一种嗜油生物降解土壤中大量原油的方法及其激活剂与流程

本发明属于生物修复石油污染土壤领域，涉及一种激发嗜油生物降解土壤中大量原油的方法及其激活剂。

背景技术：

石油污染土壤是全球面临的重大环境问题。目前，生物修复是一种低成本，易操作并且环保的土壤治理技术，在修复石油污染土壤中被广泛应用。然而，生物修复周期较长，土著菌生长缓慢，限制了生物修复技术在石油污染土壤修复过程中的应用。有学者研究，经过56天的纯生物修复，主要的石油菌量较低(1.1×10³cfug/soil)，tph的降解率仅为3％，而经过168天的生物修复，石油菌的数量仍为1.1×10³cfug/soil，此时tph的降解率仅为4.25％。可见，提高石油菌的生长速率，提高石油降解很重要。

目前研究提高石油降解和石油菌的增长速率的方式为：1)改变石油的生物可获得性。有学者研究，添加300mg/kg表面活性剂浓度时，石油的降解率仅提高14.2％，但表面活性剂会降低土著石油菌的活性(生物脱氢酶活性从2.0减少到1.8)。2)加菌。有学者研究，经过55天的生物修复，菌量增长缓慢(菌量从1.94×10⁸cfug/soil增加到5.01×10⁸cfug/soil)，tph的降解率也很低(tph的降解率为11％)。因为外加的石油菌难以适应当地的环境，导致其生物活性不高，因此不能提高石油的生物有效降解。3)单纯加营养。还有学者研究，外加营养后，经过60天的生物修复，菌的增长率较慢(16.7％)，tph中长链烃的降解率也较低(8％)。表明单纯的外加营养不能刺激石油菌大量繁殖，也不能有效大量原油的有效降解。可见，现有的方法不能从根本上解决大量原油的生物降解。

如何设计出一种营养成分浓度适宜的情况下使大量的高活性的嗜油生物快速生长，且消耗少量的营养便能更有效的降解土壤中的大量烷烃，成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种激发嗜油生物降解土壤中大量原油的方法。通过设计一种合适浓度的营养成分的激活剂，能激发高活性的嗜油生物快速生长，且消耗少量的营养成分。这些激活的嗜油生物能消耗土壤中大量原油，达到高效降解土壤石油的目的，通过该方法实现嗜油生物消耗少量的氮和乙酸就可以高效降解土壤中大量原油。

本发明是通过下述技术方案来实现的。

一种嗜油生物降解土壤中大量原油的方法，包括以下步骤：

1)激活剂的制备：

将铵盐、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比(1～4)：(10～14)：(3～6):(20～50)混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂与含油土壤和蒸馏水按照质量比(2～5)：(4～6)：(50～70)加入容器中，进行混合，并置于振荡器上间歇振荡充氧，常温条件下进行20～30天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程；土壤中四种嗜油生物菌被激活。

进一步，所述铵盐为氯化铵、硝酸铵或硫酸铵。

进一步，所述葡萄糖为果糖、d-葡萄糖或半乳糖。

进一步，所述油土壤包括高油土壤中石油烃占含量为13.8g/kg，低油土壤中石油烃占含量为8.5g/kg。

进一步，所述步骤2)在130～140r/min振荡器上间歇6h振荡充氧一次。

进一步，所述土壤中被激活的四种嗜油生物菌包括可培养的假单胞菌pseudomonas，不可培养的diaminobutyricimonas、成对杆菌dyadobacter和galbitalea。

本发明进而提供一种所述方法采用的激活剂，包括以下质量比的原料：

铵盐1～4份；乙酸10～14份；葡萄糖3～6份；蒸馏水20～50份。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下有益效果：

本发明添加含有适量氨氮，乙酸等营养成分的激活剂来激发嗜油生物快速生长而且维持高活性，考察这些嗜油生物能否在低氮条件下快速降解碳氢为主的原油化合物，实现嗜油生物降解，从而提高土壤中大量原油的生物降解。进一步地，本发明通过配置激活剂，加入激活剂，测取生物种类，呼吸活性和增长率，测取消耗的tph量及同时消耗的氨氮、乙酸等营养量。

