345和光学组装件304可以在许多情况下可作为一个单元移动，使得它们可以跨取 样腔室的焦平面中的各个视野进行扫描。
[0058] 在一些实施方式中，本发明的系统包括载玻片分析仪150,其中所述载玻片分析仪 还包括处理器350、存储器模块335、通信模块360、发射器375、显示器160和控制面板170。 用户输入可以通过控制面板170而被输入至载玻片分析仪150中，所述控制面板170转而 向处理器350发送指令。处理器350可以发送和接收各种指令，例如，用于调节载玻片接收 器155的位置以确定要分析哪个取样腔室、用于调节滤光器组装件310的位置以确定要使 用哪个滤光器、用于调节光学组装件304的放大率和焦平面，或者用于命令图像捕捉元件 345以捕捉一个或多个图像。处理器350可以耦合至用于存储捕捉到的图像的存储器模块 355。存储器模块355可以包括随机存取存储器（RAM)、快闪存储器、硬盘驱动器，或者其他 易失性或非易失性存储器。处理器350可以耦合至发射器360,所述发射器360可以向各种 接收器传输365所获取的可视数据。发射器375可以在认证的安全传输中传输所获取的可 视数据，例如由HIPAA(健康保险便利和责任法案）认证的传输365。可以使用图像分析软 件来分析所获取的和/或所传输的可视数据，以确定体液中存在的细胞类型或分析物。可 视数据的分析可以永久地和自动地记录在受试者的健康记录中。
[0059] 多种传输技术可由发射器375用于传输所获取的可视数据。传输可以是无线传输 或有线传输。在一些实施方式中，处理器350被配置有可以提供可视数据分析的计算机程 序代码。在一些实施方式中，由第二系统370来分析所传输的可视数据。第二系统例如可 以是第二计算机系统370。第二系统可以分析所传输的视觉图像，并且第二系统可以将分析 数据的结果返回至系统10。处理器350继而可以将数据分析的结果显示在显示器160上。 在一些实施方式中，处理器350可被编程用于对所获取的图像本身进行至少一些或者甚至 全部分析，并继而在显示器160上显示分析结果。在一些实施方式中，使用系统10内的处 理器350对载玻片100进行的分析不需要访问发射器。
[0060] 在载玻片100已被分析之后，载玻片100可以作为无毒废弃物直接地由被配置用 于从载玻片获取可视数据的成像系统，或者由载玻片分析仪150处置，或者可以保存载玻 片100以供进一步的分析。可选地，可以提供贮器并将其用于随本发明的套件处置载玻片。
[0061] 如上文所述，可以选择性地移动滤光器组装件310和带有载玻片100的载玻片接 收器155,以选择所使用的特定滤光器和所要分析的特定取样腔室。图4图示了具有可移动 载玻片和可移动滤光器组装件的、用于分析体液的系统。分图A图示了如何能够相对于成 像系统定位载玻片。分图B和分图C图示了能够使可移动滤光器组装件移动的方式。
[0062] 如图4的分图A中所示，可以定位载玻片接收器155从而可以分析第三取样腔室 125,并且可以定位滤光器组装件310从而可以在获取视觉图像的过程中使用第二滤光器 320。如分图B中所示，可以在方向401上移动滤光器组装件310,从而可以改为使用第三滤 光器325,并且可以在方向404上移动载玻片接收器155,从而可以分析第二取样腔室120。 如分图C中所示，可以在方向407上移动滤光器组装件310,从而可以使用第一滤光器315。 此外，可以将滤光器组装件310上的特定滤光器的任何数目的组合与载玻片100的特定取 样腔室移动成光学对准。 本发_的方法
[0063] 用于体液分析的方法和过程可以提供受试者的总体健康状态的概况。例如，全血 细胞计数可以提供关于受试者血液中的细胞的信息。异常高或异常低的计数可指示出许 多形式的疾病的存在，并且因此血细胞计数是医学上最常进行的血液测试之一。用于体液 分析的方法和过程通常需要多步方案。例如，用于获取全血细胞计数的代表性方法通常需 要裂解过多的红细胞以便获得准确的计数。此外，经常使用需要以特定方式操作的染料组 合来实现白细胞区分，例如在白细胞区分中使用的抗体结合染料可以作为浓缩的备料来提 供，其在使用之前需要保持在特定温度内。
