一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法与流程

本发明涉及微纳尺度物质的分离技术领域，尤其涉及一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法。

背景技术：

近年来，随着精准医学这一概念的提出，科学界对于癌细胞、生物大分子、病毒等微纳尺度物质的分离分析日益重视。目前对于癌细胞等微纳尺度物质的分离方法主要有免疫磁珠法、场流分离法、电泳法及尺寸排阻法等。然而，这些方法仍然存在易出现假阴(阳)性结果、需要对目标物进行标记、分离度低、分离效率差等问题。其中，传统的尺寸排阻技术虽然操作简单，无需标记目标物，能实现高通量分离，但由于其固定相本身的尺寸大小是一定的，故对目标物很难实现准确、高效地分离。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法，将微流控技术、碳纳米材料制备技术、磁场辅助技术与尺寸排阻色谱技术结合起来，利用碳纳米纤维的表面和形貌性质而实现微纳尺度物质准确、高效地、无损分离。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法，包括以下步骤：

(1)在基底表面生长碳纳米纤维，得到碳纳米纤维/基底，在所述碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒，得到磁性碳纳米纤维/基底；

(2)将所述步骤(1)得到的磁性碳纳米纤维/基底组合成分离通道，在磁场作用下，使微纳尺度物质经过所述分离通道后分离。

优选地，所述步骤(1)中基底包括圆柱状基底和/或平面基底，所述圆柱状基底包括石英光纤、石英毛细管、铅笔芯、硅柱和金属丝中的任意一种，所述平面基底包括硅片和石英玻璃片中的任意一种。

优选地，所述步骤(1)中在碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒的方法包括以下步骤：将碳纳米纤维/基底在二氧化硅溶液中浸泡，干燥，再利用氧化反应和脱水缩合反应将带氨基的磁性纳米颗粒修饰到碳纳米纤维的一端，使碳纳米纤维的一端带有磁性，最后再用氢氟酸将碳纳米纤维表面的二氧化硅除去。

优选地，所述步骤(1)中碳纳米纤维的长度为10～1000μm，所述碳纳米纤维为垂直于基底的阵列形式。

优选地，所述步骤(1)中碳纳米纤维包括碳纳米管和实心的碳纳米纤维。

优选地，所述步骤(2)中组合包括：圆柱基底组合、平面基底组合或圆柱基底与平面基底组合；

当所述组合为圆柱基底组合时，所述圆柱基底的外径为1～1000μm；

当所述组合为平面基底组合或圆柱基底与平面基底时，所述分离通道的深度为300～2000μm。

优选地，所述步骤(2)中磁场强度为(0,0.5]t。

优选地，所述步骤(2)中磁场是由磁铁或者电磁铁产生。

优选地，所述步骤(2)中还包括利用毛细管或者peek管将分离通道的两端分别与进样口、流动相入口以及检测器相连，将微纳尺度物质注入进样口，将流动相注入流动相入口，微纳尺寸物质和流动相共同通过分离通道，进入检测器。

优选地，所述步骤(2)中微纳尺度物质包括红细胞、白细胞和癌细胞中的两种或三种。

本发明提供了一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法，包括以下步骤：在基底表面生长碳纳米纤维(carbonnanofibers，cnfs)，得到碳纳米纤维/基底，在所述碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒，得到磁性碳纳米纤维/基底，将磁性碳纳米纤维/基底组合成分离通道，在磁场作用下，微纳尺度物质经过所述分离通道后实现分离。本发明将微流控技术、碳纳米材料制备技术、磁场辅助技术与尺寸排阻色谱技术结合起来，创建一种新型的磁场辅助碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法，利用碳纳米纤维的表面和形貌性质而使目标物得到分离，能够通过改变外加磁场的强度、施加方向来调控分离通道内碳纳米纤维的间隙尺寸大小及其排列方向，从而实现对多种微纳尺度物质的分离，该方法分离对象广泛，操作简单，无损，安全。