添加激活剂后，四种菌假单胞菌pseudomonas，不可培养的diaminobutyricimonas、成对杆菌dyadobacter和galbitalea被激活，高活性的嗜油生物迅速生长，增长率高达48％和36％，是不添加激活剂的非嗜油生物降解组的2.6～2.8倍和7.2倍。在添加激活剂的嗜油生物降解过程中，五类有机质组分基本没有变化，可见，嗜油生物降解组石油菌几乎不用来分解有机质，能够达到嗜油生物降解大量原油。且这些高活性大量生长的石油菌可以快速“吞吃”大量原油，去除量均高达3313mg/kg和2741mg/kg。土壤中大量原油嗜油生物降解后土壤中的细菌增长量不小于3.2logcfu/gsoil；细菌增长率不小于35％；细菌活性不小于0.5mgco2/kgsoil；大量原油降解量不小于2611mg/kg。从而实现土壤中大量原油的嗜油生物降解。该方法高效率，易操作，且节能减排，具有较大推广价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1a为实施例1、对比例1、3嗜油生物降解中石油菌的增长率与原油去除关系图；

图1b为实施例1、对比例1、3嗜油生物降解中石油菌的呼吸活性与增长量图；

图2a为实施例4、对比例2、4嗜油生物降解中石油菌的增长率与原油去除关系图；

图2b为实施例4、对比例2、4嗜油生物降解中石油菌的呼吸活性与增长量图；

图3a为实施例1、对比例1、3嗜油生物降解中大量原油里各烷烃降解量图；

图3b为实施例1、对比例1、3嗜油生物降解中大量原油里不同占比的烷烃总去除量图；

图4a为实施例4、对比例2、4嗜油生物降解中大量原油里各烷烃降解量图；

图4b为实施例4、对比例2、4嗜油生物降解中大量原油里不同占比的烷烃总去除量图；

图5为嗜油生物降解过程中菌的高通量分析图；

图6为嗜油生物降解中有机质组分的变化机理图；

图7为非嗜油生物降解中有机质组分的变化机理图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明的一种嗜油生物降解土壤中大量原油的方法，包括以下步骤：

1)激活剂的制备：

将铵盐氯化铵、硝酸铵或硫酸铵、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比(1～4)：(10～14)：(3～6)：(20～50)混合均匀，即得激活剂；

其中，葡萄糖为果糖、d-葡萄糖或半乳糖。

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比(2～5)：(4～6)：(50～70)加入容器中，进行混合，置于130～140r/min振荡器上间歇6h振荡充氧一次，常温条件下进行20～30天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

其中，含油土壤包括高油土壤和低油土壤，高油土壤中石油烃占含量为13.8g/kg，低油土壤中石油烃占含量为8.5g/kg。

下面通过测定方法，验证嗜油生物降解性能。

向每个土壤样品中加入20ml二氯甲烷，将样品摇动12h，然后进行超声处理15分钟并机械振荡30分钟(250rpm)。使用分液漏斗连续三次提取油溶液，然后通过无水硫酸钠(在105℃的烘箱中预烘烤2小时)脱水。将提取的油溶液的最终体积调节至50ml，进行tph提取和分析。测定总碳和无机碳：溶解有机碳计算为总碳和无机碳之间的差。乙酸测定采用安捷伦6890n气相色谱仪(双检)经0.45μm滤膜过滤后的样品在510nm处测定吸光度进行葡萄糖浓度的测定。通过0.45μm的滤膜过滤反应瓶中的上清液。通过紫外分光光度法分析nh4⁺-n。使用平板稀释法测定土壤微生物计数，通过取对数获得微生物的生长速率通过co2产量表征细菌呼吸活动。

