通过混合模式液相色谱法分离聚糖的制作方法

通过混合模式液相色谱法分离聚糖的制作方法
【专利摘要】本发明的一种示例性多峰色谱介质包括与一种或多种反相和/或亲水相互作用色谱结合位点组合的一种或多种强阴离子交换、弱阴离子交换、强阳离子交换和/或弱阳离子交换的结合位点。在一个示例性实施例中，这些位点与一种聚糖混合物中的一种或多种聚糖相互作用，其方式为允许分离该混合物中的聚糖并且分析该聚糖混合物。将这种介质结合到用于色谱分析的装置和系统中。还提供了使用本发明的多峰介质来分析聚糖的方法。
【专利说明】通过混合模式液相色谱法分离聚糖
发明背景
[0001]聚糖作为糖蛋白类、糖脂类、和蛋白聚糖类的一部分以游离状态以及共轭形式广泛分布在生物系统中。它们被包括在广泛范围的生物和生理过程中，这些生物和生理过程包括认知、调节功能、细胞交流、基因表达、蛋白质治疗的稳定性和活性、细胞免疫、生长和发育。聚糖的生物和生理功能常常取决于附接在这些蛋白质和脂类上的低聚糖的结构和类型。聚糖的结构由于转译后修饰和生理条件是相当多样和复杂的。因此，分析综合的聚糖谱(profiles) (B卩，糖组)并且确定用于临床用途的聚糖的结构是具有高度挑战性的。
[0002]HPAEC-PAD (具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱)是对于聚糖分析开发的第一种常规测定方法。该离子色谱(IC)方法可以经由在高pH下聚糖的羟基基团与色谱介质的特殊相互作用来分离糖类。这些聚糖作为阴离子种类进行色谱分析并且基于聚糖电荷、尺寸、构成、异构体和连接键与柱相互作用。该分析方法提供存在于一种产品上的、或在一个特定糖基化位点上的整体糖基化或低聚糖群体的谱，这可以用于分批比较研究。然而，聚糖的HPAEC-PAD分离的一个显著缺点是需要使用相对高的盐浓度。在此种情况下，常常使用一种脱盐柱，以使得流动相与质谱法相兼容。
[0003]对于聚糖的分析已开发了不同模式的HPLC分离，包括正相或亲水相互作用(HILIC)、离子交换和反相。因为聚糖是高度亲水和极性的物质，所以HILIC广泛用于聚糖分析。这些分离柱典型地是酰胺、胺或基于两性离子的填充材料。该酰胺HILIC柱主要通过氢键合分离聚糖，导致基于尺寸和构成的分离。然而，用该方法可以实现不基于电荷的分离。基于胺的和两性离子的柱均显示了与带电聚糖(自然的或标记的)的相互作用，并且尽管它们基于电荷分离聚糖，它们提供了在具有相同电荷(例如，电荷的极性和/或大小)的聚糖之间的相对低的分辨率。此外，在多样的带电聚糖之间的固有地强烈的离子相互作用和固定相常常要求高洗脱缓冲剂浓度，不利地影响MS灵敏度。
[0004]一些报道已经描述了使用氨基的或季铵化胺基的柱作为用于聚糖分析的阴离子交换/HILIC混合模式柱(Ruhaak等人，分析化学和生物分析化学(Anal.Bioanal Chem)(2010) 397:3457-3481 ;Anumula 等人，分析生物化学(Anal Biochem) (2000) 283:17-26 ；以及Neville等人，蛋白质组研究杂志(J Proteome Res) (2009)8:681-687)。然而，以上参考的这些氨基或季铵化胺基的柱只具有一种模式，该模式是一种离子交换模式，并且因此不是混合模式。此外，这些柱只具有一种类型的色谱官能团，该色谱官能团在此种情况下是一种氨基亦或季铵化的胺基。以上这些参考文献未描述在该氨基基团将具有中性电荷(即，未质子化的)的PH范围内的分离条件。应注意，季铵化的胺基甚至在高pH下不能具有中性电荷。一种质子化的胺基基团将作为阴离子交换基团并且不作为HILIC基团。应该注意的是，尽管随着增加溶剂浓度而增加保留时间提供了一种HILIC相互作用的证据，但它还提供其他保留模式，如离子交换模式和盐与两性离子的相互作用模式的证据。这样，随着增加溶剂浓度而增加保留时间自身并不表明一种HILIC相互作用。氨基和季铵化的胺基的柱遭受具有长保留时间(例如，>60分钟)并且要求相对高的盐浓度的缺点影响。总体上，相对高的盐浓度干扰用质谱法检测聚糖。[0005]报道已经描述了使用两性离子磺基甜菜碱柱作为一个两性离子的离子色谱(ZIC) /HILIC混合模式柱用于聚糖分析(Ruhaak等人，分析化学和生物分析化学(Anal.Bioanal Chem) (2010) 397:3457-3481 ;Takegawa 等人，色谱法杂志 A 辑(Journal ofChromatography A)(2006)1113:177-181 ;以及 Takegawa 等人，分离科学杂志(J Sep Sci )(2006) 29:2533-2540)。然而，以上参考的这些两性离子柱只具有一种模式，该模式是一种基于磺基甜菜碱固定相的两性离子模式，并且因此不是混合模式。此外，这些柱只具有一种类型的色谱官能团，该官能团在此种情况下是一种两性离子磺基甜菜碱基团。此类磺基甜菜碱基团在非常广泛的pH范围内是净中性的，以取决于离子强度的方式经由静电机制与盐相互作用，这不同于不带电的HILIC机制。应该注意的是，尽管随着增加溶剂浓度而增加保留时间提供HILIC相互作用的证据，它还表明了其他保留模式，如离子交换模式和盐与两性离子的相互作用的模式。这样，随着增加溶剂浓度而增加保留时间自身并不表明一种HILIC相互作用。该两性离子相柱遭受对于具有相同电荷的聚糖基团显示相对差的分辨率的缺点影响。
[0006]通常非常希望的是通过使用质谱法检测和表征洗出液中的聚糖分析物，然而，本领域清楚地传授，当与质谱检测相结合时，在阴离子交换相是高度离子化的条件下进行工作是不可接受的。该两性离子模式经由一种盐交换保留机制进行工作，这比离子交换固有地具有更低的选择性。高溶剂浓度仅仅增加这些盐交换相互作用的强度。
[0007] 申请人:相信，存在对于新的多峰色谱介质以及使用这些介质分析聚糖的方法的需要，该方法将理想地提供在不同聚糖之间的高分辨率，基于尺寸、构成、结构(例如，异构体、连接键)、和/或电荷的单一选择性。而且， 申请人:还相信，如果可以通过不具有、或具有极小的清理或纯化后分析和预检测(例如，荧光标记)的标准方法学(例如，质谱法、荧光检测)来检测从该介质中洗脱出来的聚糖，这将大大简化并且有助于聚糖分析。本发明提供此类色谱介质以及使用它们的方法。
发明概述
[0008]在一个示例性实施例中，本发明提供一种在聚糖混合物的分析中具有独特使用特性的真正的多峰色谱介质(固定相)。本发明的色谱介质包括一个离子交换色谱部分和一个结合到一种固体基质(例如，颗粒、单块)上的不带电的色谱部分。在不同的实施例中，该不带电的色谱部分是一个反相色谱部分和一个亲水相互作用色谱部分中的一个或多个。这些离子交换部分是弱的或强的阴离子或阳离子交换部分。本发明的色谱介质是一种双峰或三峰的色谱介质，适合于分析广泛范围的聚糖，包括在含有聚糖的生物分子中存在的那些聚糖。
