专利名称：17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法
技术领域：
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种分析测定生物样品和食品样品中的 17 β -雌二醇的分子印迹复合微球。
背景技术：
17 β -雌二醇(17 β -Estradiol)是人工合成雌激素的一种，它主要用于医学上治疗妇女更年期综合症等疾病，但长期摄入17 β -雌二醇会产生一些副作用，并增加某些疾病的发病危险，鉴于具有这些风险，故而国家严禁在食品中使用17 β-雌二醇等人工合成雌激素。但不乏一些不法分子为强化其产品功能，降低成本而添加17 β-雌二醇等具有的雌激素样作用的人工合成雌激素。此外，滥用同化激素，对人和动物健康，对社会和生态环境都会造成直接或潜在的危害。因此对食品、保健食品中17 β-雌二醇等人工合成的雌激素监测也是保证此类食品卫生安全的必要措施。17 β -雌二醇可通过生命体的代谢进入环境，或作为雌性激素类药物生产的母体化合物随工业废水进入环境，以致在水生物中残留，由食物链进入人体，而其代谢产物又与人类癌症有密切的关系。因此，它引起的食品营养和安全问题不容忽视，对这类物质的存在水平和生物学活性的研究具有重要的现实意义。由于食品中的残留待测药物浓度低且波动范围大、样品基质复杂、干扰物质多、样品基质和待测组分的不确定性等特点，检测前需去除样品中干扰杂质，富集痕迹量待测目的组分。分子印迹聚合物(MIPs)具有特异性识别，可用于复杂基质的样品前处理，且制备简单、性质稳定和可重复使用，已在分离科学、生物医学、传感器技术和化学反应的控制等方面都得到了广泛的应用。但现有的制备MPIMs方法都存在明显的局限性本体聚合得到的聚合物为块状，使用前须经过研磨、筛分等处理，尺寸和形状不规则使得样品处理困难， 工作繁琐、费时，且产率低(一般< 50% )，应用效率大幅降低；沉淀聚合法对溶剂的要求高，难以得到广泛应用；乳液聚合法制得的MPIMs粒径小(< Iym)，不适合在液相色谱中使用且吸附后不易分离；利用球形硅胶表面印迹或牺牲硅胶法时，硅胶表面的羟基会影响功能单体与模板分子间的作用力，以致MPIMs识别能力较弱；悬浮聚合法虽制备工艺简单， 但获得的MPIMs粒径分布宽，需经繁琐的分级处理才可使用；多步溶胀聚合法虽能制得微米级且粒径较均勻的MPIMs，经简单的洗涤即可使用，但需经多步溶胀，过程较为繁琐、制备周期较长，难以实现工业化。相比之下，分子印迹聚合物微球性能较好、制备与使用较方便， 特别适用于分析检测、传感器阵列和分离组件。因此，分子印迹聚合物微球的制备和应用研究成为分子印迹技术的研究热点之一。表面印迹的结合位点位于聚合物的表面，模板分子易于洗脱，可提高结合容量；再结合时目标分子无需进入其刚性结构，大大加快了结合的动力学过程。但这种方法目前使用的基质主要局限于硅胶，使用微粒硅胶要特别注意它的使用PH范围是2 7. 5，若过碱(pH > 7.幻，硅胶会粉碎或溶解；若过酸(pH <幻，键合相的化学键会断裂。反应结束后去除基质比较麻烦，一般采用氢氟酸腐蚀的方法，但对聚合物的骨架结构有一定的不良影响。
发明内溶本发明所要解决的技术问题在于克服上述制备方法的缺点，提供一种反应条件温和，产物稳定性好、识别能力强的17 β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成1、合成单分散聚苯乙烯分散液将苯乙烯、偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入无水乙醇中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9，超声分散，通氮气除氧，搅拌，70°C聚合反应M小时，制备成聚苯乙烯；将聚苯乙烯用质量分数为0. 2%的十二烷基硫酸钠水溶液超声分散，得到单分散聚苯乙烯分散液。上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为10000 70000，由中国 派尼化学试剂厂 郑州提供。2、制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂水溶液加入环己醇与甲苯的混合溶剂中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂水溶液的质量比为1 2 0. 15 2 3 60，用细胞破碎仪在功率为300 500W下超声，每间隔10 20秒超声1次，每次超声10 20秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1得到的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1 0. 1，30°C搅拌溶胀10小时，通氮气除氧， 70°C聚合反应M小时，过滤，依次用甲醇、丙酮洗涤，60°C真空干燥4小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。上述分散剂水溶液中的分散剂为十二烷基硫酸钠和聚乙烯醇，十二烷基硫酸钠的质量分数为0.2%，聚乙烯醇的质量分数为2%，所述的聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88%，由天津天大化工实验厂提供。3、抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将步骤2制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中 140°C抽提48小时，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。4、单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4- 二氧六环中， 每IOOmL 1，4_ 二氧六环中加入3 IOg单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4 12小时，通氮气除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 2 5 4 6的混合液，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 0. 1 2，30 60°C搅拌8 15小时，过滤，产物依次用 1，4_ 二氧六环、甲醇、蒸馏水、丙酮洗涤，真空干燥，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球以乙腈为溶剂，超声分散17 β-雌二醇、甲基丙烯酸、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4 12小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球丙酯微球的质量比为1 20 120，17β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 2 12 8 20 1 2，通氮气除氧，60 70°C聚合反应16 48小时，产物用甲醇与乙酸的体积比为8 2的洗脱液洗脱，除去17 β-雌二醇，先用蒸馏水洗至中性，再用甲醇洗涤，真空干燥，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。