专利名称：一种金属螯合层析填料的制备方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域，特别地，本发明涉及一种层析填料的制备方法。
背景技术：
金属螯合层析，又名固定化金属亲合层析(Immobilized Metal Ion AffinityChromatography)，是利用特定金属离子(如镍离子、铜离子、锌离子)和特定氨基酸残基(如组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)之间的特异性配位作用，来选择性地分离纯化蛋白质的技术，已广泛应用于带组氨酸标记(His-tag)的基因工程蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、血制品等的实验室规模和工业规模纯化。
目前，金属螯合层析所用的填料普遍采用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶结合亚氨基二乙酸(IDA)或次甲基三乙酸(NTA)来制备。如中国专利第CN1280134A号公开的Sepharose6B-IDA和中国专利第CN1163902A号公开的Sephadex-IDA即是典型的IDA类金属螯合层析填料，在填料使用寿命、降低非特异吸附等方面均已能满足目前蛋白质纯化的需要。但上述填料由于基质耐压能力差，实际使用时线性流速仅为14-40厘米/小时。这延长了纯化操作时间，限制了生产效率。由于上述两专利分别采用Sepharose6B和Sephadex G10、Sephadex G25作为基质，使得填料的分子排阻极限只能达到4×106道尔顿(Sepharose6B)和700-5000道尔顿(Sephadex)，大分子蛋白无法进入凝胶内部与金属离子螯合，从而导致在纯化大分子蛋白(如以多聚体形式存在的包涵体蛋白)时载量明显下降。
发明内容
为了解决现有金属螯合层析填料流速低、分子排阻极限低的问题，本发明提供一种用交联结构的4％琼脂糖凝胶和亚氨基二乙酸制备金属螯合层析填料的方法，包括下列步骤1)向交联结构的4％琼脂糖凝胶中逐步加入环氧氯丙烷、氢氧化钠、硼氢化钠，在20-30℃缓慢搅拌，反应2-3小时；随后升温至60-65℃继续缓慢搅拌，反应2-3小时；
2)向经步骤1)处理得到的琼脂糖凝胶中逐步加入碳酸钠、亚氨基二乙酸、硼氢化钠，在60-65℃水浴中缓慢搅拌，反应10-20小时；3)将经步骤2)处理得到的琼脂糖凝胶依次用20-30℃蒸馏水、10％乙酸、蒸馏水洗涤，加20％乙醇保存，得到金属螯合层析填料。
本发明采用交联结构的4％琼脂糖凝胶为填料基质，包括Sepharose 4 Fast Flow、Sepharose CL-4B等，上述基质能保证填料的高流速，又能提高填料的分子排阻极限。由于上述凝胶琼脂糖含量为4％，凝胶颗粒孔径较大，可容许生物大分子通过，故分子排阻极限可达20×106道尔顿，是中国专利第CN1280134A号所公开的基质的5倍。同时，由于采用了交联结构，凝胶的强度得到保证，线性流速可达26-200厘米/小时(具体流速由基质凝胶而定)，较中国专利第CN1280134A号所公开的基质提高85％到14倍。上述或类似的琼脂糖凝胶可从Pharmacia等公司购得。由于交联结构的4％琼脂糖基质的孔径大小、亲水性等与现有金属螯合层析填料所用基质不同，需要专门的结合IDA的工艺，以确保足够的结合量和结合强度。
为达到上述目的，本发明采用阶段升温的活化方式和60-65℃恒温接臂工艺。首先，在较低温度下(20-30℃)向凝胶中逐步添加环氧氯丙烷，使环氧氯丙烷逐步扩散入凝胶内部，使两者能充分接触活化。在此阶段，凝胶内、外表面的羟基基团与环氧氯丙烷发生取代反应，形成了凝胶-环氧丙烷的活性中间体。由于交联结构的4％琼脂糖基质结构紧密，此阶段活化反应并不完全，凝胶上仍存在部分未活化羟基。待环氧氯丙烷全部添加完毕后升温至60-65℃继续反应2-3小时，保证活化完全，特别是让凝胶孔径内部的羟基也参与反应。随后，在60-65℃条件下进行接臂，通过提高温度来增强亚氨基二乙酸的分子热运动，提高其和凝胶-环氧丙烷活性中间体结合的效率。在接臂过程中使用的碳酸钠用于控制pH值碱性范围内。本发明最优的pH范围在8～11之间，提高pH值有利于增加IDA与凝胶的结合速率，降低pH值有利于提供温和的反应条件。在整个反应过程中使用硼氢化钠来提供还原性氛围。
本发明中，所加入的亚氨基二乙酸与4％琼脂糖凝胶的质量比为1∶7.5-1∶8.5。
接上亚氨基二乙酸的凝胶依次用20-30℃蒸馏水、10％乙酸、蒸馏水洗涤，去除游离的亚氨基二乙酸，加20％乙醇保存，即得到金属螯合层析填料。使用时取所需体积的填料，装入层析柱，洗去残留乙醇后，用2-3倍体积的金属硫酸盐溶液(如硫酸镍等)缓慢流过后，再依次用2倍体积10％乙酸、5倍体积纯化缓冲液平衡，即可上样。吸附于填料上的蛋白质可用200mM咪唑洗脱。
本发明所制备的填料，提高了线性流速，可达到26-200厘米/小时；分子排阻极限增大，达到20×106道尔顿。从而提高了纯化大分子蛋白似的载量，能够实现工业化规模的蛋白质纯化。