[0009]在它的优点之中，本发明的多峰色谱介质是用于通过HPLC分析聚糖的一种优异方法的一种组成部分，并且是基于提供对于不同聚糖的所希望的选择性的高度多用途的化学平台。此外，与现有技术相比，本发明提供基于在电荷、连接键、异构体和尺寸上的差异的对于复合聚糖的优异分辨率。因为该多峰介质的独特化学性质，来自在该介质上的聚糖的色谱分离的洗脱液与通过荧光和质谱法检测洗脱的聚糖是高度相兼容的。
[0010]在不同的实施例中，本发明提供在分析和/或分离聚糖混合物中使用这种多峰色谱介质的方法。在一个示例性实施例中，本发明提供一种将聚糖混合物的一种第一聚糖组分与一种第二聚糖组分分离的多峰色谱方法。一种示例性方法包括，(a)使该聚糖混合物与一种多峰色谱介质接触，该多峰色谱介质包含一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分。该不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合。如在一种色谱程序中典型的，在有效地实现该聚糖混合物的至少两种组分的分离的条件下，通过使该介质和同介质结合的聚糖与一种洗脱液接触，将该聚糖混合物从该柱中洗脱出来。在一个示例性实施例中，所述洗脱液包含适合于在阴离子交换或阳离子交换色谱法中使用的并且与该色谱介质兼容的一种电解质。
[0011 ] 在不同的实施例中，本发明还提供用于通过在离子交换的活化类似物与在一种固体载体上的具有互补反应性基团的不带电的色谱部分之间的反应来制备本发明的色谱介质的方法。
[0012]在本发明的所选择的实施例中还提供含有本发明的多峰介质的色谱装置(例如柱)，以及使用该介质和此类装置进行聚糖的色谱分离和分析的方法。
[0013]在一个示例性实施例中，本发明提供了一种色谱系统，该色谱系统包括一种含有本发明的色谱介质的分离装置。该系统任选地进一步包括在进行一种聚糖的色谱分离中使用的部件，例如，一种质谱或荧光检测器。
[0014]在以下详细说明中提供本发明的其他目的、优点和方面。
附图简要说明
[0015]图1是示出通过一个填充有WAX/HILIC (相22，1.9μπι)的柱从牛胎球蛋白中分离2ΑΒ连接的N-聚糖的色谱图。通过荧光检测来检测这些峰。该色谱分析是在Ultimate-3000UHPLC仪器上进行的。中性聚糖峰在单唾液酸化的聚糖之前被洗脱，单唾液酸化的聚糖在二唾液酸化的之前被洗脱，双唾液酸化的种类在三唾液酸化的峰之前被洗脱，三唾液酸化的在四唾液酸化的之前并且四唾液酸化的在五唾液酸化的种类之前被洗脱。
[0016]图2A和2B是示出通过一个填充有WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱的柱从人类IgG中分离2AA连接的N-聚糖的色谱图。该分离使用Ultimate3000UHPLC系统使用二元梯度条件进行。用Q-Exactive仪器记录MS光谱。A.通过一个荧光检测器检测峰，B.通过具有从400道尔顿至2200道尔顿的质谱扫描范围的处于负模式的MS检测来检测峰。通过来自Simglycan软件的LC-MS/MS数据来表征每个峰上的聚糖。在表I中示出了存在于IgG中的聚糖的清单。
[0017]图3A和3B是示出通过两种不同的柱从牛胎球蛋白中的2AB连接的N-聚糖的对比分离的色谱图。这两种柱的所有峰通过具有质谱扫描范围400道尔顿至2200道尔顿的处于负模式的MS检测来检测。A.在一个WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱中的色谱分析，B.在一个商业酰胺HILIC柱(1.7 μ m)中的色谱分析。该WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱提供就基于电荷、尺寸、极性的选择性和基于峰宽度的分辨率而言优于1.7 μ m商业酰胺HILIC柱的分离。在实例部分中提供用于分离的梯度条件。在表7中示出了在牛胎球蛋白中所识别的聚糖的清单。
[0018]图4是使用一个WAX/HILIC(相22，1.9μ m)柱的来自牛胎球蛋白的未标记的N-聚糖的LC-MS分析。未标记的聚糖是基于电荷、尺寸和极性而进行分离。所有的聚糖峰通过具有400道尔顿至2200道尔顿的质谱扫描范围的处于负模式的MS检测来检测。未标记的聚糖的N-聚糖谱定量地不同于来自牛胎球蛋白的同一样品的标记的聚糖。例如，在图4中未标记的聚糖的双唾液酸化的聚糖峰7-12的定量谱不同于图3A中的2AB-标记的二脱唾液酸化的聚糖峰11-15。
[0019]图5是使用WAX/RP (相21，1.9 μ m)混合模式柱从牛胎球蛋白中分离2AB-N-聚糖。聚糖是使用基于电荷、尺寸、异构体和极性的高分辨率(分辨出多达40个峰)来进行分离的。
该柱提供来自牛胎球蛋白的2AB标记的N-聚糖的峰的数量(~44)多于如分别在图3B和图3A中示出的一种示例性商业柱d26个峰)和WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱。
[0020]图6是示出使用一步梯度条件使用一个WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱从牛胎球蛋白中分离2AB标记的N-聚糖的色谱图。该流动相具有的水性比例高于在图1中使用的，导致具有共同电荷的所有聚糖作为一个单一峰聚结在一起并且允许对于这些电荷状态各自的容易和准确的定量。通过荧光检测来检测这些峰。由每个峰的曲线下相对面积(AUC)(表10)来确定对于每个电荷状态聚糖的定量。
[0021 ] 图7示出了 WAX/RP混合模式介质的制备。
[0022]图8是对于阴离子交换/反相混合模式相的阴离子交换容量测定的色谱图。柱:相21(1.9-μ m);尺寸:2.1X 150-mm ;流动相:乙腈 /IOOmM 乙酸铵缓冲剂，pH5=50/50(v/v);流速:0.21mL/min ;注射体积:1 μ L ;温度:30°C ;检测:220nm下的UV ;峰:1.尿嘧啶；2.辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基铵(octylphenoxyethoxyethyl dimethylbenzyl ammonium)；
