一种d-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫体外诊断领域，具体涉及一种D-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，能够在短时间内实现对生物样品中D-二聚体的定量检测，具有操作简单，灵敏度高，低成本等特点。
技术背景
[0002]纤维蛋白溶解系统(fibrinolysis system)是人体最重要的抗凝系统，由4种主要部分组成:纤溶酶原(口138111；[1^611)、纤溶酶原激活剂(。138111；[叫611 ac t i vator，如t_PA，u_PA)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶抑制物(plasmin activator inhibitor, PA1-1，antiplasmin)。当纤维蛋白凝结块(fibrin clot)形成时，在tPA的存在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，形成纤维蛋白产物(FDP)，FDP由下列物质:X-寡聚体(X-oligomer)、D-二聚体(D-Dimer)、中间片段(Intermediate fragments)、片段E(Fragment E)组成。其中，X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位。
[0003]纤溶蛋白降解产物中，唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。只要机体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动，D-二聚体就会升高。在生理状态下，人体正常D-二聚体的水平一般在200yg/L以下，机体保持着凝血与纤溶动态平衡，以保证纤维蛋白及时形成和及时清除。心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等均可导致D-二聚体升高。因此，理论上，D-二聚体的定量检测可反映药物的溶栓效果、也可用于诊断、筛选新形成的血栓。
[0004]目前，用于D-二聚体的定量检测方法中应用较多的主要为:酶联免疫吸附法(ELISA),乳胶颗粒凝集法(LATEX)、免疫过滤胶体金染色法、双抗体RBC凝集法和放免法等。临床最常用是:ELISA、LATEX和免疫过滤胶体金染色法，其中LATEX法测定速度快，但敏感度不如ELISA法;ELI SA法敏感度高，但检测时耗时较长。中国专利(201110051367.2)公开了一种D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法，该试剂盒由下述成分组成:1)D-二聚体校准品；2)D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板;3)铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体;4)洗涤液;5)增强液;6)分析缓冲液。该试剂盒采用铕元素标记抗体，铕元素属于镧系稀土金属元素，价格比较昂贵，且铕荧光寿命lms，在水中不稳定，需要额外添加增强剂才能获得稳定的荧光。
[0005]近年来，生物分析技术领域得到了快速的发展，出现了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技术是其中最活跃的一支，在科研和实际应用领域都获得了广泛的重视。微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用，尤其是在免疫分析领域已崭露头角。
[0006]表面功能化的磁性微球作为固相载体，可以用来有效地捕获核酸、蛋白分子、病毒颗粒甚至细胞，已经被广泛地应用于各种生化指标的临床诊断等领域。而微流控芯片系统具有快速、高效、集成化等特点，两者相结合，将成为一种新型的高性能检测方法，以解决当前检测方法中存在的灵敏度低，检测过程复杂，难以实现微量样本检测的问题，有望进一步推动临床检测仪器向便携化和微型化发展。
[0007]免疫磁珠的生物微流控芯片是将磁颗粒技术，免疫分析集成到微流控芯片上的一种分析检测方法，目前这种综合性的检测方法的主要难点表现为:I)液体在芯片内部微流动的智能控制，目前常采用的方法是在芯片内部设置多个微栗和微阀，使得微流控体系变得更加复杂化;2)反应体系的混合不充分，导致反应不充分;3)集成化程度不高，导致非特异性背景高。
【发明内容】
[0008]为弥补现有技术的不足，本发明旨在提出一种D-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，检验人员只需经过简单操作，即可在15分钟内实现样品中D-二聚体浓度的定量检测。检测结果灵敏度高，准确可靠，重复性好。