本发明中主要的化学反应如下，■代表凝胶基质1)活化 2)接臂具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的详细描述。但以下仅是本发明的较佳实施例，本发明的内容并不受下列较佳实施例的限制。
实施例1取吸干的Sepharose CL-4B 40g，放入200ml烧杯内，加入2M氢氧化钠20ml、环氧氯丙烷2ml、硼氢化钠75mg，充分混合后置于恒温磁力搅拌器上，恒温25℃，缓慢搅拌2小时。搅拌期间每隔12分钟，添加入2M氢氧化钠2ml、环氧氯丙烷1ml，总计添加10次，累计添加2M氢氧化钠20ml、环氧氯丙烷10ml。之后升温至65℃，继续恒温缓慢搅拌2小时。将反应产物转移至砂芯漏斗中，用真空泵抽干活化后的Sepharose CL-4B。再将Sepharose CL-4B转移到烧杯内，加2M碳酸钠50ml、亚氨基二乙酸5g、硼氢化钠60mg，充分混合后置于恒温磁力搅拌器上，恒温60℃，缓慢搅拌15小时，反应体系pH值9。搅拌结束后，将反应产物转移至砂芯漏斗中，依次用20-30℃蒸馏水5L、10％醋酸500ml洗涤，然后用蒸馏水冲洗至pH中性。此即制备好的Sepharose CL-4B-IDA金属螯合层析填料。如果不立即使用，则将填料转移至塑料瓶内，加入20％酒精保存。
实施例2取吸干的Sepharose 4 Fast Flow 40g，放入200ml烧杯内，加入2M氢氧化钠20ml、环氧氯丙烷2ml、硼氢化钠80mg，充分混合后置于恒温磁力搅拌器上，恒温30℃，缓慢搅拌3小时。搅拌期间每隔12分钟，添加入2M氢氧化钠2ml、环氧氯丙烷1ml，总计添加10次，累计添加2M氢氧化钠20ml、环氧氯丙烷10ml。之后升温至65℃，继续恒温缓慢搅拌3小时。将反应产物转移至砂芯漏斗中，用真空泵抽干活化后的Sepharose 4Fast Flow。再将Sepharose 4 Fast Flow转移到烧杯内，加2M碳酸钠50ml、亚氨基二乙酸5g、硼氢化钠70mg，充分混合后置于恒温磁力搅拌器上，恒温60℃，缓慢搅拌20小时，反应体系pH值10。搅拌结束后，将反应产物转移至砂芯漏斗中，依次用20-30℃蒸馏水5L、10％醋酸500ml洗涤，然后用蒸馏水冲洗至pH中性。此即制备好的Sepharose 4 FastFlow-IDA金属螯合层析填料。如果不立即使用，则将填料转移至塑料瓶内，加入20％酒精保存。
实施例3取制备好的金属螯合层析填料Sepharose 4 Fast Flow-IDA 5ml，转移至内径1.6cm的层析柱内，先用10ml磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗去填料内残留乙醇，然后依次用15ml、200mM硫酸镍、10ml、10％乙酸、50ml磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗柱。将带有pET32a质粒的大肠杆菌DH5α表达后菌体裂解液上样(pET32a和DH5α均可从Novagen公司购得)，待穿过峰出尽后用200mM咪唑洗脱，流速30厘米/小时，所得洗脱峰为纯的带有His-Tag的硫氧还蛋白。另取同等体积的带有pET32a质粒的大肠杆菌DH5α表达后菌体裂解液，再次上样，待穿过峰出尽后用200mM咪唑洗脱，流速150厘米/小时，所得洗脱峰为带有His-Tag的硫氧还蛋白，纯度与30厘米/小时纯化所得硫氧还蛋白相同。
权利要求
1.一种金属螯合层析填料的制备方法，包含下列步骤1)向交联结构的4％琼脂糖凝胶中逐步加入环氧氯丙烷、氢氧化钠、硼氢化钠，在20-30℃条件下缓慢搅拌，反应2-3小时；随后升温至60-65℃继续缓慢搅拌，反应2-3小时；2)向经步骤1)处理得到的琼脂糖凝胶中逐步加入碳酸钠、亚氨基二乙酸、硼氢化钠，在60-65℃水浴中缓慢搅拌，反应10-20小时；3)将经步骤2)处理得到的琼脂糖凝胶依次用20-30℃蒸馏水、10％乙酸、蒸馏水洗涤，加20％乙醇保存，得到金属螯合层析填料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为Sepharose4 Fast Flow或Sepharose CL-4B。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中加入的亚氨基二乙酸与4％琼脂糖凝胶的质量比为1∶7.5-1∶8.5。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)反应体系中的pH值范围为8-11。
全文摘要
本发明提供了一种金属螯合层析填料的制备方法，是通过将交联结构的4％琼脂糖凝胶和亚氨基二乙酸结合而成。所获得的填料较现有类似产品，在流速和分子排阻极限上具有显著优势，适合应用于工业化规模的蛋白质纯化。
文档编号B01D15/08GK1525165SQ0311551
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月25日 优先权日2003年2月25日
发明者黄竹, 翁辰川, 黄 竹 申请人:上海实业科华生物技术有限公司