本发明的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4中，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的最佳质量比为1 1，甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的最佳质量比为1 2.6 5。本发明的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4中，最佳将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4- 二氧六环中，室温搅拌溶胀6小时，通氮气除氧，加入1，4_ 二氧六环与甲基丙烯酸羟乙酯、三氟化硼乙醚的混合液， 45°C搅拌12小时，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。本发明的合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的最佳质量比为1 40，17β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的最佳摩尔比为1 4 10 1.2。本发明的合成17 β-雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，最佳将17 β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，超声分散，室温搅拌溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气除氧，70°C聚合反应M小时。本发明以1，4_ 二氧六环为溶剂，制备表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，以表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，采用表面印迹技术制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球，该方法反应条件温和，所得产物稳定性好，对17 β-雌二醇的识别能力强、吸附速度快，可用于建立简便的提取、控化和浓缩样品预处理，对含雌激素产品的质量和成分进行评估，同时可用于经受高流速高压力操作的高效液相色谱，大大提高柱效与重现性。另外，由于印迹的结合位点位于聚合物的表面，模板分子易于洗脱，结合时目标分子无需进入其刚性结构，大大加快了吸附与解吸的动力学过程，可将其用作快速、高效的固相萃取吸附剂。
图1是17 β -雌二醇、白藜芦醇和辣椒碱在印迹柱上的色谱分离图。图2是17 β -雌二醇、白藜芦醇和辣椒碱在非印迹柱上的色谱分离图。图3是17 β -雌二醇和雌酮在印迹柱上的色谱分离图。图4是17 β -雌二醇和雌酮在非印迹柱上的色谱分离图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1 1、合成单分散聚苯乙烯分散液 将苯乙烯10. 908g、偶氮二异丁腈0. M06g、分子量为10000 70000的聚乙烯吡咯烷酮1.5006g加入盛有96g无水乙醇的250mL单口烧瓶中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1 0.02 014 8. 8，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散20分钟，通氮气15分钟除氧，搅拌，70°C聚合反应M小时，反应结束后，离心除去溶剂，用无水乙醇洗涤，制备成聚苯乙烯；将0. 2g聚苯乙烯用超声波清洗器在功率为80W下超声分散于IOmL质量分数为0. 2%的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到单分散聚苯乙烯分散液。2、制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将过氧化苯甲酰0. 1667g、甲基丙烯酸环氧丙酯2.064g、乙二醇二甲基丙烯酸酯 3. 03g、十二烷基硫酸钠与聚乙烯醇(醇解度为88% )的混合物水溶液62. 35g加入盛有 1.92g环己醇与1.0392g甲苯的250mL烧杯中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、十二烷基硫酸钠与聚乙烯醇的混合物水溶液的质量比为1 2 0. 15 2 3 60，用细胞破碎仪在功率为400W下超声，每间隔15秒超声1 次，每次超声15秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1得到的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1 0.1，120转 /分钟搅拌，30°C溶胀10小时，通氮气20分钟除氧，70°C聚合反应M小时，用玻砂漏斗抽滤，用70°C蒸馏水洗涤，再依次用甲醇、丙酮洗涤，60°C真空干燥4小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。上述的十二烷基硫酸钠与聚乙烯醇的混合物水溶液中，十二烷基硫酸钠的质量分数为0. 2%，聚乙烯醇的质量分数为2%，聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88%。3、抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将步骤2制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球置于索式提取器中，加入 50mL甲苯，140°C抽提48小时，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，在真空度为0. 06MPa下60°C干燥3小时，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。4、单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球2. Og加入50mL 1， 4- 二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入2. Og甲基丙烯酸羟乙酯、5. 