3.甲苯磺酸钠；以及4.丙基苯。
[0023]图9示出了 WAX/HILIC混合模式介质的制备。
[0024]图10是对于HILIC/阴离子交换混合模式相的阴离子交换容量测定的色谱图。柱:相 22 (1.9-μ m);尺寸:2.1 X 150-mm;流动相:乙腈/IOOmM 乙酸铵缓冲剂，pH5=90/10 (v/V);流速:0.21mL/min ;注射体积:1 μ L` ;温度:30°C ;检测:220nm下的UV ;峰:1.醋氨酚；2.水杨酸；以及3.乙酰水杨酸。
[0025]图11是HILIC/WAX/SCX混合三峰介质(33)和HILIC/WAX/WCX混合三峰介质(34)的示意图。
发明详细说明
-T-N /.、.1.1IJ H
[0026]本领域的液相柱色谱法是用于从样品中分离物质并且用于分析样品的成分的一种古老和熟知的方法。取决于样品和有待从其中分离的材料，各种各样的液相柱色谱法模式中的一种或多种用于实现该分离。此类色谱模式包括尺寸排除(SEC)、离子交换、反相、正相、亲水相互作用、疏水相互作用、亲和、供体-受体、离子对以及手性分离色谱法。
[0027]不同分离方式的组合也可以在分离和分析中使用。混合模式色谱法是其中一种色谱介质通过多于一种的相互作用模式与溶质(分析物)相互作用的色谱法类型。混合模式色谱法介质可以将IEX和RP特性或IEX和HILIC特性进行组合。混合模式色谱法可以提供高分辨率、可调节的选择性、高样品负载、不需要离子配对试剂(MS-相容性)、以及在某些环境中替换两个常规的相对应的柱的能力。
[0028]当与其中生物聚合物(像蛋白质或核酸)与小分子(如药物、代谢物、污染物、外毒素和内毒素，等等)一起存在的大量生物样品一起使用时，许多双峰分离失效。由于样品预处理，像溶剂萃取、固相萃取或超滤是费时和冗长的，已经开发了新的色谱介质，这些色谱介质可以防止用于在反相或离子交换色谱法中分离的基团之间的接触。大多使用具有防止大分子渗透到珠粒中的非常小的孔的介质(全排除)。由粘在珠粒表面上的蛋白质造成的柱的阻塞通过提供具有亲水基团的表面而被抑制。近来综述了该方法(Pinkerton T.C.，色谱(J.Chromatogr.),544, (1991) 13 ；Haginaka J.，分析化学发展趋势(Trends Anal Chem.),10，(1991) 17)它可以被称为假多峰，作为这些模式之一，实际上不是一种色谱法，而是一种简单的类过滤分离(超过一种尺寸限制的所有分子的全排除)。
[0029]本发明提供了具有多种独特色谱特性的色谱介质，该色谱介质作为固定相对于聚糖的色谱分离和分析、以及固相萃取(SPE)是有用的。在某些实施例中，本发明的色谱介质包括两个或更多个具有阴离子交换能力、阳离子交换能力、反相能力或亲水相互作用能力的不同色谱部分。在不同的实施例中，这些两个或更多个不同的色谱部分被结合到固体载体的同一单元上(例如，至同一颗粒上)。在其他实施例中，该介质通过将具有一个或多个结合到固体载体的同一单元上的色谱部分的两种或更多种材料进行组合而形成。
[0030]在示例性实施例中，本发明还提供使用本发明的介质来分离和分析聚糖混合物的方法、在这些方法中使用的装置以及结合有此类装置的系统。
[0031]在更加详细地描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限制于在此描述的具体实施例，因为此类实施例可以变化。还应当理解的是，在此使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，并且该术语并非旨在是限制性的。本发明的范围将只受所附权利要求书限制。除非另外定义，在此使用的所有的技术和科学术语具有如本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。当提供了数值的范围时，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个居中值(至该下限的单位的十分之一，除非上下文清楚地另外规定)，以及在所陈述范围内的任何其他陈述的或居中的值被涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在这些更小范围内并且还被涵盖在本发明内，经受在所陈述范围中的任何具体地排除的极限。当所述的范围包括这些极限中的一个或两个时，排除这些被包括的极限中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。某些范围用冠以术语“大约”的数值在此提出。术语“大约”在此用于为其后的精确数字、以及接近或近似该术语先于的数字提供字面支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体叙述的数字时，该接近或近似的未叙述的数字可以是在它被提出的上下文中提供该具体叙述的数字的实质等价物的一个数字。本说明书引用的所有公开、专利、和专利申请通过引用而结合于此至与如同对每个单独的公开、专利、或专利申请具体地和单独地表明通过引用被结合相同的程度。此外，每个引用的公开物、专利、或专利申请通过引用结合在此，以便披露和描述与所引用公开相关的主题。任何公开物的引用是为了在申请日之前的其披露并且应该被解释为承认在此描述的本发明没有资格早于借助在先发明的此类公开。另外，提供的
【公开日】可能不同于实际的
【公开日】，这可能需要独立地进行确认。
[0032]应注意的是，这些权利要求可以被起草以排除任何任选的元素。这样，这种陈述旨在作为使用与权利要求元素的叙述有关的此类排他性术语如“仅(solely)”、“只(only)”等等，或使用“否定性”限制的前提基础。如当阅读本披露时，将对本领域普通技术人员清楚的是，在此描述和说明的这些单独实施例各自具有分立的组成部分和特征，它们可容易地与其他几个实施例中任何一个的特征分离或与其结合，而不脱离本发明的范围或精神。任何所叙述的方法可以按所叙述事件的顺序或按逻辑上可能的任何顺序来进行。尽管与在此描述的那些类似或等价的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
[0033]在描述本发明中，以下术语将被使用，并且是如以下所表明的而定义的。
I1.缩写
[0034]弱阴离子交换(“WAX”)；强阴离子交换(“SAX”)；弱阳离子交换(“WCX”)；强阳离子交换(“ SCX”);亲水相互作用液相色谱法(“HILIC”);2_氨基苯甲酰胺(2AB) ;2_氨基苯甲酸(2AA);去离子的(D.1.)。
