聚合物链修饰的硅胶基质亲水作用色谱固定相及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种亲水作用液相色谱固定相及其制备方法，以及其在分离分析、糖蛋白质组学中的应用。

背景技术：

高效液相色谱(HPLC)技术自20世纪70年代以来在仪器系统、固定相、分离理论等方面都得到了巨大的发展。由于其高效和快速的特点，该技术被广泛应用于不同的研究领域，如制药、生命科学、环境分析和食品安全等(Fekete,S et al,TrAC.2014,63,2-13)。固定相作为色谱技术的核心，从根本上决定了色谱的分离选择性和分离效率。近来年，随着蛋白质组学、代谢组学、药物分析等领域的不断发展，强极性物质的分离备受各个领域的关注。亲水作用色谱对强极性和亲水化合物具有很好的保留和分离选择性，且亲水模式使用的流动相体系相对简单，分离选择性与反相色谱具有很好的正交性，因此越来越受到关注和重视。

目前，已经有多种类型的亲水作用色谱固定相，如酰胺型(R.El-Debs et al,JCA.2014,1326,89-95)、多元醇羟基型(Franc,ois M et al,JCA.2010,1217,7528-7538)、两性离子型(Hongdeng Q et al,CC,2013,49,2454-2456)等并且已经商品化。但上述固定相仍然存在亲水性不足、分离选择性不够、制备复杂等问题。此外，值得注意的，使用不同方法制备的亲水作用固定相，其极性功能基团的连接方式和空间排布不同，得到的固定相的表面结构和分离性能存在很大差别(Strege,M.A.et al,AC.1998,70,2439-2445)。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种聚合物链修饰的硅胶基质亲水作用色谱固定相，该固定相通过硫醇-烯点击共聚反应在硅胶表面键合由两种不同单体形成的树枝状聚合物链，该固定相表面富含羟基和酰胺键多种亲水性功能基团，具有很好的亲水性，在分离分析和糖蛋白质组学等领域有较好的实用价值和应用前景。

本发明所采用的技术方案为：

一种聚合物链修饰的硅胶基质亲水作用色谱固定相，以硅胶颗粒为基质，第一步进行硅烷化修饰上巯基，然后通过硫醇-烯的点击共聚反应在硅胶表面接枝含有羟基的烯类功能单体和甲叉双丙烯酰胺功能单体，形成表面具有三维树枝状聚合物链且富含羟基和酰胺亲水性功能基团的亲水作用色谱固定相。

所述亲水作用固定相表面具有三维树枝状聚合物链，固定相含有羟基 和酰胺两种亲水作用功能基团。

所述固定相颗粒为单分散的微球颗粒，固定相颗粒粒径在500nm-10μm之间。

所述基质为核/壳结构或全多孔结构的硅胶颗粒；核/壳结构硅胶颗粒由700nm-3μm直径的实心硅胶核和壳层厚度为150nm-500nm的多孔硅胶外层组成，孔径为3nm-20nm；全多孔结构硅胶颗粒粒径为500nm-10μm，孔径为5nm-100nm。

所述功能单体为两种，一种是含有羟基的烯类功能单体，其结构为：

其中Y代表-CONH-或者-OOC-；Z代表-CH₂OH；m的值为1-10的正整数，n的值为1-3的正整数；

另一种为甲叉双丙烯酰胺。

本发明的另一个目的在于提供一种聚合物链修饰的硅胶基质亲水作用色谱固定相的制备方法。该亲水作用色谱固定相不仅可以实现高选择性分离强极性化合物和亲水性物质，而且制备方法简单普适，容易实现。

具体步骤为：

a)硅烷化修饰硅胶颗粒的过程：将活化后的硅胶颗粒分散在甲苯中，超声，加入带有硫醇基团的硅烷化试剂，通氮气5-30分钟，搅拌，加热回流；停止反应后，冷却至室温，离心，弃上清液，之后将得到的固体颗粒依次使用甲苯、甲醇和丙酮抽滤洗涤，在真空干燥箱中至恒重；

b)聚合物链键合相的制备：将得到的硅烷化修饰硅胶颗粒、功能单体分散在反应溶剂中，超声，通氮气5-30分钟，加入引发剂，机械搅拌，在50-100℃下反应，停止反应，冷却至室温，离心，去除上清液，抽滤，并依次使用反应溶剂、水、甲醇洗涤微球，重复洗涤，在真空干燥箱中至恒重，既得聚合物修饰的硅胶液相色谱固定相。