2g 1，4-二氧六环、10. Og三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羟乙酯与1， 4-二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 2.6 5，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 1，45°C搅拌12小时，过滤，产物依次用1，4_二氧六环、甲醇、蒸馏水、丙酮洗涤，30°C真空干燥2小时，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球将17 3-雌二醇201^(0.078讓01)、甲基丙烯酸27“1^(0.32讓01)溶于15mL乙腈中，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球0. 8g，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L (0. 774mmol)、偶氮二异丁腈15mg (0. 094mmol)，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的质量比为1 40，17β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 4 10 1.2，通氮气20分钟除氧，70°C聚合反应M小时，产物先依次用蒸馏水、甲醇洗涤，再用甲醇与乙酸的体积比为8 2的洗脱液洗脱M小时，除去17β-雌二醇，然后用蒸馏水洗至中性，再用甲醇洗涤，30°C真空干燥2小时，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。对比实施例1按照实施例1步骤1 4的方法，制备成表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。不添加模板分子17 β-雌二醇，直接将甲基丙烯酸27 yL (0.32mmol)溶于15mL乙腈中，加入0. 8g表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L(0. 774mmol)、偶氮二异丁腈15mg(0. 094mmol)，通氮气20分钟除氧，70°C聚合反应M小时，产物依次用蒸馏水、甲醇洗涤，30°C真空干燥2小时，制备成非分子印迹复合微球。实施例2在实施例1的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4中， 将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球1. 6g加入53. 2mL 1，4_ 二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入0. 16g甲基丙烯酸羟乙酯、0.32g 1，4-二氧六环、0.64g三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羟乙酯与1， 4-二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 2 4，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 0.1，该步骤的其他步骤与实施例1相同。在合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，将17 β -雌二醇40mg(0. 156mmol)、甲基丙烯酸^yL(0.312mmol)溶于15mL乙腈中，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球0. Sg,用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，200转 /分钟，室温溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯237yL(1.248mm0l)、偶氮二异丁腈 26mg(0. 156mmol)，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的质量比为1 20，17β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 :2:8: 1，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同， 制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。实施例3在实施例1的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4中，将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球1. 6g加入16mL 1，4_ 二氧六环中， 200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入3. 2g甲基丙烯酸羟乙酯、16g 1，4-二氧六环、19. 2g三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 5 6，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。在合成17 β-雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，将17 β-雌二醇6. 7mg(0. 026mmol)、甲基丙烯酸25 μ L (0. 31mmol)溶于15mL乙腈中，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球 0. 8g，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，200转/分钟，室温溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯 100 μ L (0. 52mmol)、偶氮二异丁腈 9. 3mg (0. 056mmol)，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的质量比为1 120，17β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 12 20 2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同，制备成17β-雌二醇分子印迹复合微球。