II1.定义
[0035]在取代基是通过它们从左向右所书写的常规化学式来说明的情况下，它们任选地涵盖将因从右向左书写该结构而产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-旨在也叙述 _0CH2_。
[0036]除非另外说明，否则术语“烷基”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个直链或支链、或环状烃基、或其组合，该烷基可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括具有指定碳原子数(即，C1-Cltl意指一个至十个碳)的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)如下基团:如甲基、乙基、正丙基(例如，-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-)、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-( 丁二烯基)、
2,4-戍二烯基、3-(1，4-戍二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3- 丁炔基以及更闻级的同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”还意在包括以下更详细定义的烷基的衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同源烷基(homoalkyl)”。在烷基是一个二价基团的情况下，术语“烷基”还可以意指“亚烷基”或“烷二基”以及次烷基(alkylidene)。
[0037]术语“亚烷基”或“烷二基”独自或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷基的二价基团，如由(但不限于)-CH2CH2CH2-(亚丙基或丙烷-1，3- 二基)所举例说明，并且进一步包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。典型地，一个烷基(或亚烷基)将具有从I个到约30个碳原子、优选地是从I个到约25个碳原子、更优选地是从I个到约20个碳原子、甚至更优选地是从I个到约15个碳原子并且最优选地是从I个到约10个碳原子。一个“低级烷基”、“低级亚烷基”或“低级烷二基”是一个较短链的烷基、亚烷基或烷二基，总体上具有约10个或更少个碳原子、约8个或更少个碳原子、约6个或更少个碳原子、或约4个或更少个碳原子。
[0038]术语“烷氧基”、“烷氨基”以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)是在它们的常规意义上使用的，并且各自是指经由一个氧原子、一个氨基或一个硫原子连接到分子的其余部分上的那些烧基。
[0039]除非另外说明，否则术语“杂烷基”独自或与另一个术语组合意指一个稳定的直链或支链、或环状烃基、或其组合，该杂烷基由规定数目的碳原子和至少一个选自下组的杂原子组成，该组由0、N、S1、S以及B组成，并且其中这些氮和硫原子可以任选地被氧化，并且该氮杂原子可以任选地被季铵化。该一个或多个杂原子0、N、B、S以及Si可以被放置在杂烷基的任何内部位置上，或在该烷基与分子的其余部分相连接的位置上。实例包括，但不限于:-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N (CH3) -CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S (O) -CH3、-CH2-CH2-S (O) 2-CH3、-CH=CH-O-CH3' -Si (CH3) 3、-CH2-CH=N-OCH3' 以及-CH=CH-N (CH3) -CH30 最高达两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si (CH3) 3。类似地，术语“杂亚烷基”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个衍生自杂烷基的二价基团，如由(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所举例说明。对于杂亚烷基，杂原子还可以占据链末端的任何一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氣基、亚烷基二氣基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向并非由书与该连接基团的化学式的方向所暗示。举例来讲，化学式-C02R’代表-C(0)0R’和-OC(O)R’。
[0040]除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”独自或与其他术语组合各自表示“烷基”和“杂烷基”的环状型式。另外，对于杂环烷基，一个杂原子可以占据该杂环与分子的其余部分相连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1_(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外说明，否则术语“卤基”或“卤素”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个氟、氯、溴或碘原子。另外，如“卤烷基”的术语意在包括单卤烷基和多卤烷基。举例来说，术语“卤(C1-C4)烷基”意在包括(但不限于)三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0041]除非另外说明，否则术语“芳基”意指一个多不饱和、芳香族的取代基，该取代基可以是单个环或多个环(优选地是从I个到3个环)，这些环稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指包含从一个到四个选自N、O、S、Si以及B的杂原子的芳基(或环)，其中这些氮和硫原子是任选地被氧化，并且该一个或多个氮原子是任选地被季铵化。一个杂芳基可以通过一个杂原子连接到分子的其余部分上。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环体系中的每一个的取代基是选自以下所描述的可接受取代基的组。