可以从以下几方面看出采用本发明方法嗜油生物降解作用。

(1)激活剂对嗜油生物的影响

添加激活剂后，高活性(0.75mgco2/kg)的嗜油生物迅速生长，增长率高达48％和36％，是不添加激活剂的非嗜油生物降解组的2.6--2.8倍和7.2倍，且这些高活性大量生长的石油菌可以快速“吞吃”大量原油(c18-c30)，去除量均高达3313mg/kg和2741mg/kg，从而实现土壤中大量原油的嗜油生物降解。

(2)嗜油生物过程对营养物质氨氮和乙酸消耗分析

添加激活剂的嗜油生物降解过程中氨氮和乙酸消耗量均较低(仅为22mg/kg和410mg/kg)，是非嗜油生物降解的1/8和4/5，见图7所示。说明嗜油生物降解过程中石油菌消耗少量氨氮和乙酸就可以快速利用大量的碳氢化合物(原油)。

(3)嗜油生物过程中嗜油生物种类的分析

生物多样性分析可知嗜油生物降解组的土壤中四种菌(可培养pseudomonas，不可培养diaminobutyricimonas、dyadobacter和galbitalea)可迅速生长且活性很高，见图5所示，可见增长率高达48％和36％，是不添加激活剂的非嗜油生物降解组的2.6～2.8倍和7.2倍。而非嗜油生物降解组并没有，这是嗜油生物降解高效去除土壤中大量原油的原因。

(4)嗜油生物过程中有机质变化的分析

在添加激活剂的嗜油生物降解过程中，五类有机质(芳香蛋白类物质ⅰ、芳香蛋白类物质ⅱ、富里酸类物质、溶解性微生物代谢产物、腐殖酸类物质)组分基本没有变化，见图6所示。可见，嗜油生物降解组石油菌几乎不用来分解有机质，这是嗜油生物降解的大量原油降解效果好的原因。

下面通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1

所用含油为土壤高油土壤，铵盐为氯化铵，葡萄糖为果糖。

1)激活剂的制备：

将铵盐氯化铵、乙酸、果糖和蒸馏水按照质量比1：12：6：30混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于140r/min振荡器上间歇6h振荡充氧一次，常温条件下进行20天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，石油菌增长量高达3.3logcfu/gsoil，增长率高达48％，且活性也很高(0.8mgco2/kgsoil)，大量原油(c18～c30)的去除量高达3313mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。见图1a、图1b、图3a、图3b所示。

实施例2

所用含油为土壤高油土壤，铵盐为硝酸铵，葡萄糖为d-葡萄糖。

1)激活剂的制备：

将铵盐硝酸铵、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比2：11：5：40混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇6h振荡充氧一次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，石油菌增长量高达3.2logcfu/gsoil，增长率高达46％，且活性也很高(0.75mgco2/kgsoil)，大量原油(c18-c30)的去除量高达3310mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。

实施例3

所用含油为土壤高油土壤，铵盐为硫酸铵，葡萄糖为半乳糖。

1)激活剂的制备：

将铵盐硫酸铵、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比3：14：4：50混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于130r/min振荡器上间歇6h，振荡充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，石油菌增长量高达3.24logcfu/gsoil，增长率高达45％，且活性也很高(0.7mgco2/kgsoil)，大量原油(c18～c30)的去除量高达3309mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。

实施例4

所用含油为土壤低油土壤(8.6g/kg)，铵盐为氯化铵，葡萄糖为果糖。

1)激活剂的制备：

将铵盐氯化铵、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比1：12：6：30混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于140r/min振荡器上间歇振荡6h，充氧1次，常温条件下进行25天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，低油浓度土壤添加激活剂后，石油菌增长量高达3.6logcfu/gsoil，增长率高达36％，活性高达0.6mgco2/kgsoil，土壤中大量原油(c18～c30)的去除量高达2741mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。见图2a、图2b、图4a、图4b所示。

实施例5

所用含油为土壤低油土壤，铵盐为硝酸铵，葡萄糖为d-葡萄糖

1)激活剂的制备：

将铵盐乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比2：11：5：40混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于130r/min振荡器上间歇振荡6h，充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，低油浓度土壤添加激活剂后，石油菌增长量高达3.5logcfu/gsoil，增长率高达35％，活性高达0.5mgco2/kgsoil，土壤中大量原油(c18～c30)的去除量高达2611mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。