步骤a)中搅拌回流时间为6-30h，加热温度为100-130℃，离心速度2500～10000rad/min，离心时间3-5分钟，重复抽滤洗涤次数为2～5遍，室温下真空干燥，时间为6-30小时；

步骤b)中反应时间为4-48小时，反应过程中为均匀缓慢加热至所需温度；离心速度为3000～10000rad/min，重复洗涤次数为2～5遍，室温下真空干燥6-30小时。

步骤a)中硅烷化试剂为含有巯基的硅烷化试剂。

所用的硅烷化试剂具有如下结构：

其中X代表甲氧基或者乙氧基，m的值为1-4的正整数；

其中硅胶颗粒与硅烷化试剂的加入量质量比为1:0.05至1:1。

硅胶颗粒占反应体系总质量的0.05～0.1wt％，硅烷化试剂的总摩尔数浓度为0.04～1mol/L，余量为反应溶剂。

步骤b)中所述两种功能单体的摩尔比为0.1:1-1:0.1；

步骤b)中甲叉双丙烯酰胺和含有羟基的烯类功能单体在反应溶剂体系中的总摩尔数浓度为0.05-0.4mol/L；硅胶颗粒加入质量与两种单体总质量比为1:0.1至1:10；

步骤b)所用的引发剂为偶氮类引发剂，包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐中的一种或两种及以上组合，加入总量占两种功能单体总质量的0.5～10％；

步骤b)所用的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、水中一种或二种及以上混合溶液。

本发明所述聚合物链修饰的硅胶基质亲水作用色谱固定相能够应用于极性物质和亲水性物质的色谱分离或糖肽、糖蛋白的富集和分离。

所述亲水作用固定相能够应用于核苷、碱基、氨基酸、酸性小分子、碱性小分子、肽段和蛋白质中的一种或两种以上的分离，能够应用于糖肽和糖蛋白的富集；分离和富集所适用的pH范围为2-8，流动相为体积浓度为50％-98％的乙腈，缓冲盐和水，其中，缓冲盐种类为乙酸铵，甲酸铵，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，缓冲盐浓度为0-120mM。

本发明具有如下优点：

本发明在材料表面通过硫醇-烯点击共聚的方法引入了特殊空间结构的羟基、酰胺基等亲水性功能基团，克服了传统后修饰方法步骤繁琐、反应效率低的缺点，制备的硅胶颗粒固定相表面具有三维结构的聚合物链，该结构可以提高材料的亲水性。

该制备方法操作简单，反应效率高，反应条件温和；固定相颗粒分散性好，粒径均匀，粒径分布窄；表面三维聚合物链状结构，富含多种亲水性基团，所制备的固定相亲水性好，分离选择性好；所制备固定相应用范围广，可广泛应用于强极性和亲水性样品分离分析和糖蛋白质组学。

附图说明

图1为实施例1中制备的聚合物微球的红外测试结果图；

图2为亲水作用色谱固定相用于核苷的分离色谱图；

图3为亲水作用色谱固定相用于有机酸的分离色谱图；

图4为亲水作用色谱固定相用于糖肽富集效果图。

具体实施方式

实施例1

1、巯基化硅球的制备：在250mL的圆底烧瓶中，加入120mL甲苯，加入5g粒径为5μm的硅胶颗粒,2ml的3-巯丙基三乙氧基硅烷，超声2分钟分散均匀，在烧瓶上接冷凝管，机械搅拌，保持300rad/min速度，通氮气10分钟。反应装置放在油浴锅中，110℃加热回流13h，停止反应，冷却至室温。高速离心机3000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到修饰了巯基的硅胶颗粒。

