专利名称：使运载流体循环的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种循环运载流体的装置。更特定地，本发明涉及一种具有二个或多个室或区域的循环运载流体的装置，一种利用所述装置扩增核酸的装置，以及包含所述装置的芯片。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)方法，通过进行周期性的热-冷温度循环已经用来扩增核酸序列。在PCR中，DNA扩增的1个循环需要生物化学样品暴露于不同的温度，例如T1(进行变性)→T2(进行退火)→T3(进行延伸)。
如图1中所示，常规PCR体系具有这样的结构，其中聚合酶链反应方式是控制保留生物化学流体，例如PCR流体的室中的温度(进行变性的T194℃，进行退火的T255℃，进行延伸的T372℃)。在该体系中，对室的反复加热及冷却导致加热和冷却效应的延时，因此需要复杂的电路来精确控制温度。
美国专利5,270,183公开了一种利用聚合酶链反应扩增样品中核酸的装置和方法，如图2中所示，其中聚合酶链反应通过使生物化学流体，例如PCR流体沿着不同的温度区域，连续不断地迂回流动来实现。因此，该体系需要特别长的管路，以使生物化学流体遵循精确温度变化模式，因为从T3区域移到T1区域必须通过T2区域。
此外，如图3中所示，公开了一种PCR体系，其中聚合酶链反应通过在同心环中沿不同温度区域连续流动生物化学流体，例如PCR流体而实现(Proc.Miniaturized Total Analysis Systems(uTAS 2001)，Luisiaba StateUniversity，Steven A.Soper等，第459页-第461页)。在该体系中，当重复一个完整的循环时，流动路线变短。因此，必须精确地控制生物化学流体的流速以使其遵循温度变化模式。
发明内容
本发明提供一种循环运载流体的装置，以及操作该装置的方法，所述装置具有保持在不同的温度的二个或多个室或区域。此外，本发明提供一种用该装置扩增核酸的装置以及包含所述装置的芯片。
本发明一方面提供了一种具有保持在不同的温度的二个或多个室的能循环运载流体的装置，其中每个室包括一个入口阀，包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔(入口气动气压孔)；一个出口阀，包括控制运载流体从室中流出的气动气压孔(出口气动气压孔)；其中所有的室相继连接，使得一个室的出口阀按照流体流动方向连接到相邻室的入口阀。
本发明另外提供一种用来操作上述运载流体循环装置的方法，其中包括按照流体流动方向，向一个室的入口气动气压孔施加压力并使相邻室的出口气动气压孔排气，同时使运载流体从该室流动到相邻室；控制施加到相邻室的出口气动气压孔的压力，使运载流体在相邻室中保留预定的时间；依次重复施压及控制步骤使运载流体流动。
本发明另外提供了一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，包括三个室，每个室包括一个入口阀和一个出口阀，入口阀带有控制运载流体向室内流入的气动气压孔；出口阀带有控制运载流体从室中流出的气动气压孔；其中所有的室相继连接，以致按照流体流动的方向，一个室的出口阀连接到相邻室的入口阀；并且其中所述的三个室包括保持在变性温度的第一室，保持在退火温度的第二室，以及保持在延伸温度的第三室。
本发明另外提供一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，包括两个室，每个室包括一个入口阀和一个出口阀，入口阀有控制运载流体向室内流入的气动气压孔，出口阀有控制运载流体从室中流出的气动气压孔；其中一个室的出口阀连接到另一个室的入口阀；并且其中一个室保持在变性温度，另一个室保持在进行退火和延伸的温度。