本发明的分离机理：①距离磁场越近的碳纳米纤维所受的吸引力越大，即它们之间横向上所形成的间隙越小，纵向上所形成的分离通道尺寸越大，而距离磁场较远的碳纳米纤维所受的吸引力越小，它们之间横向上所形成的间隙越大，纵向上所形成的分离通道尺寸越小；②当磁场方向改变后，碳纳米纤维会朝相反的方向运动，横向上它们的间隙以及纵向上所形成的分离通道尺寸大小也会发生变化，当不同大小的细胞等微纳尺度物质进入该分离通道后，由于碳纳米纤维本身的摆动会带动微纳尺度物质不断与分离通道内两侧的碳纳米纤维所接触，小尺寸的微纳尺寸物质会很快进入小尺寸的碳纳米纤维间隙，而较大尺寸的微纳尺度物质则会随流动相向前运动一段距离后才会被较大尺寸的碳纳米纤维间隙所保留；③当磁场方向反复改变时，碳纳米纤维的间隙大小及方向的变化会使得微纳尺寸物质被反复的排阻，最终较大尺寸的待分离物会先被排阻出来，而较小尺寸的待分离物会后被流动相洗脱出来，从而最终实现对不同尺寸的细胞等微纳尺度物质的分离。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明实施例1磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法结构示意图，其中1为石英光纤，2为三根相同规格的磁性碳纳米纤维/石英光纤进行粘合后的结构，3为绕有线圈的铁棒，4为电源，5为毛细管，6为进样器，7为流动相注射泵，8为紫外检测器，9为磁性碳纳米纤维/石英光纤，10为分离通道；

图2为本发明实施例1施加磁场后磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中磁性纳米粒子的摆动方向示意图，图2(a)为磁场方向位于分离通道的左侧时磁性纳米粒子的摆动方向示意图，图2(b)为磁场方向位于分离通道的右侧时磁性纳米粒子的摆动方向示意图；

图3为本发明实施例1中红细胞和癌细胞在磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中的分离情况示意图，图3(a)为磁场方向位于分离通道的左侧时红细胞和癌细胞的分离情况示意图，图3(b)为磁场方向位于分离通道的右侧时红细胞和癌细胞的分离情况示意图；

图4为本发明实施例2磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法结构示意图；

图5为本发明实施例3磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法，包括以下步骤：

(1)在基底表面生长碳纳米纤维，得到碳纳米纤维/基底，在所述碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒，得到磁性碳纳米纤维/基底；

(2)将所述步骤(1)得到的磁性碳纳米纤维/基底组合成分离通道，在磁场作用下，使微纳尺寸物质经过所述分离通道后分离。

本发明在基底表面生长碳纳米纤维，在所述碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒，得到磁性碳纳米纤维/基底。

在本发明中，所述基底优选包括圆柱状基底和/或平面基底，所述圆柱状基底优选包括石英光纤、石英毛细管、铅笔芯、硅柱和金属丝中的任意一种，所述圆柱状基底的外径优选为1～1000μm；所述平面基底包括硅片和石英玻璃片中的任意一种，本发明对所述平面基底的厚度没有特殊的限定，本领域技术人员可以根据实际需要选择不同厚度的平面基底。

本发明优选对所述基底进行表面处理，本发明对所述表面处理的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基底表面处理方式即可，具体的如高温氧化或者酸处理氧化，必要时还包括对基底表面的刻蚀。

表面处理完成后，本发明在基底表面生长碳纳米纤维，得到碳纳米纤维/基底。本发明对所述在基底表面生长碳纳米纤维的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员的常规手段即可，具体的如利用化学气相沉积法在基底表面生长碳纳米纤维，参见《化学气相沉积法快速生长定向纳米碳管》，曹宗良等，新型炭材料,2003,18(1):48～52。

在本发明中，所述碳纳米纤维优选包括碳纳米管和实心的碳纳米纤维，本发明中，所述碳纳米纤维的长度优选为10～1000μm，本发明对所述碳纳米纤维的直径、碳纳米纤维的分布密度没有特殊的限定，本领域技术人员可以根据待分离微纳尺寸物质的大小、分离时间等实际需要进行限定。本发明中，所述碳纳米纤维优选为垂直于基底的阵列形式。

得到碳纳米纤维/基底后，本发明在所述碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒，得到磁性碳纳米纤维/基底。

在本发明中，所述在碳纳米纤维与基底表面无接触的一端附载磁性纳米颗粒的方法优选包括以下步骤：将碳纳米纤维/基底在二氧化硅溶液中浸泡，干燥，再利用氧化反应和脱水缩合反应将带氨基的磁性纳米颗粒修饰到碳纳米纤维的一端，使碳纳米纤维的一端带有磁性，最后再用氢氟酸将碳纳米纤维表面的二氧化硅除去。