2、硅胶表面亲水聚合物链的制备：在250mL的圆底烧瓶中，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液(体积比为2:1)100mL，再加入2000mg修饰硅烷化的硅胶颗粒、1000mg N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺(THMA)、900mg甲叉双丙烯酰胺酸、100mg偶氮二异丁腈(AIBN)超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶剂中，之后通氮气15分钟，机械搅拌，保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀加热，在30min内升温至75℃。维持75℃条件下反应12小时，停止反应，冷却至室温，得到微球颗粒silica@(MBAAm-co-THMA)之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。得到固定相颗粒silica@(MBAAm-co-THMA)。

3、固定相颗粒的表征

经过红外分析测试，结果如图1所示。固定相颗粒在1382cm^-1表现出与亚甲基相连的羟基的特征峰，在1531cm^-1和1650cm^-1处表现出酰胺的特征吸收峰，在2956cm^-1和2882cm^-1表现出烷烃的碳-氢键的吸收峰，证明了固定相的结构，说明了这种方法制备固定相的可行性。

实施例2

把实施例1所制备的固定相颗粒填装于4.6mm*150mm的不锈钢高效液相色谱柱中，制备的色谱柱用于在亲水模式下分离核苷和碱基的混合物。分离条件为：乙腈/水(体积比为81比19)作为流动相，流速1ml/min，柱温为25℃，分离色谱图如图2所示，图中1，2，3，4，5分别为胸苷，尿苷，胞嘧啶核苷，胞嘧啶，鸟苷。分离结果显示，在本发明提供的亲水作用色谱柱上，核苷和碱基得到了很好的基线分离，表明该固定相具有典型的亲水作用特征和良好的分离选择性。

实施例3

使用实施例2所制备的亲水作用色谱柱分离有机酸性化合物。分离条件为：以88％的乙腈，2％的醋酸铵(浓度为100mM)，和10％的水作为流动相，流速1ml/min，柱温为25℃。分离色谱图如图3所示，图中1，2，3，4，5分别为苯酚，对苯甲酚，3,5-二硝基苯甲酸，苯甲酸，4-羟基苯甲酸。分离色谱图显示这几种有机酸在本发明提供的色谱柱上具有很好的保留，得到了良好的基线分离。

实施例4

1、把实施例1所制备的固定相颗粒填装于4.6mm*10mm的不锈钢色谱柱中，将制备的色谱柱用于糖肽富集。将糖蛋白(免疫球蛋白G，IgG)经过trypsin酶解，除盐冻干，并溶解于上样溶液中，从而制得浓度为500ng/μL的蛋白混合溶液。上样条件为85％的乙腈，15％的水和0.1％的三氟乙酸，上样量为100μL，洗脱条件为50％的乙腈，50％的水和0.1％的三氟乙酸.收集洗脱液冷冻浓缩得到富集产物。将酶解产物原液和富集产物进行MALDI-TOF MS鉴定。

2、将1μL待分析物与1μL DHB基质(20mg/mL 2,5-二羟基苯甲酸溶于含1％三氟乙酸的60％乙腈溶液)依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。

如图4所示，a图为未经过富集处理的IgG蛋白酶解产物原溶液，b图为富集产物。如图4a所示，在IgG蛋白酶解产物溶液中没有鉴定到IgG的糖肽，经富集之后(图4b)鉴定到大量糖肽；且无非糖肽的非特异吸附。表明材料具有较好的糖肽富集能力。

实施例5

1、烷基化硅球的制备：在50mL的圆底烧瓶中，加入25mL甲苯，加入700mg粒径为5μm的硅胶颗粒，0.3ml的3-巯丙基三乙氧基硅烷，超声2分钟分散均匀，在烧瓶上接冷凝管，机械搅拌，保持400rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，加热回流15h，停止反应，冷却至室温。高速离心机3500rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到修饰的硅烷化试剂的硅胶颗粒。

2、亲水固定相的制备：在50mL的圆底烧瓶中，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液(体积比为2:1)25mL，加入500mg修饰硅烷化的硅胶颗粒、150mg N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺(THMA)、100mg甲叉双丙烯酰胺酸、7mg偶氮二异丁腈(AIBN)超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶剂中，之后通氮气5分钟，机械搅拌，保持400rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀加热，在30min内升温至75℃。维持75℃条件下反应24小时，停止反应，冷却至室温，得到微球颗粒silica@(MBAAm-co-THMA)之后使用高速离心机用4000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。得到固定相颗粒silica@(MBAAm-co-THMA)。