本发明另外提供一种循环运载流体的装置，包括具有维持在不同的温度二个或多个区域的微型管路，一个区域保留样品流体，其他的一个或多个区域保留磁性流体；与微型管路连接的入口/出口阀；以及一个布置在微型管路外面的磁体，它形成磁性场，以作用于磁性流体。
本发明另外提供一种用来操作上述循环运载流体装置的方法，其中包括向磁体施加能量，使磁性流体流动，从而使运载流体向相邻区域移动。
本发明另外提供一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，所述装置包括具有三个区域的微型管路，一个区域保留样品流体，其他的区域保留磁性流体；与微型管路连接的入口/出口阀；以及一个布置在微型管路外面的磁体，它形成磁场以作用于磁性流体，其中所述三个区域包括保持在变性温度的第一区域，保持在退火温度的第二区域，以及保持在延伸温度的第三区域。
本发明另外提供一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，所述装置包括具有二个区域的微型管路，一个区域保留样品流体，另一个区域保留磁性流体；与微型管路连接的入口/出口阀；以及一个布置在微型管路外面的磁体，它形成磁场以作用于磁性流体，其中一个区域保持在变性温度，另一个区域保持在退火和延伸的温度。
本发明另外提供一种芯片，它包括载体，放置在载体上的用来扩增核酸的上述装置之一；一种电泳工具，与装置可操作地相互连接。
图1举例说明常规的PCR体系；图2举例说明另一种常规的PCR体系；图3举例说明另一种常规的PCR体系；图4及5的示意图中，生物化学流体，例如PCR流体，在保持在适合PCR的不同温度下的二个或多个区域间流动；图6及7举例说明气动气压型PCR体系中每个室单元的基本构成；图8示意性地举例说明在有一个室的装置中操作的原理；图9及10分别示意性地举例说明在有二个或三个相互连接的室单元的装置中操作的原理；图11举例说明具有三个相互连接的室的运载流体循环装置的示意图；图12示意性地举例说明环形PCR装置的操作原理；以及图13示意性地举例说明在磁性流体型PCR体系中利用磁性流体循环生物化学流体，例如PCR流体的操作原理。
实施本发明的最佳方案本发明的装置包括二个或多个维持在不同温度的室，运载流体在其中循环。即，循环运载流体的装置包括二个或多个维持在不同的温度的室，每个室包括一个入口阀，包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔(入口气动气压孔)；一个出口阀，包括控制运载流体从室中流出的气动气压孔(出口气动气压孔)；其中各室相继连接，致使按照流体流动的方向，一个的室出口阀连接到相邻室的入口阀。
运载流体包括，可以保持在保温区进行一段预定时间的反应的任何流体。运载流体可包括生物化学流体，例如进行聚合酶链反应的流体，包括模板DNA，寡核苷酸引物，dNTP[脱氧腺苷三磷酸酯(dATP)，脱氧胞苷三磷酸酯(dCTP)，脱氧鸟苷三磷酸酯(dGTP)，脱氧胸苷三磷酸酯(dTTP)]，以及热稳定DNA聚合酶。
在本发明的运载流体循环装置中，每个室的出口阀可与后续室的入口阀整合在一起。
入口阀及出口阀都可为被动操作阀。此外，被动操作阀可以是这样的阀，它使出口阀的管路在此处比入口阀的管路狭窄或将出口阀的内表面用疏水材料处理以控制运载流体的流动的阀。
在本发明的装置中，运载流体通过控制施加到每个室的压力而循环。运载流体循环装置的操作方法包括按照流体流动方向，向一个室的入口气动气压孔施加压力并使相邻室的出口气动气压孔排气，同时使运载流体从所述室流动到所述相邻室；控制施加到所述相邻室的出口气动气压孔的压力以使运载流体在该相邻室中保持一段预定的时间；依次重复施压及控制步骤使运载流体循环。
运载流体可分别通过室的入口和出口气动气压孔导入或放出。
