T-2毒素免疫亲和柱的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于T-2毒素单克隆抗体的免疫亲和柱的制备方法。通过细胞融合所得到的单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B偶联得到的免疫亲和吸附剂填充与固相萃取管中得到了可以特异性吸附T-2毒素的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能特异性的与T-2毒素结合，最大结合容量约为240ngT-2；重复使用三次，回收率不低于90%。本发明可用于谷物及谷物制品检测T-2毒素残留的前处理方法。
【专利说明】T-2毒素免疫亲和柱的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测【技术领域】，具体地涉及涉及一种τ-2毒素的免疫亲和柱的制备方法。
【背景技术】
[0002]Τ-2毒素(T-2 toxin)属于单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)中的A族,是镰刀菌属(Fusarium)的部分菌种生成的一组结构相似的化合物中毒性最强的毒素之一，主要污染谷物及其制品，结构为白色针状结晶，熔点为150-151°C，难溶于水，易溶于极性溶剂，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。
[0003]单端孢霉烯族毒素对小麦黄化芽鞘和胚根的生长有强生物活性，能够抑制小麦的生长，并导致芽鞘、胚根变色溃烂。1989年，王裕中等测定了禾谷镰刀菌产生的不同种毒素对不同种小麦黄化芽鞘的生物活性，其中DON对黄化芽鞘生长具有很高的抑制率，是活性最强的毒素之一。除了以上列举的毒素对植物的危害外，单端孢霉烯族毒素还对人和动物有很大的危害，如常食用的食物如肉、奶、蛋中均有真菌毒素及其代谢物残留，而且由于单端孢霉烯族毒素具有较强抗热能力，不会因加热而破坏，所以烹饪也不能解决，如果人畜食用了带毒的粮食或饲料后，可发生不同种类和程度中毒症状。临床表现为嗜睡、呕吐、食欲丧失、免疫功能障碍、胃肠功能障碍和繁殖功能障碍等。
[0004]1999年，启东华宝三联牧场饲料由于使用污染的原料，致使多头猪病死，后来发现主要原因就是赤霉菌产生了的大量F-2毒素(类雌激素)及一定量的T-2毒素，引起了猪机体激紊乱，内环境不平衡，内脏出血性损害或消化系统伤害，致使抵抗力下降，机体易感各种疾病，最后导致死亡，2008年，美国也出现了由于T-2毒素的污染导致的大面积畜禽死亡的现象，所以当粮食被污染后误入食物链，对畜禽及人类健康有很大的影响(Weber，2008)。
[0005]目前T-2毒素常用的检测方法很多，根据真菌毒素含量常用的检测方法，可分为3类:(I)生物学检测法；(2)理化检测方法(薄层层析法TLC、高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC ; (3)免疫化学检测法(ELISA、CLEIA等方法)(吴文达，2009)。其中，高效液相色谱法HPLC、气象色谱法GC是定量的检测方法，结果准确可靠，缺点是检出限较高、仪器设备较为昂贵；薄层层析法TLC灵敏度不高且不适用于检测大量样品的实际需要，近年来应用较少；酶联免疫吸附ELISA法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，但实验过程需较长时间，各个步骤需彻底洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐。而且T-2毒素毒性剧烈，前处理过程中操作人员反复暴露在T-2毒素的环境中，增加了实验的风险。因此建立快捷有效的样品前处理技术已成为T-2毒素检测分析中亟待解决的问题。
[0006]免疫亲和色谱柱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一种新型的样本前处理技术，它是将免疫反应与色谱分析方法相结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和亲和力，用适当的方法将特异性的抗原或抗体结合到层析载体上，以便有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。目前已在抗体、激素、多肽、病毒以及亚细胞化合物的分析中广泛应用。本发明旨在提供一种T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，作为谷物及谷物制品检测T-2毒素的前处理方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，所研制的亲和柱是采用T-2毒素单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B (CNBr-Sepharose 4B)偶联后填充在固相萃取柱中，用于纯化含有T-2毒素的待测样品。
[0008]本发明所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行:
（l)偶联:取纯化后的T-2毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-S印harose 4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联；
(2)封闭:在偶联凝胶产物中加入其5~10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应2h；
(3)洗涤:分别用5~10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5~10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；
(4)装柱:将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到T-2毒素免疫亲和柱，4度保存待用。
[0009]所述固相载体可以为纤维素、葡聚糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。
[0010]所述的τ-2毒素单克隆抗体与CNBr-S^harose 4B干粉的质量比为1:80 ;所述的偶联缓冲液为0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的缓冲液为1.0mmol /T, HCL0
[0011]所述的封闭缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，用以封闭未偶联的活化位点。
[0012]所述的醋酸盐缓冲液为0.1 mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为 0.1 mol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCL 缓冲液。
[0013]本发明制备的τ-2毒素免疫亲和柱可以用于谷物及谷物制品检测τ-2毒素残留的前处理方法。具有以下显著特点:1)减少了操作人员接触到Τ-2毒素的几率；2)通过特异性的抗体与Τ-2毒素结合，一次净化能够去除绝大部分的干扰物；3)所制备的免疫亲和柱最大结合容量为240ng T-2 ；4)所制备的免疫亲和柱重复使用三次，回收率不低于90%。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明检测T-2毒素免疫亲和柱的柱容量测定图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0016]实施例1 T-2毒素免疫亲和柱的制备
(1)偶联
取10 mg经过辛酸-硫酸铵法纯化后的针对T-2毒素的单克隆抗体在0.1 mol/LNaHCO3溶液中透析过夜，将浓度调整至2 mg/mL ；
称取 CNBr-Sepharose 4B 干胶 800 mg,在 10 mL 1.0 mmol /T, HCL 中充分溶胀；用 10倍以上湿胶体积的0.1 mol/L NaHCO3溶液洗漆3次,5000 rpm离心I min ；
将湿胶与抗体充分混匀，室温下搅拌过夜；
用50 mL 0.1 mol/L NaHC03溶液洗涤，收集洗涤液，紫外鉴定，计算偶联率。偶联率的计算公式为:
【权利要求】
1.一种T-2毒素免疫亲和柱的制备，其特征在于，是由固相载体和预期偶联的Τ-2毒素单克隆抗体组成，具体步骤为: Cl)偶联:取纯化后的Τ-2毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-S印harose 4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联； (2)封闭:在偶联凝胶产物中加入其5?10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应2h； (3)洗涤:分别用5?10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5?10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂； (4)装柱:将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到T-2毒素免疫亲和柱，4度保存待用。
2.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的固相载体为 CNBr-Sepharose 4B。
3.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的T-2毒素单克隆抗体与CNBr-S印harose 4B干粉的质量比为1:80 ;所述的偶联缓冲液为0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的缓冲液为1.0 mmol/L HCl。
4.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的封闭缓冲液为0.1 mo I/L Tris-HCL (pH 8.0)，以封闭未偶联的活化位点。
5.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于其中步骤(3)中所述的醋酸盐缓冲液为0.1 mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为0.1mol/L、pH8.0 的 Tris-HCL 缓冲液。
6.T-2毒素免疫亲和柱可用于谷物及谷物制品检测T-2毒素残留的前处理方法。
【文档编号】B01J20/281GK103801111SQ201210443317
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】杜道林, 洪霞, 杜霞 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司