本发明优选将碳纳米纤维/基底在二氧化硅溶液中浸泡，干燥得到二氧化硅包覆的碳纳米纤维/基底。本发明对浸泡时间、二氧化硅溶液的质量分数、二氧化硅溶液的溶剂没有特殊的限定，使碳纳米纤维/基底被二氧化硅溶液完全包覆即可。在本发明中，所述二氧化硅溶液的溶剂优选为水和乙醇的混合液。

浸泡完成后，本发明将二氧化硅包裹的产物进行自然干燥。在本发明中，所述干燥优选为室温干燥，不需要额外的加热或降温，自然干燥能够使二氧化硅包覆在碳纳米纤维下半部表面，而不包覆其头部。干燥后，本发明利用氧化反应和脱水缩合反应将带氨基的磁性纳米颗粒修饰到碳纳米纤维的一端，使碳纳米纤维的一端带有磁性。

本发明对所述氧化反应、脱水缩合反应的具体过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规技术手段即可，具体的，氧化反应可以是二氧化碳氧化法，浓酸氧化法，所述氧化反应使得碳纳米纤维的头部带有羧基，然后将头部带有羧基的碳纳米纤维与带氨基的磁性纳米颗粒在乙醇等溶液中反应，经脱水缩合后，使得碳纳米纤维头部带上磁性纳米颗粒。

得到磁性碳纳米纤维/基底后，本发明将所述磁性碳纳米纤维/基底组合成分离通道，在磁场作用下，使微纳尺度物质经过所述分离通道后实现分离。

在本发明中，所述组合包括：圆柱基底组合、平面基底组合或圆柱基底与平面基底组合；

当所述组合为圆柱基底组合时，所述圆柱基底的外径优选为1～1000μm；在本发明实施例中，优选采用两根或者三根石英光纤组合成分离通道，当所述石英光纤为两根时，优选按照两者平行组合得到分离通道，当所述石英光纤为三根时，优选按照“金字塔型”组合成分离通道，如图1所示，分离通道10是由三根相同规格的磁性碳纳米纤维/石英光纤2进行粘合后得到的；

当所述组合为平面基底组合或圆柱基底与平面基底时，所述分离通道的深度优选为300～2000μm，等于引流用的毛细管或者peek管的外径大小；在本发明实施例中优选平面基底上下平行组合或圆柱基底与平面基底上下平行组合得到分离通道，所述平面基底上下平行组合，更优选为两个石英玻璃片上下平行排列组合成分离通道(如图5所示)，所述圆柱基底与平面基底上下平行组合更优选为两个石英毛细管和一个石英玻璃片上下平行组合成分离通道(如图4所示)。

分离通道组合完成后，本发明在磁场作用下，使微纳尺寸物质经过所述分离通道后实现分离。在本发明中，所述磁场强度优选为(0,0.5]t，更优选为0.2～0.3t。

在本发明中，所述微纳尺度物质优选包括红细胞、白细胞和癌细胞中的两种或三种。

在本发明中，所述磁场优选由磁铁或者电磁铁产生，本发明优选通过改变磁铁的位置改变磁场的方向，优选通过改变电磁铁的电源大小改变磁场的强度大小，控制磁性碳纳米纤维的摆动，当磁场方向不同时，磁性碳纳米纤维的摆动不同，如图2所示。当不同大小的细胞等微纳尺度物质进入该分离通道后，由于碳纳米纤维本身的摆动会带动微纳尺寸物质不断与分离通道内两侧的碳纳米纤维所接触，小尺寸的微纳尺度物质会很快进入小尺寸的碳纳米纤维间隙，而较大尺寸的微纳尺度物质则会随流动相向前运动一段距离后才会被较大尺寸的碳纳米纤维间隙所保留，从而实现微纳尺度物质的分离。

本发明还优选包括利用毛细管或者peek管将分离通道的两端与进样口、流动相入口以及检测器相连，将微纳尺度物质注入进样口，将流动相注入流动相入口，微纳尺寸物质和流动相共同通过分离通道，进入检测器。在本发明中，优选分离通道的深度等于所述毛细管或者peek管的外径大小。

本发明对所述流动相的种类、流动相的流速、微纳尺度物质注入进样口的注入速率没有特殊的限定，本领域技术人员可以根据待分离微纳尺度物质的种类、尺寸大小等进行选择和优化。