本发明在其发明范围内，也包括一种利用运载流体循环装置扩增核酸的装置。所述扩增装置可用于经聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸，并包括三个室。每个室包括一个入口阀以及一个出口阀，入口阀包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔，出口阀包括控制运载流体从室内流出的气动气压孔。各个室相继连接，这样按照流体流动的方向，一个室的出口阀连接到相邻室的入口阀。所述的三个室包括保持在变性温度的第一室，保持在退火温度的第二室，以及保持在延伸温度的第三室。
此外，所述扩增装置可用于经聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸，它包括二个室。每个室包括一个入口阀以及一个出口阀，入口阀包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔，出口阀包括控制运载流体从室内流出的气动气压孔。一个室的出口阀连接到另一个室的入口阀。一个室保持在变性温度，另一个室保持在退火和延伸温度。
本发明扩增核酸的装置可为微缩的环形PCR循环仪，其中生物化学流体，例如PCR流体，沿着维持在不同温度的二个或三个室循环。例如，DNA扩增可以如下所述完成1个循环将样品流体沿第一室(保持在变性温度，T1)→第二室(保持在退火温度，T2)→第三室(保持在延伸温度，T3)循环，或将样品流体沿第一室(保持在变性温度，T1)→第二室(保持在退火和延伸温度，T2’)进行循环。在PCR装置中进行多轮的循环，样品中的DNA量成指数倍地扩增。
或者，可在微型管路中提供二个或多个维持在不同温度的区域。即，循环运载流体的装置包括具有二个或多个维持在不同温度的区域的微型管路。一个区域保持样品流体，其他的一个或多个区域保持磁性流体。入口/出口阀连接到微型管路并且将磁体放置在微型管路外侧，形成磁场，以作用于磁性流体。
磁体可为放置在微型管路中央的磁体或沿微型管路布置的电磁体。
磁性流体包括任何受简单磁体或电磁体的磁力作用而移动的流体。例如，磁性流体可为铁磁性粒子在水性介质中(水基铁流体)，在油中(油基铁流体)，或在聚合凝胶体中(聚合凝胶体基铁流体)的混合物。其中，优选油基铁流体。
将磁力或电力施加到磁体上使该磁体运动。当磁体运动时，磁性流体移动，使运载流体向相邻区域移动。
当微型管路包括三个区域时，提供了一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置。所述三个区域包括保持在变性温度的第一区域，保持在退火温度的第二区域，以及保持在延伸温度的第三区域。
当微型管路包括两个区域时，也提供一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置。一个区域保持在变性温度下，另一个区域保持在退火及延伸的温度下。
本发明扩增核酸的装置可为缩微环形PCR循环仪，在其中，生物化学流体，例如PCR流体，沿着微型管路中维持在不同温度的二个或三个区域循环。例如，DNA扩增可如下完成1个循环将运载流体沿着第一区域(保持在变性温度，T1)→第二区域(保持在退火温度，T2)→第三区域(保持在延伸温度，T3)循环或将运载流体沿着第一区域(保持在变性温度，T1)→第二区域(保持在退火和延伸温度，T2’)循环。通过在PCR装置中进行多轮循环，样品中的DNA量成指数倍地扩增。
可在芯片上实现所述扩增装置。芯片包括载体，一种布置载体上的核酸扩增装置，一种电泳工具，它与所述装置可操作地相互连接。并且，所述载体可包括放置其上的加热工具。加热工具包括电热装置，红外线，或预热的金属块。
例如，使导入到本发明芯片中的一定量样品DNA扩增。然后，将扩增的DNA提供给电泳工具，按照其分子量或电荷进行分离，并且最终被确定为特定的DNA。
芯片的载体可选自玻璃，石英，硅，塑料，陶瓷，以及金属。电泳工具可为进行毛细管电泳的多管路形式。PCR扩增装置以及电泳工具可用光刻技术在载体上具体化。
本发明参考附图进行详细描述。