[0042]为了简便起见，术语“芳基”在与其他术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)组合使用时包括如上文所定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”意在包括其中一个芳基被附接到一个烷基上的那些基团(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，该烷基包括其中一个碳原子(例如一个亚甲基)已经被例如一个氧原子替换的那些烷基(例如，苯氧基甲基、吡啶氧基甲基、3_(1_萘氧基)丙基等)。
[0043]以上术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)中的每一个均意在包括所指明基团的被取代和未被取代的形式两者。以下提供了每种类型的基团的优选取代基。
[0044]这些烷基和杂烷基(包括常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烧基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的那些基团)的取代基一般被称为“烷基取代基”，并且它们可以是选自(但不限于)以下各项的多种基团中的一个或多个:被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂环烷基、-OR’、=0、=NR'、=N-OR'、-NR，R"、-SR，、-卤素、-SiR，R"R"，、-OC (0) R，、-C (0) R，、-CO2R'、-CONR' R"、-OC (0)NR’ R"、-NR"C (0) R’、-NR’ -C (0) NR"R"’、_NR"C (0) 2R’、-NR-C (NR，R"R’ ")=NR""、-NR-C (NR，R")=NR’ "、-S (0) R’、-S (0) 2R’、-OS (0) 2R’、-S (0) 2NR’ R"、-NRSO2R'、-CN 以及-NO2,数目范围是从零到(2m’+1)，其中m’是这类基团中的碳原子的总数。R’、R〃、R〃’以及R〃〃各自优选地独立地是指氢、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基)、被取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳烷基。当一种本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团独立地被选择，当存在R’、R〃、R’〃以及R〃〃基团中的一个以上时，这些基团中的每一个也同样如此。当R’和R〃被连接到同一个氮原子上时，它们可以与该氮原子组合形成5-、6_或7-元环。举例来说，-NR’ R"意在包括(但不限于)1_吡咯烷基和4-吗啉基。从以上关于取代基的讨论中，本领域的技术人员将了解到，术语“烷基”意在包括包含与除了氢基以外的基团结合的碳原子的基团，如卤烷基(例如，-CF3 和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O) CH3> -C(O) CF3> -C(O) CH2OCH3 等)。
[0045]类似于对于烷基所描述的取代基，芳基和杂芳基的取代基一般被称为“芳基取代基”。这些取代基选自，例如:被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂环烷基、-0R’、=0、=NR'、=N-OR'、-NR’ R"、-SR’、-卤素、-SiR’ R"R"’、-OC (0) R’、-C (0) R’、-CO2R'、-CONR' R"、-OC (0)NR’ R"、-NR"C (0) R’、-NR’ -C (0) NR"R"’、_NR"C (0) 2R’、-NR-C (NR，R"R’ ")=NR""、-NR-C (NR，R")=NR，"、-S (0) R'、-S(O)2R,、-S(O)2NR, R"、-NRSO2R'、-CN 和-NO2、-R，、-N3、-CH (Ph)2、氟代( C1-C4)烷氧基以及氟代(C1-C4)烷基，数目范围是从零到芳香族环系统上的开放价态的总数；并且其中R’、R〃、R〃’以及R〃〃优选地独立地选自氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的芳基以及被取代或未被取代的杂芳基。当一种本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团独立地被选择，当存在R’、R〃、R’〃以及R〃〃基团中的一个以上时，这些基团中的每一个也同样如此。
[0046]芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式-T-C (O) - (CRR’) q-U-的一个取代基替换，其中T和U独立地是-NR-、-0-、-CRR’ -或一个单键，并且q是从O到3的一个整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式-A-(CH2)^B-的一个取代基替换，其中A和B独立地是-CRR’ -、-0-、-NR-、-S-、-S(0)-、-S(0)2-、-S(0)2NR’ -或一个单键，并且 r 是从 I 到 4 的一个整数。如此所形成的新环的这些单键中的一个可以任选地被一个双键替换。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式(CRR’)S-X-(CR〃R〃’)d-的一个取代基替换，其中s和d独立地是从O到3的整数，并且X是-0-、-NR’ -、-S-、-S (O)-、-S (O)2-或-S(O) 2NR’-。取代基R、R’、R〃以及R〃’优选地独立地选自氢或被取代或未被取代的(C1-C6)烷基。
[0047]如在此所使用，术语“稠环体系”意指至少两个环，其中每个环具有至少2个与另一个环共有的原子。“稠环体系”可以包括芳香族以及非芳香族环。“稠环体系”的实例是萘、吲哚、喹啉、色烯等。
[0048]如在此所使用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)以及硼(B)。