实施例4在实施例1 3的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4 中，将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六环中，200转/分钟搅拌， 室温溶胀4小时，通氮气20分钟除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的混合液，30°C搅拌15小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。实施例5在实施例1 3的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤4 中，将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六环中，200转/分钟搅拌， 室温溶胀12小时，通氮气20分钟除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的混合液，60°C搅拌8小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成17 β-雌二醇分子印迹复合微球。实施例6在实施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，将17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声分散于乙腈中，200转/分钟搅拌，室温溶胀4小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气 20分钟除氧，60°C聚合反应48小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。实施例7在实施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球步骤5中，将17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声分散于乙腈中，200转/分钟搅拌，室温溶胀12小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气20分钟除氧，70°C聚合反应16小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的17β_雌二醇分子印迹复合微球和对比实施例1制备的非分子印迹复合微球进行了各种试验，具体试验情况如下实验试剂过氧化苯甲酰(ΒΡ0，A.R.天津市福晨化学试剂厂)；甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA，Sigma-Aldrich)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酸(MAA, Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA, Sigma-Aldrich) ；1，4-二氧六环(A.R.天津市福晨化学试剂厂)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市福晨化学试剂厂)； 17 β -雌二醇，雌三醇和雌酮，均采购自上海晶纯实业有限公司。1、色谱实验(1)称取17 β -雌二醇分子印迹复合微球(MIP)、非分子印迹复合微球(NIP)各 0. 8g置于30mL异丙醇中，超声勻浆10分钟，在20ΜΙ^压力下，以乙腈作为顶替液，湿法装柱 (50mmX4. 6mm)，以乙腈为流动相，直到获得稳定的基线。以17 β -雌二醇分子印迹复合微球填充的色谱柱称为印迹柱，以非分子印迹复合微球填充的色谱柱称为非印迹柱。色谱条件以体积分数为36%的乙腈-水溶液为流动相；流速为0. 5mL/分钟；进样量为5. 0 μ L，样品为20 μ g · mL—1的乙腈水溶液；检测波长为280nm。
测定数据容量因子k' = (、-、)/、，其中、是分析物的保留时间，、是死时间 (以NaNO2测定)；印迹因子IF = k' MIP/k' NIP，其中k' 和k' NIP分别为17β-雌二醇分子印迹复合微球和非分子印迹复合微球的容量因子；分离因子α =k/ /k2'，其中k/ 和1 '分别是17 β -雌二醇和雌三醇在印迹柱上的容量因子。(2) 17 β -雌二醇在印迹柱和非印迹柱上的保留情况以17 β-雌二醇及与其结构差异较大的白藜芦醇和辣椒碱作为研究对象，研究 17 β -雌二醇分子印迹复合微球和非分子印迹复合微球的选择性，结果如图1和图2所示。 由图1可见，在相同的分离条件下，17 β-雌二醇在印迹柱上的保留比白藜芦醇、辣椒碱强， 表明17 β-雌二醇分子印迹复合微球对17 β-雌二醇具有一定的吸附选择性；如图2所示， 相同的分离条件下，三种物质在非印迹柱上的保留时间十分接近，证明分子印迹复合微球对模板分子具有特异性选择。这是由于在17 β -雌二醇分子印迹复合微球的制备过程中形成了能够与模板分子17 β-雌二醇空间结构相匹配的印迹孔穴和结合位点，其对模板分子具有特异识别能力；白藜芦醇和辣椒碱的结构与17 β-雌二醇的结构不相同，很难与模板分子留下的印迹孔穴相匹配，因此，17 β -雌二醇分子印迹复合微球对其不具备识别能力。 而非分子印迹复合微球上并不存在这样的特异性结合位点，三种物质在非印迹柱上的保留时间十分接近。另外，选择17 β -雌二醇的结构类似物雌酮作为研究对象研究分子印迹复合微球对同类物质的识别作用。由图3可以看出，雌二醇和雌酮在印迹柱上的保留时间很接近，说明17 β-雌二醇分子印迹复合微球对结构类似物具有相似的保留情况。由图3、4对比可以看出，17 β -雌二醇和其结构类似物雌酮在非印迹柱上的保留时间均小于在印迹柱上的保留时间，由此进一步证明分子印迹复合微球对模板分子有特异性识别作用。(3) ρΗ值对分离的影响分别以乙腈与ρΗ为3、5、7、9、11的PBS缓冲液05mmol/L的磷酸盐缓冲液)的体积比为36 64的混合液为流动相，考察流动相的ρΗ对17 β-雌二醇及雌三醇在印迹柱上保留情况的影响。结果如表1所示。表1流动相中磷酸盐酸冲液的ρΗ值对分离的影响
权利要求
1.一种17 β -雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，由下述步骤组成(1)合成单分散聚苯乙烯分散液将苯乙烯、偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入无水乙醇中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、 聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9，超声分散，通氮气除氧，搅拌，70°C聚合反应M小时，制备成聚苯乙烯；将聚苯乙烯用质量分数为 0. 2%的十二烷基硫酸钠水溶液超声分散，得到单分散聚苯乙烯分散液；上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为10000 70000 ；(2)制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂水溶液加入环己醇与甲苯的混合溶剂中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂水溶液的质量比为1 2 0. 