如图4和5所示，生物化学流体，例如PCR流体，沿着维持在不同温度的二个或多个区域循环以进行PCR。在图4和5中，环显示出运载流体循环的管路，T1，T2，以及T3分别表示不同温度区。箭头表示循环或导入/释放运载流体的方向。按照本发明，不需要长管路和/或常规体系中必需的复杂电路来精确控制温度。
图6和7举例说明气动气压型PCR体系中，每个室单元的基本组成。在图6和7中，保温室(或微型室)(11)将进行聚合酶链反应的运载流体保持一段预定时间。基本构成包括室(11)；入口阀(12)，它包括气动气压孔(13)；出口阀(12’)，它包括气动气压孔(13’)。室单元可相互连接形成一种装置，其中每个室的出口阀可与后续室的入口阀整合在一起。运载流体的流动通过被动操作阀控制，例如在这样的阀中，其中形成的出口阀的管路窄于入口阀的管路，这样提供了急剧压力降低效果，或其中出口阀的内表面用疏水材料处理，以控制运载流体的流动。
当施加到入口阀(12)中的入口气动气压孔(13)的压力高于出口阀(12’)压力的时候，室(11)中的运载流体向出口阀(12′)流动。同时，通过降低施加到出口气动气压孔(13′)的气压，空气被释放。
每个室单元的这些基本构件通过气动气压使运载流体按照一个方向流动。二个或多个室单元可以相互连接形成一种通过气动气压使运载流体循环的装置。
图8示意性地举例说明具有一室的装置的操作原理。通过向入口气动气压孔(13)施加气压，室(11)中运载流体向出口流动。当施加到入口气动气压孔(13)的气压高于施加到出口阀的气压，运载流体向出口阀(22)移动。疏水处理或由于变窄的管路结构导致急剧压力下降可被动操作出口阀。
图9示意性地举例说明具有二个相互连接的室单元的装置的操作原理。向入口气动气压孔(13)施加气压并使出口气动气压孔(33)排气，产生压力差(P1i-P3o)。当入口气动气压孔(13)的气压(P1i)高于阀(22)的气压(P2)的时候，室(11)中的运载流体向相邻室(21)移动。此外，当阀(32)的气压(P3)高于上述气压(P1i)的时候，运载流体保持在室(21)中，同时空气很容易地被释放。
图10示意性地举例说明具有三个相互连接的室单元的装置的操作原理。其操作与参考图9中描述的方法一样。将气压相继施加到气动气压孔(13，23，以及33)可使运载流体相继流过各个室(11，21，以及31)。
图11举例说明一种具有三个相互连接的室的运载流体循环装置的示意图。操作原理与参考图10中描述的一致。即，将气压相继施加到气动气压孔使运载流体按照箭头的方向，相继流过室(11)(温度区1)，室(21)(温度区2)，以及室(31)(温度区3)。
图12示意性地举例说明环形PCR装置的操作原理。运载流体通过活塞被导入到室(11)中。在第一轮循环中，导入的运载流体流经下列室(变性室(11)→退火室(21)→延伸室(31))进行聚合酶链反应。以同样的方式进行第二轮PCR循环。重复循环得到足够多的期望的聚合酶链反应。经过预定数目的循环后，运载流体经由活塞释放，转移至管路或室中进行分析，例如电泳。
图13示意性地举例说明在磁性流体型PCR体系中利用磁性流体循环生物化学流体，包括PCR流体的操作原理。该装置使用磁性流体代替气动气压，来循环生物化学流体。生物化学流体(1)沿着维持在不同的温度(T1，T2，T3)的区域循环，该过程通过使磁性流体(2)沿微型管路流动而实现，后者通过位于微型管路中央的磁体或沿微型管路布置的电磁体的相继操作来完成。
可通过参考下列实施例来进一步理解本发明的实质和优点。下列实施例只用来例举说明本发明的目的，不对本发明的范围作任何限制。
实施例1.具有二个室单元的气动气压型PCR体系该装置具有二室，可通过聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸。每个室有一个入口阀和一个出口阀，入口阀包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔，出口阀包括控制运载流体从室中流出的气动气压孔。一个室的出口阀与另一个室的入口阀整合在一起。一个室保持在约94℃进行变性，另一个室保持在约68℃进行退火和延伸。样品中一定量核酸用聚合酶链反应扩增。