[0049]符号“R”是代表选自以下基团的取代基的通用缩写:取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂
环烧基。
[0050]术语“基质”与“载体”或“固体载体”可互换使用。
[0051]当本发明的化合物含有相对碱性或酸性的官能团时，此类化合物的盐被包括在本发明的范围内。盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所希望的酸或碱(纯净的亦或在一种合适的惰性溶剂中)接触而获得。本发明的相对酸性化合物的盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基、或镁的盐，或类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所希望的酸(纯净的亦或在一种合适的惰性溶剂中)接触而获得。酸加成盐的实例包括衍生自有机酸像盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸，等等的盐，以及衍生自有机酸像乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸，等等的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等等，以及有机酸像葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐等等(参加，例如，Berge 等人,药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science) 1977，66:1-19)。本发明的某些具体化合物包含碱性和酸性官能团两者，这些官能团允许这些化合物被转化为碱的亦或酸的加成盐。
[0052]这些化合物的中性形式优选通过使该盐与一种碱或酸接触并且以常规方式分离该母体化合物而进行再生。该化合物的母体形式在某些物理性质(如在极性溶剂中的溶解度)上不同于这些不同的盐形式，但对于本发明的目的，这些盐在其他方面等价于该化合物的母体形式。
[0053]术语“颗粒的平均直径”、“粒径”、“平均粒径”、“中值粒径”或其任何语法变体是指对于一种本发明的基质(固体载体)的粒径规格。粒径典型地由制造商提供。粒径可以是指任何类型的颗粒，包括球形和不规则形状的颗粒。
[0054]“流动相”和“洗脱液”可互换地使用，是指使有待从一个色谱柱或其他分离装置中分离的一种混合物的溶解的组分(例如，一种聚糖)移动的一种液体。该流动相常常含有多于一种化合物并且是一种不同溶剂的混合物或一种盐、酸、碱，等等的溶液。
[0055]“溶剂”是一种液体有机化合物(例如，一种单一化合物)。一种示例性溶剂是至少部分地可与水混溶的。在不同的实施例中，一种溶剂是完全可与水混溶的。在不同的实施例中，“溶剂”是指乙腈。
[0056]“流动相强度”是指就例如极性、在反相色谱法中的有机改性剂浓度、在离子交换色谱法或亲水相互作用色谱法中的缓冲剂离子强度而言的流动相的强度。在一个示例性实施例中，该术语是指该流动相的离子强度。
[0057]在本发明中使用的一种示例性流动相包括与从约50%至约85%的溶剂(例如，乙腈)组合的一种从约2mM至约30mM的电解质。在一个示例性实施例中，该洗脱液用于在一个HILIC/WAX方案中分离聚糖。在本发明中使用的一种另外的示例性流动相包括与从约0%至约50%的溶剂(例如，乙腈)组合的从约2mM至约30mM的一种电解质。在一个示例性实施例中，该洗脱液用于在一个RP/WAX方案中分离聚糖。
[0058]一种“洗脱液”是结合有本发明色谱介质的分离装置的洗脱液。
[0059]如在此使用的，术语“电解质”是指一种流动相(例如一种缓冲剂)的一种离子组分。
[0060]“梯度”是随着时间在流动相的构成上的改变。
[0061]“色谱介质”是指在固体载体上具有结合位点的一种物质组合物。
[0062]“结合位点”、“色谱部分”和“色谱结合位点”是可互换地使用的，以指在能够结合到一种聚糖分析物的本发明色谱介质上的一个部分。
[0063]“聚糖”是指单聚的、二聚的或更高“聚的”糖类、低聚糖和多糖。术语“聚糖”还指包括一种聚糖组分，例如，糖脂类、糖聚合物类和糖肽类的种类。在一个示例性实施例中，该聚糖混合物是一种糖类混合物。一种示例性聚糖包括一种或多种附接唾液酸的部分。
[0064]“糖类”是一种聚糖的种类，在其结构内不包括脂质或多肽部分。
[0065]在本发明中使用涉及离子强度(例如，一种洗脱剂)的大小的术语。如在此使用的，术语“低离子强度”是指小于或等于约30mM的溶液电解质组分的浓度。术语“高离子强度”是指大于或等于约IOOmM的溶液电解质组分的浓度。相对应地，术语“中等离子强度”是指大于约30mM并且小于约IOOmM的溶液电解质组分的浓度。
[0066]在本发明中使用涉及一种水性溶液(例如，一种洗脱剂)中的溶剂浓度的术语。如在此使用的，术语“低溶剂含量”是指小于或等于约50%的水性溶液中的溶剂浓度。如在此使用的，术语“高溶剂含量”是指大于约50%的水性溶液中的溶剂浓度。
IV.色谱介质
[0067]在一个示例性实施例中，本发明提供一种多峰色谱介质。一种示例性介质具有带电和不带电两种的结合位点。在一个示例性实施例中，该介质包括由不同模式(例如，离子交换、和RP或HILIC)进行工作的两个结合位点。
[0068]本发明的一种示例性多元色谱介质包括与一个或多个反相和/或亲水相互作用色谱结合位点相组合的一个或多个强阴离子交换、弱阴离子交换、强阳离子交换和/或弱阳离子交换的结合位点。在一个示例性实施例中，这些位点与一种聚糖混合物中的一种或多种聚糖相互作用，以一种允许分离该混合物中的聚糖并且分析该聚糖混合物的方式。
[0069]在不同的实施例中，该离子交换部分是一种胺。
[0070]在一个示例性实施例中，该不带电的第二结合位点是一个亲水相互作用位点并且是一种脲，例如，一个不带电的脲部分。
[0071]在一个示例性实施例中，本发明提供一种色谱介质，该色谱介质具有一个阴离子交换位点(例如，一个WAX结合位点)和一个HILIC结合位点以及约3 μ m的粒径。在另一个示例性实施例中，本发明的色谱介质具有一个阴离子交换位点和一个RP结合位点，并且该粒径是约1.9 μ m。
[0072]在不同的实施例中，该介质包括第一和第二离子交换位点两者。示例性的第一和第二结合位点是基于结构上彼此不同的部分的不同位点。在一个示例性实施例中，该第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点并且所述第二离子交换结合位点是一个阳离子交换结合位点。