[0009]本发明所述一种D-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片结构主要包括盖片(I)和底片(11);其中盖片(I)上的加样口(2)，样本液流通道(6)，第一生物标记物存储池(4)，微混合器(7)，过渡区(10)依次连接;底片(11)上的过滤器(12)，反应池(13)，清洗池(14)，检测池(15)，溶液释放通道(18)依次连接，底片(11)上的检测池(15)通过溶液释放通道(18)与清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)连接；
[0010]所述第一生物标记物存储池(4)中存储酶或发光剂标记的抗D-二聚体抗体溶液；所述清洗液存储池(16)，发光液存储池(17)中存储清洗液、发光基底液;所述反应池(I 3)中包被磁颗粒标记的抗D-二聚体抗体;所述盖片(I)和底片(11)用胶带(20和22)密封组装;所述第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)、发光基底液存储池(17)和检测池(I5)中存储预封装试剂；
[0011 ]所述第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)、发光基底液存储池(17)为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体;所述微流控芯片的过滤器(12)由一个具有固定形状的腔体和滤血膜组成；所述过滤器滤血膜材料为玻璃纤维膜，聚酯纤维膜或Cy toSep 膜等。
[0012]具体地，所述微流控芯片的第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)的体积为10?500yL，为液囊或腔体。
[0013]优选地，微流控芯片的第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)的体积为1?300yL。
[0014]具体地，所述微流控芯片的微混合器(7)是宽度为20?300μπι，深度为10?ΙΟΟμπι的蛇形，折线形或方波形结构。
[0015]优选地，所述微混合器为宽150μπι，深度为50μπι的方形结构，在外部压力作用下，可使样本和试剂充分混合，提高反应效率。
[0016]具体地，所述微流控芯片的反应池(13)为管状通道或矩形的毛细管微通道，允许微液体流进或通过。
[0017]具体地，所述微流控芯片的反应池(13)为管状通道，直径为0.5?10mm。
[0018]优选地，所述微流控芯片的反应池(13)为管状通道，直径为5mm，进一步优选2mm或Imm0
[0019]具体地，所述微流控芯片的反应池(13)为矩形通道，宽为0.1?5mm，深度为0.01?2mm，长为5 ?40mm ο
[0020]优选地，所述微流控芯片的反应池(13)为矩形通道，宽为0.3?2mm，深度为0.2?1mm，长为5 ?20mm ο
[0021]具体地，所述磁颗粒为核壳型的超顺磁性颗粒，磁核为Fe3(k或γ-Fe203化合物，夕卜壳为聚苯乙稀，磁颗粒粒径为0.1?ΙΟμπι。
[0022]优选地，磁核为Fe3(k化合物，且磁颗粒粒径为I?3μηι，更优选粒径为2.0μηι的磁颗粒。
[0023]具体地，所述加样口(2)的加样体积为5?200μ1，优选10yL，进一步优选50yL，再进一步优选10yL。
[0024]具体地，所述盖片(I)上还有空气栗(3)和气流微通道(5)，按压空气栗(3)使气流通过气流微通道(5)驱动样本通过样本液流通道(6)。
[0025]具体地，本发明所述微流控芯片的过滤器主要包括腔体和滤血膜，所述腔体体积为样本体积的3?1倍，优选腔体体积为样本体积的4?6倍。
[0026]具体地，本发明所述微流控芯片底片中过滤器内的滤血膜材料可以为玻璃纤维膜，聚酯纤维膜或CytoS印膜等，作为优选以玻璃纤维膜作为滤血膜。
[0027]本发明所述微流控芯片的制备方法如下:
[0028]步骤I)酶或发光剂标记抗D-二聚体抗体，磁颗粒标记抗D-二聚体抗体，这两种抗体可同一种抗体或不同种类抗体；
[0029]步骤2)将酶或发光剂标记抗体溶液放入盖片的第一生物标记物存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底片的反应池，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光液存储池中，密封，用胶带(20和22)密封盖片和底片，并组装形成一完整的微流控芯片。
[0030]本发明所述微流控芯片，各功能区之间通过微通道和微结构进行衔接，内部形成一个完整的液流和气流系统。
[0031]本发明所述微流控芯片盖片和底片内的微通道和微结构的加工工艺包括模塑法、热压法、激光刻蚀法和软光刻法等，本发明的实施例中优选模塑法来制作微流控芯片，可有效降低检测成本。
[0032]本发明所述微流控芯片盖片和底片内除上述主要微通道和微结构外还有许多透气孔，用于排除液体流动过程中产生的气泡，同时还有用于组装固定的让位孔和立柱。
[0033]本发明所述微流控芯片盖片上的空气栗(3)主要是通过气流通道(5)传递压力，主要作用是用于样本和第一生物标记物的混合，提高一级孵育效果。
[0034]本发明所述微流控芯片的气流通道尺寸为0.1?ΙΟΟμπι，进一步优选2?50μηι。
[0035]本发明所述微流控芯片盖片的过渡区是盖片和底片连接