实施例2.具有三个室单元的气动气压型PCR体系该装置具有三室，可通过聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸。每个室具有一个入口阀和一个出口阀，入口阀包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔，出口阀包括控制运载流体从室中流出的气动气压孔。各个室相继连接，这样在流体流动的方向上，一个室的出口阀与邻近室的入口阀整合在一起。所述三个室包括第一室，保持在94℃进行变性，第二室，保持在约55℃进行退火，以及第三室保持在约72℃进行延伸。样品中一定量核酸经聚合酶链反应得到扩增。
实施例3.具有含两个区域的微型管路的磁性流体型PCR体系该装置可通过聚合酶链反应来扩增样品中一定量的核酸，它具有包括了两个区域的微型管路。一个区域保持样品流体，另一个区域保持磁性流体。入口/出口阀连接到微型管路，并且在微型管路的中央有磁性搅拌器。一个区域保持在约94℃进行变性，另一个区域保持在约68℃进行退火及延伸。样品中一定量核酸通过聚合酶链反应被扩增。
实施例4.具有含三个区域的微型管路的磁性流体型PCR体系该装置可用于通过聚合酶链反应来扩增样品中一定量的核酸，它具有包括了三个区域的微型管路。一个区域保持样品流体，另两区域保持磁性流体。入口/出口阀连接到微型管路，并且在微型管路的中央有磁性搅拌器。三个区域包括保持在约94℃进行变性的第一个区域，保持在约55℃进行退火的第二个区域，以及保持在约72℃进行延伸的第三个区域。样品中一定量核酸通过聚合酶链反应被扩增。
本发明循环运载流体的装置和方法具有下列优点。
在常规的PCR扩增仪中，需要加热(通常1-2秒)以及冷却(通常3-4秒)。在本发明中，使用温度预设室，流体样品流经一系列这种室。因此，样品流体从一个室迁移到另一个室仅花费预定的时间。迁移时间取决于气动气压或磁力，它小于1秒种。因此，与常规PCR扩增仪相比，一个循环花费的时间大为降低。
此外，运载流体沿着温度保持室或区域流动，使能按照生物化学流体特性，通过改变运载流体在每个室或区域中的保留时间来控制PCR条件。
而且，不需要复杂的电路。在常规的PCR循环仪中，需要复杂的电路，例如PID(比例/积分/微分)，进行精确的温度控制。此外，快速升温需要的高电压引起过调(overshoot)效应，导致室的温度上升，例如，上升约1-2℃。
不需要冷却体系。在常规的PCR循环仪中，需要冷却扇或电热装置进行快速降温。但是，在本发明中，不需要任何冷却电路或冷却体系。
也不需要连续流动PCR循环仪中那样特别长的管路。因此，可能制造便携的体系，也减小了本发明整个体系的大小。
本发明在微芯片上，例如芯片实验室上实施，其使得用光刻技术在硅，玻璃，或塑料等上实现成为可能。
本发明在微芯片上实施，使得用少量(mL～pL)的生物化学流体，例如PCR流体成为可能。
权利要求
1.一种运载流体循环装置，包括二个或多个保持在不同的温度的室，每个室包括一个入口阀，包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔(入口气动气压孔)；以及一个出口阀，包括控制运载流体从室内流出的气动气压孔(出口气动气压孔)；其中所述室相继连接，这样按照流体流动的方向，一个室的出口阀连接到相邻室的入口阀。
2.根据权利要求1的运载流体循环装置，其中每个室的出口阀与后续室的入口阀整合在一起。
3.根据权利要求1的运载流体循环装置，其中入口阀与出口阀都是被动操作阀。
4.根据权利要求3的运载流体循环装置，其中被动操作阀中，形成的出口阀的管路窄于入口阀的管路或出口阀内表面用疏水材料处理以控制运载流体的流动。