[0073]该色谱介质还包括一个或多个不带电的结合位点，并且类似于这些离子交换位点，当存在两个或更多个不带电的结合位点时，它们是基于具有彼此不同的结构的部分。
[0074]在一个示例性实施例中，本发明的介质包括一个阳离子结合位点、一个阴离子结合位点、以及一个反相结合位点和一个亲水相互作用结合位点中的一个或两个。[0075]这些结合位点直接地或通过一个连接体被结合到该基质上。在一个示例性实施例中，该离子交换色谱部分通过一个第一连接体部分被结合到该第一基质上。在不同的实施例中，该不带电的色谱部分通过一个第二连接体部分被结合到该第二基质上。
[0076]在不同的实施例中，该第一连接体部分和该第二连接体部分是单独的化学种类，以使得该离子交换色谱部分和该不带电的色谱部分可以独立地分别被连接到该第一基质和该第二基质上。该第一基质可以是与该第二基质相同的，或可替代地该第一个和该第二基质可以是不同的。独立连接的方式意指该离子交换色谱部分和该不带电的色谱部分不被附接到一个共同的共享的连接体基团上。此外，该独立连接的离子交换色谱部分和不带电的色谱部分不是直接地被连接至彼此的。
[0077]在本发明的组合物中使用的连接体可以具有任何有用的结构。例如，在一个示例性实施例中，该第一连接体部分和/或该第二连接体部分中的任一个或两个是被取代的或未被取代的烷基或杂烷基部分。该连接体具有任何有用的长度。在本发明的化合物中使用的示例性连接体包括在长度上从约3个碳至约40个碳，例如8个碳至约30个碳的那些。当该连接体是被取代的或未被取代的杂烷基时，该碳链被一个或多个杂原子中断，然而，该连接体的总长在长度上是从约3个碳至约40个碳。
[0078]在一个示例性实施例中，该离子交换结合位点和该第一连接体具有以下化学式:
【权利要求】
1.一种将一种聚糖混合物的一种第一聚糖组分与一种第二聚糖组分分离的多峰色谱方法，所述方法包括: (a)使所述聚糖混合物在有效实现所述分离的条件下与一种多峰色谱介质以及一种水性洗脱液接触，该多峰色谱介质包括一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分，所述不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合，该水性洗脱液包括一种电解质和一种有机溶剂，从而分离所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分是一个阴离子交换部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分是一种胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二色谱部分是一个亲水相互作用色谱部分并且是一种脲。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分通过一个第一连接体部分被结合到所述第一基质上。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分通过一个第二连接体部分被结合到所述第二基质上。
7.如权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一连接体部分、所述第二连接体部分以及它们的组合的一个成员是一个被取代的或未被取代的烷基部分。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述被取代的或未被取代的烷基连接体在长度上是从约3个碳至约40个碳。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一连接体在长度上是从约3个碳至约30个碳。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二连接体在长度上是从约8个碳至约40个碳。
11.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一基质和所述第二基质是相同的基质。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一基质和所述第二基质是不同的基质。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分与所述第一连接体一起具有以下化学式:c.R2 (^(CH2)r1-N、 其中 R2和R3独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；并且η是一个从3至30的整数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分与所述第一连接体一起具有以下化学式:
L I zR2
g*/d I \ _(uj ^ ? U~~Oi Ι^.>οΙρι ιΝ、ζI測、R3
15.根据权利要求9所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分与所述第二连接体一起具有一个化学式，该化学式是一个选自以下化学式的成员:
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分与所述第二连接体一起具有一个化学式，该化学式是一个选自以下化学式的成员:
17.根据权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种二氧化硅基质。
18.根据权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种颗粒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种二氧化硅颗粒，该二氧化硅颗粒具有从约I μ m至约20 μ m的直径。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电解质以从约ImM至约50mM的量存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述有机溶剂以最高达所述洗脱液的约95%(v/v)的量存在于所述洗脱液中。