实施例6

所用含油为土壤低油土壤，硫酸铵，葡萄糖为半乳糖。

1)激活剂的制备：

将铵盐、乙酸、葡萄糖和蒸馏水按照质量比3：14：4：50混合均匀，即得激活剂；

2)将步骤1)制备的激活剂、含油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇振荡6h，充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，石油菌增长量高达3.7logcfu/gsoil，增长率高达37％，活性高达0.7mgco2/kgsoil，土壤中大量原油(c18-c30)的去除量高达2820mg/kg，即激活剂激发了高活性嗜油生物快速繁殖，可以高效降解土壤中的大量原油。

对比例1：针对高油土壤，采用非激活剂对土壤大量原油的生物降解过程。

采用实施例1中方法制备非激活剂：

1)将氯化铵和蒸馏水按照质量比2：50混合均匀，即得非激活剂；

2)将步骤1)制备的非激活剂、高油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇6h，振荡充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，添加非激活剂时石油菌生长慢且活性低，石油菌生长量仅为1.2logcfu/gsoil，生长率仅为19％，活性仅为0.4mgco2/kgsoil。此时石油菌不能吞噬大量原油，土壤的大量原油的降解量仅为1732mg/kg，没有实现嗜油生物降解，见图1a、图1b、图3a、图3b所示。

对比例2：针对低油土壤，采用非激活剂对土壤大量原油的生物降解过程。

采用实施例1中方法制备非激活剂：

1)将硝酸铵和蒸馏水按照质量比3：60混合均匀，即得非激活剂；

2)将步骤1)制备的非激活剂、低油土壤和蒸馏水按照质量比3：5：60加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇6h，振荡充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，添加非激活剂时石油菌生长慢且活性低，生长量仅为1.3logcfu/gsoil，生长率仅为13％，活性仅为0.2mgco2/kgsoil。此时石油菌不能吞噬大量原油，土壤的大量原油的降解量仅为1356mg/kg，没有实现嗜油生物降解。见图2a、图2b、图4a、图4b所示。

对比例3：针对高油土壤，不添加激活剂对土壤大量原油的生物降解过程。

将高油土壤和蒸馏水按照质量比1：12加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇6h，振荡充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，添加非激活剂时石油菌生长慢且活性低，大量原油降解量更低，仅降解了1186mg/kg，石油菌增长了0.45logcfu/gsoil，生长更慢，活性更低(增长率仅为7％，活性为0.2mgco2/kgsoil)，没有实现嗜油生物降解过程，见图1a、图1b、图3a、图3b所示。

对比例4：针对低油土壤，不添加激活剂对土壤大量原油的生物降解过程。

将低油土壤和蒸馏水按照质量比1.5：12加入容器中，进行混合，置于135r/min振荡器上间歇6h，振荡充氧1次，常温条件下进行28天的土壤大量原油的嗜油生物降解过程。

反应结束后，添加非激活剂时石油菌生长慢且活性低，大量原油的降解量(714mg/kg)更低，石油菌增长了0.5logcfu/gsoil，增长率仅为5％，活性为0.1mgco2/kgsoil，没有实现嗜油生物降解过程，见图2a、图2b、图4a、图4b所示。

下面通过表1本发明不同实施例与对比例比较说明土壤大量原油的嗜油生物降解性能。

表1性能比较

通过表1中的实施例1～6与对比例1～4进行对比，可以看出，土壤中大量原油嗜油生物降解后土壤中的细菌增长量不小于3.2logcfu/gsoil；细菌增长率不小于35％；细菌活性不小于0.5mgco2/kgsoil；大量原油降解量不小于2611mg/kg。土壤中大量原油通过嗜油生物降解后的细菌增长量、细菌增长率、细菌活性和大量原油降解量都得到了较大幅度的改善，因此，本发明方法具有较好的应用潜力，值得推广应用。

本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。