[0064] 与此相反，本发明的系统提供了用于分析诸如血液或唾液等体液的实用和方便的 方法。本发明的方法可以包括将亚微升体积的全血稀释到载玻片（或腔室）内的稀释剂中， 并将载玻片放置在成像系统的获取范围内，所述成像系统被配置用于从载玻片获取可视数 据以供分析。稀释剂可以是磷酸盐缓冲盐水，其包括诸如吖啶橙（AO)等核酸染料和诸如 十二烷基硫酸钠（SDS)等阴离子型表面活性剂。在一些实施方式中，本发明有效地提供了 用于使用稀释在载玻片或腔室的底部形成细胞的均匀单层和用于使用荧光染料给白细胞 和血小板染色以将之与红细胞区分开的方法。
[0065] 由于红细胞拥有可以在细胞腔室内具有随机朝向的盘状形状，因此计数未制备的 红细胞是在计算上十分困难的任务。因此，使用第二试剂（十二烷基硫酸钠（SDS))来使红 细胞成球形。SDS是减小红细胞膜的表面张力的阴离子型表面活性剂。当以适当的浓度添 加到血液时，其发挥作用以等体积地使细胞成球形，从而导致细胞失去其双凹圆盘形状而 变成均匀的球体。球化的红细胞以均匀的方式堆叠成单层，并且它们的一致的形状允许其 能够使用简单的可视数据处理技术而得到容易和准确的计数。可以使用本发明的成像系统 获取合适的可视数据。在一些实施方式中，本发明有效地提供了用于分析样品中的红细胞 的方法，其中红细胞的球化使可视数据中由于血细胞朝向而造成的红细胞图像的可变性最 小化。
[0066] 可以使用稀释剂来提供白细胞、血小板和球化的红细胞的准确计数。可以使用稀 释剂来控制载玻片内或腔室内的血细胞的密度，并且可以使用稀释剂在腔室内部形成细胞 的单层。当细胞能够在腔室中沉淀并形成单层时，本发明的方法可以提供单个图像内的所 有红细胞的准确计数。可以优化稀释因子以同时提供对例如体液中红细胞和白细胞的分 析。由于白细胞在全血中的数目相比于红细胞少大约1000倍，因此可以优化稀释因子以便 对足够数目的白细胞计数。在一些实施方式中，对全血的5至10倍稀释提供了适合于同时 分析红细胞和白细胞的细胞单层。
[0067] 载玻片或腔室内的体液可以使用试剂来进行分析，所述试剂包括具有对核酸的自 然亲和力的、单一且稳定的染料。稳定染料例如可以是吖啶橙。当结合至DNA时，叮啶橙作 为单体插入DNA中，并在在蓝光激发下产生强烈的绿色荧光。当结合至RNA和蛋白质时，它 以聚合体形式形成了静电混合物，所述静电混合物在蓝光激发下产生红色荧光。由于结合 的吖啶橙发出的荧光比未结合的染料强度更强，因此使用本发明的方法对体液染色并不需 要洗涤步骤。由于不同的白细胞类型具有不同量的DNA和RNA，因此白细胞群体可以产生 不同相对量的红色荧光和绿色荧光。这允许基于细胞类型的颜色对细胞类型进行分离。由 于血小板通常以少量RNA为特征，因此血小板可使用吖啶橙进行微弱染色。血小板内少量 的RNA允许使用本发明的方法检测血小板。在一些实施方式中，本发明的方法允许对少量 体液中的全血细胞计数的确定。
[0068] 在一些实施方式中，样品分析利用约0. 5nL至约50nL的体液、约InL至约IOOnL 的体液、约IOOnL至约150nL的体液、约150nL至约200nL的体液、约200nL至约250nL的 体液、约250nL至约300nL的体液、约300nL至约350nL的体液、约350nL至约400nL的体 液、约400nL至约450nL的体液、约450nL至约500nL的体液、约500nL至约550nL的体液、 约550nL至约600nL的体液、约600nL至约650nL的体液、约650nL至约700nL的体液、约 700nL至约750nL的体液、约750nL至约800nL的体液、约800nL至约850nL的体液、约850nL 至约900nL的体液、约900nL至约950nL的体液、约950nL至约1 μ L的体液、约0. 5 μ L至 约1 μ L的体液、约1 μ L至约5 μ L的体液、约5 μ L至约10 μ L的体液、约10 μ L至约20 μ L 的体液、约20 μ L至约30 μ L的体液、约30 μ L至约40 μ L的体液或者约40 μ L至约50 μ L 的体液。