在本发明中，所述微纳尺度物质经过分离通道后还优选包括利用检测器对微纳尺寸物质进行检测，以确认待分离微纳尺度物质是否实现了分离。本发明对所述检测器的种类没有特殊的限定，采用本领域常用的检测器即可，在本发明实施例中优选紫外检测器。

下面结合实施例对本发明提供的磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱分离方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

选取外径为300μm的石英光纤1为基底，处理后在其表面利用化学气相沉积法生长长度为30μm的碳纳米纤维，得到碳纳米纤维/基底，将碳纳米纤维/基底先在二氧化硅溶液中浸泡几分钟，取出基底后自然干燥，再利用氧化反应和脱水缩合反应将带氨基的磁性纳米颗粒修饰到碳纳米纤维的一端，使碳纳米纤维的一端带有磁性，得到磁性碳纳米纤维/石英光纤9，将三根相同规格的磁性碳纳米纤维/石英光纤按照图1所示进行粘合，组成分离通道10，并将其放入微流控芯片内，用毛细管5将分离通道分别与进样器6、流动相注射泵7以及紫外检测器8相连，利用紫外检测器8作为检测手段，在分离通道一侧设置电磁铁产生磁场，如图1所示，其中2为三根相同规格的磁性碳纳米纤维/石英光纤进行粘合后的结构，其中3为绕有线圈的铁棒，4为电源，可以通过调节电源的强度调节磁场强度。

选用红细胞和癌细胞为待分离微纳尺寸物质进行分离，将待分离微纳尺寸物质经过进样器注入分离通道，将流动相pbs缓冲液经过流动相注射泵注入分离通道，控制磁场的大小为0.2t，磁场方向交替改变，当磁场方向位于分离通道的左侧时，磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中磁性纳米粒子的摆动方向如图2(a)所示，其中1为组合成的色谱分离通道，2为磁性碳纳米纤维，3为绕有线圈的铁棒，4为电源，5为横向上磁性碳纳米纤维之间的间隙，6为纵向上磁性碳纳米纤维之间的间隙；当磁场方向位于分离通道的右侧时，磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中磁性纳米粒子的摆动方向如图2(b)所示，其中1为组合成的色谱分离通道，2为磁性碳纳米纤维，3为绕有线圈的铁棒，4为电源，5为横向上磁性碳纳米纤维之间的间隙，6为纵向上磁性碳纳米纤维之间的间隙；当磁场方向位于分离通道的右侧时。通过改变磁场的方向，使得分离通道内的磁性碳纳米纤维能够摆动，使得碳纳米纤维的运动状态发生改变，即横向上磁性碳纳米纤维之间的间隙5和纵向上磁性碳纳米纤维之间的间隙6的大小发生改变，使得待分离的微纳尺度物质反复被排阻，最终大尺寸的待分离的微纳尺度物质由于不能进入较小的间隙内先被洗脱出来，而小尺寸的待分离的微纳尺度物质则会较早的进入间隙而后被流动相后洗脱出来，实现其分离，如图3所示，其中图3(a)为当磁场方向位于分离通道的左侧时，红细胞和癌细胞在磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中的示意图，其中1为组合成的色谱分离通道，2为磁性碳纳米纤维，3为绕有线圈的铁棒，4为电源，7为红细胞，8为癌细胞；当磁场方向位于分离通道的右侧时，红细胞和癌细胞在磁场辅助微流控碳纳米纤维尺寸排阻色谱中的示意图如图3(b)所示，其中1为组合成的色谱分离通道，2为磁性碳纳米纤维，3为绕有线圈的铁棒，4为电源，7为红细胞，8为癌细胞，经分离体系分离后，大尺寸的癌细胞8先被排阻出来，小尺寸的红细胞7后被流动相带出来，经检测器检测后，发现实现了红细胞和癌细胞的分离。

实施例2

把实施例1中的三根相同规格的石英光纤进行粘合替换为表面长有cnfs的石英光纤或铅笔芯或石英毛细管或金属与石英玻璃片进行组合得到分离通道，结果如图4所示，其余与实施例1相同，能够实现微纳尺寸物质的分离。

实施例3

把实施例1中的三根相同规格的石英光纤进行粘合替换为表面长有cnfs的两块高纯石英片进行组合得到分离通道，结果如图5所示，其余与实施例1相同，能够实现微纳尺寸物质的分离。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。