降和总酸高度相关，振荡培养时ph值的下降主要是由草酸和乙酸共同作用引起的，静置培养时ph值的下降主要是由草酸引起的。

表1振荡培养时液体培养基中ph值和有机酸的相关系数及显著性检验

表2静置培养时液体培养基中ph值和有机酸的相关系数及显著性检验

综上，bb菌的生长需要在振荡条件下进行，第二液体培养基中ph值的下降与bb菌生长过程中产生的草酸和乙酸共同作用引起的。因此，bb菌是可以用于降低赤泥ph值的。然而在实际应用中，bb菌在赤泥中生长是不可能在震荡条件下进行的，故选择将bb菌先在第一液体培养基中生长一段时间后，再加入到赤泥中。

实施例二

bb菌在降低赤泥ph值中的应用包括以下步骤：