[0069] 在一些实施方式中，本发明的方法可以分析例如跨表面区域分散成单层的小体积 的体液。小体积的体液可以是小于约IOOnL的体液、小于约200nL的体液、小于约300nL的 体液、小于约400nL的体液、小于约500nL的体液、小于约600nL的体液、小于约700nL的体 液、小于约800nL的体液、小于约900nL的体液、小于约1 μ L的体液、小于约2 μ L的体液、 小于约3 μ L的体液、小于约4 μ L的体液、小于约5 μ L的体液、小于约6 μ L的体液、小于约 7 μ L的体液、小于约8 μ L的体液、小于约9 μ L的体液或小于约10 μ L的体液。 获取视觉图像
[0070] -旦体液在腔室内或在包括两个或更多个腔室的载玻片内得到适当稀释，即可获 取和分析体液的视觉图像。在一些实施方式中，本发明的方法包括在包含磷酸盐缓冲盐水、 十二烷基硫酸钠和吖啶橙的单一稀释剂中稀释血液样品，随后通过例如使用低放大率物镜 的荧光和暗场成像从体液获取可视数据。在一些实施方式中，对所获取的视觉图像的分析 提供了样品的全血细胞计数。
[0071] 可以例如使用卤素灯泡、暗场聚光器和大画幅相机来拍摄视觉图像。视觉图像获 取可以包括获取暗场视觉图像和荧光视觉图像的组合，以便计数和区分例如一个腔室内的 白细胞、血小板和红细胞。在一些实施方式中，获取一个视觉图像。在一些实施方式中，获 取多个视觉图像。本发明的成像系统例如可以获取至少一个暗场视觉图像、至少两个暗场 视觉图像、至少三个暗场视觉图像、至少四个暗场视觉图像、至少五个暗场视觉图像、至少 六个暗场视觉图像、至少七个暗场视觉图像、至少八个暗场视觉图像、至少九个暗场视觉图 像或至少十个暗场视觉图像。本发明的成像系统例如可以获取至少一个亮场视觉图像、至 少两个亮场视觉图像、至少三个亮场视觉图像、至少四个亮场视觉图像、至少五个亮场视觉 图像、至少六个亮场视觉图像、至少七个亮场视觉图像、至少八个亮场视觉图像、至少九个 亮场视觉图像或至少十个亮场视觉图像。本发明的成像系统例如可以获取至少一个荧光 视觉图像、至少两个荧光视觉图像、至少三个荧光视觉图像、至少四个荧光视觉图像、至少 五个荧光视觉图像、至少六个荧光视觉图像、至少七个荧光视觉图像、至少八个荧光视觉图 像、至少九个荧光视觉图像或至少十个荧光视觉图像。本发明的成像系统可以获取暗场视 觉图像、亮场视觉图像或荧光视觉图像的任意组合。在一些实施方式中，亮场视觉图像或暗 场视觉图像用于对红细胞进行成像。在一些实施方式中，1-通道荧光视觉图像或2-通道荧 光视觉图像用于对白细胞或血小板进行成像。在一些实施方式中，最终图像产物包括来自 至少三个图像的数据。
[0072] 本发明的成像系统可被配置用于获取细胞类型的2-通道荧光视觉图像。例如，可 以使用4χ物镜和470nm激发光来获取包含白细胞的视觉图像，其中通过自动改变放置在相 机前方的发射滤光器而顺序地获取红色通道和绿色通道。可以例如通过使腔室移动和将图 像场拼接到一起，来对整个细胞腔室进行成像。
[0073] 本发明的成像系统可被配置用于获取细胞类型的1-通道荧光视觉图像。例如，可 以使用IOx物镜来获取包含血小板细胞的视觉图像。在一些实施方式中，可以使用与获取 白细胞的视觉图像所使用的相同的激发光源和红色发射滤光器来获取血小板的视觉图像。 在一些实施方式中，可以使用相同的物镜来拍摄不同细胞类型的暗场图像。举例而言，可以 例如使用4x物镜在相同的激发下拍摄红细胞和白细胞的暗场图像。
[0074] 可以从腔室的表面区域的区段获取视觉图像，或者可以从腔室的整个表面区域获 取视觉图像。在一些实施方式中，细胞群体的密度与分析所需的视觉图像的数目相关联。例 如，从计数腔室的中心拍摄的单一图像足以向对红细胞群体的准确分析提供一致的可视信 息。与此相反，对于分析血小板群体，可能需要来自腔室的不同表面的至少两个视觉图像。 图10中进一步详细示出和描述了使用本发明的设备、系统和方法拍摄的代表性图像。可以 将可视数据传输至接收器。在一些实施方式中，接收器与包括处理器的计算机系统通信，其 中所述计算机系统被编程用于进行对可视数据的分析。 数据分析