5.一种权利要求1～3中任何一项所述的运载流体循环装置的操作方法，其包括按照流体流动的方向，向室的入口气动气压孔施加压力并使相邻室的出口气动气压孔排气，同时使运载流体从该室向相邻室流动；控制施加到相邻室的出口气动气压孔的压力，以将运载流体在相邻室保持一段预定时间；并且依次重复施加压力及控制步骤使运载流体循环。
6.一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，包括三个室，每个室包括一个入口阀，包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔(入口气动气压孔)；以及一个出口阀，包括控制运载流体从室内流出的气动气压孔(出口气动气压孔)；其中所述室相继连接，这样按照流体流动的方向，一个室的出口阀连接到相邻室的入口阀；并且其中所述的三个室包括，保持在变性温度的第一室，保持在退火温度的第二室，以及保持在延伸温度的第三室。
7.一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，包括二个室，每个室包括一个入口阀，包括控制运载流体向室内流入的气动气压孔(入口气动气压孔)；以及一个出口阀，包括控制运载流体从室内流出的气动气压孔(出口气动气压孔)；其中一个室的出口阀连接到另一个室的入口阀；并且其中一个室保持在变性温度，另一个室保持在退火和延伸温度。
8.一种运载流体循环装置，包括具有二个或多个维持在不同温度的区域的微型管路，一个区域保留样品流体，其他的一个或多个区域保留磁性流体；一个连接到微型管路的入口/出口阀；以及一个布置在微型管路外侧的磁体，用于形成磁场以作用于磁性流体。
9.一种按照权利要求8所述的运载流体循环装置，其中所述磁体为位于微型管路中央的磁体或沿着微型管路布置的电磁体。
10.一种按照权利要求8所述的运载流体循环装置，其中所述磁性流体为铁磁性粒子在油中的混合物。
11.一种权利要求8～10中任何一项所述的运载流体循环装置的操作方法，其中包括向磁体施力使磁性流体流动，这样使运载流体向相邻区域运动。
12.一种利用聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，该装置包括一种具有三个区域的微型管路，一个区域保留样品流体，其他的区域保留磁性流体；一个连接到微型管路的入口/出口阀；以及一个布置在微型管路外侧的磁体，用于形成磁场以作用于磁性流体，其中所述三个区域包括保持在变性温度的第一区域，保持在退火温度的第二区域，以及保持在延伸温度的第三区域。
13.一种通过聚合酶链反应扩增样品中一定量核酸的装置，所述装置包括一种具有两个区域的微型管路，一个区域保留样品流体，另外一个区域保留磁性流体；一个连接到微型管路的入口/出口阀；一个布置在微型管路外的磁体，它形成磁场以作用于磁性流体，其中一个区域保持在变性温度，一个区域保持在进行退火及延伸的温度。
14.一种芯片，包括一种载体；布置在载体上的权利要求6，7，12，以及13中任何一项所述的装置；以及一种电泳装置，可操作地与上述装置相互连接。
15.一种权利要求14的芯片，其中载体选自玻璃，石英，硅，塑料，陶瓷，或金属。
16.一种权利要求14的芯片，其中载体包括放置在其上的加热工具。
17.一种权利要求16的芯片，其中加热工具包括热电装置，红外线，或预热的金属块。
全文摘要
本发明提供了一种具有二个或多个室或区域，能使运载流体循环的装置，及利用所述装置扩增核酸的一种装置，以及包括该装置的一种芯片。循环运载流体的装置包括二个或多个保持在不同温度的室，每个室具有带气动气压孔的入口阀，用来控制运载流体向室内的流入(入口气动气压孔)；以及一个有气动气压的出口阀，用来控制运载流体从室中流出(出口气动气压孔)，其中所有的室相继连接起来，即按照流体流动的方向一个室的出口阀与相邻室的入口阀相连。
文档编号B01L99/00GK1483084SQ02803373
公开日2004年3月17日 申请日期2002年10月31日 优先权日2001年11月10日
发明者吴光昱, 林根培, 李英善, 赵允卿 申请人:三星电子株式会社