15 2 3 60，用细胞破碎仪在功率为300 500W下超声，每间隔10 20秒超声1次，每次超声10 20秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤(1)得到的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1 0. 1，30°C搅拌溶胀10小时，通氮气除氧， 70°C聚合反应M小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；上述分散剂水溶液中的分散剂为十二烷基硫酸钠和聚乙烯醇，十二烷基硫酸钠的质量分数为0. 2%，聚乙烯醇的质量分数为2%，所述的聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为 88% ；(3)抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球将步骤( 制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中140°C 抽提48小时，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；(4)单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基将步骤⑶制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4_二氧六环中，每 IOOmL 1，4_ 二氧六环中加入3 IOg单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4 12小时，通氮气除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 2 5 4 6的混合液，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 0.1 2，30 60°C搅拌8 15小时，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；(5)合成17β -雌二醇分子印迹复合微球以乙腈为溶剂，超声分散17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4 12小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，17 β -雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的质量比为 1 20 120，17 β-雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 2 12 8 20 1 2，通氮气除氧，60 70°C聚合反应16 48小时，洗脱 17 β -雌二醇，制备成17 β -雌二醇分子印迹复合微球。
2.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于 在单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤中，所述的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1 1。
3.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于在单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤中，所述的甲基丙烯酸羟乙酯与1，4_ 二氧六环、三氟化硼乙醚的质量比为1 2.6 5。
4.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于 在单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基步骤(4)中，将步骤C3)制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六环中，室温搅拌溶胀6小时，通氮气除氧，加入1，4_ 二氧六环与甲基丙烯酸羟乙酯、三氟化硼乙醚的混合液，45°C搅拌12小时，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。
5.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印迹复合微球步骤(5)中，所述的17 β-雌二醇与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的质量比为1 40。
6.根据权利要求1所述的17β -雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于 在合成17 β -雌二醇分子印迹复合微球步骤( 中，所述的17 β -雌二醇与甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比为1 4 10 1.2。
7.根据权利要求1所述的17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印迹复合微球步骤( 中，将17β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中，加入步骤(4)得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，超声分散，室温搅拌溶胀6小时，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气除氧，70V聚合反应M小时。
全文摘要
一种17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法，以1，4-二氧六环为溶剂，制备表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，以表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，采用表面印迹技术制备成17β-雌二醇分子印迹复合微球，该方法反应条件温和，所得产物稳定性好，对17β-雌二醇的识别能力强、吸附速度快，可用于建立简便的提取、控化和浓缩样品预处理，对含雌激素产品的质量和成分进行评估，同时可用于经受高流速高压力操作的高效液相色谱，大大提高柱效与重现性，还可用作快速、高效的固相萃取吸附剂。
文档编号B01J20/30GK102382273SQ20111019470
公开日2012年3月21日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者岳宣峰, 张静, 王玲玲, 陈月萌, 韩艳婷, 马晋琴 申请人:陕西师范大学