22.根据权利要求1所述的方法，进一步包括(b):在步骤(a)之前，通过处理至少一种具有糖苷酶的糖蛋白的一种溶液来制备一种第一前体聚糖混合物，从而形成所述第一前体聚糖混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，在所述糖苷酶中是一个选自N-糖酰胺酶F、N-糖酰胺酶A以及它们的组合的成员。
24.根据权利要求22所述的方法，进一步包括(c):在步骤(b)之后，通过一种方法制备一种第二前体聚糖混合物，该第二前体聚糖混合物包括所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分，该制备方法包括: (i)将在所述第一前体聚糖混合物中的蛋白质沉淀，形成一种包含沉淀的蛋白质和上清液的混合物；(?)通过将所述步骤(i)的混合物离心来将所述沉淀的蛋白质造粒，形成一种两相混合物； (iii)将所述上清液从所述两相混合物中去除，形成一种分离的上清液；并且 (iv)将所述分离的上清液进行透析，从而形成所述第二前体聚糖混合物；或者 (i)使所述第一前体聚糖混合物经受反相高效液相色谱法，从而形成所述第二前体聚糖混合物。
25.如权利要求24所述的方法，进一步包括(d):在步骤(c)之后，通过一种方法制备一种标记的聚糖混合物，该标记的聚糖混合物包括一种标记的所述第一聚糖组分和标记的所述第二聚糖组分，该制备方法包括使所述第二前体聚糖混合物经受一种包含一种反应性的、可检测的标记的混合物，在有效地用所述可检测的标记来标记所述第二前体聚糖混合物中的一种聚糖的条件下，从而制备所述标记的聚糖混合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述可检测的标记是一种荧光标记。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述条件是对于通过具有选自所述第一聚糖组分、所述第二聚糖组分和它们的组合的一个成员的一个还原部分来进行的所述可检测的标记的还原氨化而言是有效的，其中所述可检测的标记包括一个反应性胺部分。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述荧光标记是一种芳香胺。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述芳香胺是选自2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基吡唳、8-氨基萘-1，3, 6-二磺酸、2-氨基B丫唳酮、以及9-氨基花-1, 3, 6-二磺酸的一个成员。
30.如权利要求24所述的方法，进一步包括⑷:在步骤(c)之后，用选自唾液酸酶A、唾液酸酶B以及它们的组合的一个成员来处理所述第二前体聚糖混合物，从而制备所述聚糖混合物。
31.如权利要求30所述的方法，进一步包括(e):在步骤(a)之后，使所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分经受通过质谱法的分析。
32.如权利要求25所述的方法，进一步包括，在步骤(a)之后，使所述标记的第一聚糖组分和所述标记的第二聚糖组分经受通过质谱法的分析。
33.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离导致一个色谱图，其中所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分具有与它们的电荷成比例的保留时间，使得具有与所述第一聚糖组分或所述第二聚糖组分相同的电荷的一种第三聚糖将具有与具有相同电荷的聚糖组分成组的保留时间。
34.一种改进在一种多峰色谱介质上的一种未唾液酸化的第一聚糖和一种未唾液酸化的第二聚糖的色谱分离的方法，所述介质包括一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分，所述不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合，所述方法包括: (a)用一种包括一个带电部分的可检测标记将所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖进行衍生，形成一种标记的第一聚糖和一种标记的第二聚糖；并且 (b)使所述多峰色谱介质在有效地分离所述第一和第二标记的聚糖的条件下与所述标记的第一聚糖以及所述标记的第二聚糖接触，其中所述分离相对于在所述多峰色谱介质上的所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖的一种分离是改进的。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述分离是通过在有效地实现所述分离的条件下，使一种洗脱液流过所述多峰色谱介质，使得所述第一标记的聚糖和所述第二标记的聚糖与所述介质接触而实现的，其中所述洗脱液包含不大于30%的电解质，从而形成包含与所述第二聚糖组分分离的所述第一聚糖组分的一种洗脱液。
36.一种多峰色谱介质，包含: (a)—种微粒二氧化硅基质； (b)一个结合到所述基质上的第一离子交换结合位点； (C)一个不带电的结合位点，该不带电的结合位点是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员；以及 (d) —个选自一个第二离子交换结合位点和一个第二不带电的结合位点的成员，该第二不带电的结合位点是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员。
37.根据权利要求36所述的色谱介质，其中，所述第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点。
38.根据权利要求36所述的色谱介质，进一步包括一个第二离子交换结合位点。
39.根据权利要求38所述的色谱介质，其中，所述第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点并且所述第二离子交换结合位点是一个阳离子交换结合位点。
40.根据权利要求39所述的色谱介质，其中，所述不带电的结合位点是一个反相结合位点。
41.根据权利要 求39所述的色谱介质，其中，所述不带电的结合位点是一个亲水相互作用结合位点。
【文档编号】B01D15/20GK103877748SQ201310712282
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】X·刘, U·埃契, C·A·波尔 申请人:戴安公司