[0075] 为了从所获取的视觉图像提供全血细胞计数（包括红细胞、白细胞和血小板中的 任意一个或全部），本发明的系统可以利用从可视数据鉴别和量化单个细胞类型的算法。为 了确定可视数据中的特定物体是否例如为白细胞，系统可以鉴别所获取的一组视觉图像， 例如，使用特定的滤光器和/或在特定的发射波长内进行鉴别。系统可以基于荧光来对所 获取的一组可视数据进行分组。可以将来自特定图像的平均或中值荧光强度从包含背景荧 光信号的参考图像中减去。继而可以使用阈值转换法或分水岭分割来鉴别细胞区域，并且 可以计算每个细胞的平均通道强度。
[0076] -旦鉴别出细胞，即可对其进行计数。例如，可以通过与参考数据库中存在的各种 参考图像作比较来鉴别一个图像或一组图像中的红细胞或白细胞或血小板的数目。一旦 计数了红细胞或白细胞或血小板的数目，即可确定亚群和相关的百分比。可以根据不同亚 群跨两个或更多个频率的荧光响应的范围来对其进行分组。此外，可以生成和分析绿色荧 光强度和红色荧光强度的二维直方图的混合高斯建模。还可以创建和分析更高维度的直方 图，例如，包括不同波长或波长范围上的荧光强度以及光散射测量值的直方图。为了分析数 据，可以进行对该多维数据的主成分分解，并且可以将至少一个维度拟合到例如高斯模型、 偏T(skew-T)模型或对数正态模型中。可以将数据挖掘技术和算法，诸如监督聚类或无监 督聚类技术等应用于对细胞亚群的鉴别和计数。
[0077] 可以对所获取的视觉图像进行傅里叶变换或其他数学变换，以获得可以用于数据 分析的、载玻片中的体液的衍射图案。可以分析衍射图案以例如确定细胞半径的分布。基 于细胞半径，可以从视觉图像确定红细胞的体积分布、细胞平均体积（MCV)以及红细胞分 布宽度（RDW)。在一些实施方式中，向腔室提供的样品大小的体积是已知的，并且可以使用 MCV和RBC来确定血细胞比容（HCT)计数。
[0078] 对所获取的视觉图像的数据分析可以包括对视觉图像的模板匹配。例如，可以使 用成像系统来获取未染色血液的亮场图像或暗场图像，并且可以将所获取的可视数据与参 考数据库中的可视数据进行对比。可以在低放大倍数和高放大倍数下获取和分析可视数 据。例如，在高放大倍数下，可以在图像中看到作为可基于大小而与其他细胞区分开的微尘 状物体的血小板。
[0079] 使用本发明的方法和系统进行的数据分析可以鉴别血细胞的多个群体和多个亚 群。例如，分析可以鉴别样品的平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC)。可以使用多个波长或波 长范围的光来对血液样品进行成像，并且可以计算按细胞类型划分的光的平均吸收率。计 算机系统例如可以对血细胞的球形应用比尔郎伯定律模型（Beer-Lambert Law model)，并 确定MCHC。 可伸用全血细朐计数检测的状况
[0080] 全血细胞计数提供了关于血液中的细胞（尤其是红细胞、白细胞和血小板）的类 型和数目的重要信息。CBC可以帮助医生鉴别诸如虚弱、疲乏、损伤（bruising)或癌症等 状况的生理原因。CBC可以用于诊断诸如贫血、感染或癌症等状况。CBC可以允许临床医师 监测受试者对于治疗的生理反应，并且CBC可以允许受试者监测受试者自身对于治疗的反 应。CBC可以提供对受试者的白细胞、红细胞和血小板群体的分析。
[0081] 在临床实践中可以使用全血细胞计数诊断出的常见异常包括贫血症、红细胞增多 症、白细胞减少症、白细胞增多症和血小板减少症。可以使用CBC诊断的常见类型的贫血症 的非限制性示例包括缺铁性贫血、地中海贫血、血红蛋白病（比如镰状细胞性贫血）、药物 相关贫血症以及慢性疾病相关贫血症。
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