专利名称：糖蛋白的测定方法
技术领域：
本发明涉及试样中糖蛋白、糖肽或者糖化氨基酸的测定方法，以及该测定方法所使用的糖蛋白测定用试剂。
背景技术：
糖蛋白是蛋白质被非酶糖化的蛋白质，是糖基侧的醛基和蛋白质侧的氨基形成席夫碱之后，经过阿马多利重排而形成的阿马多利化合物。糖蛋白在机体内广泛存在，其中血液中糖蛋白的浓度依赖于血液中溶解的葡萄糖等单糖的浓度。作为糖蛋白，可例举如蛋白质的氨基末端的α-氨基被糖化的糖蛋白(例如，糖化血红蛋白)、蛋白质的内部赖氨酸残基的ε-氨基被糖化的糖蛋白(例如，糖化白蛋白)，由于血清中的糖化白蛋白的浓度或红细胞中的糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白的依赖存在比反映过去一定时间的平均血糖值，因此作为糖尿病的诊断、病症的控制、治疗效果的判断等临床诊断指标来使用。
作为糖蛋白的测定方法，例如有酶法(例如，参考专利文献1及2)。酶法由如下的测定工序形成使蛋白质分解酶作用于试样中的糖蛋白，使成为后续工序的底物的糖肽或者糖化氨基酸游离的前处理工序；以及使糖肽特异酶或者糖化氨基酸特异酶(例如，氧化酶)作用于游离的底物，生成可检测的生成物(例如，过氧化氢)，测定该可检测生成物的工序。
由酶法进行的糖蛋白测定中，蛋白质分解酶要生成供于显色反应的底物。因此，为了在规定的时间内充分供给该底物，就需要大量使用蛋白质分解酶。但是，由于蛋白质分解酶不仅分解试样中的糖蛋白，还同时分解测定系中存在的测定所必须酶(例如氧化酶)，因此如存在高浓度蛋白质分解酶，则存在原本应该测定的糖蛋白的测定精度下降的问题。
另一方面，作为过氧化氢的测定方法，通用在过氧化物酶(POD)的存在下通过4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑腙(MBTH)等偶联剂(coupler)与酚系、苯胺系或者甲苯胺系的生色团的氧化缩合而生成色素的Trinder试剂类，以及在POD的存在下直接氧化显色的无色色素的方法。作为无色色素，已知有改善了水溶性的三苯甲烷系的无色色素(参考专利文献3)，特别适用于高灵敏度的测定。
专利文献1日本专利特开平5-192193号公报专利文献2日本专利特开2001-95598号公报专利文献3日本专利特开平3-206896号公报发明的揭示本发明提供了控制蛋白质分解酶的分解作用，以良好的精度测定糖蛋白、糖肽或者糖化氨基酸的方法，以及用于该测定方法的测定试剂。
本发明人对涉及的情况进行反复地认真研究，结果发现，在糖蛋白的酶测定法中，通过将糖肽特异酶或者糖化氨基酸特异酶作用前的反应液调整为pH1～5，控制蛋白质分解酶的分解作用，可以良好的精度测定糖蛋白等，藉此完成了本发明。
即，本发明提供了糖蛋白、糖肽或糖化氨基酸的测定方法，它是用蛋白质分解酶处理含有糖蛋白的试样，再使与游离的糖肽或糖化氨基酸相对应的氧化酶作用，然后用过氧化物酶及被氧化性显色试剂测定所生成的过氧化氢的方法，其特征在于，将该氧化酶作用前的反应液调整至pH1～5。
本发明还提供了至少包含(1)作用于糖肽或者糖化氨基酸生成过氧化氢的氧化酶、(2)用于将反应液调整至pH1～5的溶液以及(3)过氧化物酶的糖蛋白、糖肽或糖化氨基酸测定用试剂。
通过本发明，可控制蛋白质分解酶的分解作用，以良好的精度测定糖蛋白、糖肽或糖化氨基酸。由于本发明的测定方法简便，因此在临床检查领域极其有用。
附图的简单说明
图1显示在酸性试剂中添加了Triton X-100时的血红蛋白浓度测定结果(
图2显示在酸性试剂中添加了艾玛璐20C(エマ一ル20C)时的血红蛋白浓度测定结果(实施例3)的示图。
图3未在酸性试剂中添加表面活性剂时的血红蛋白浓度测定结果(比较例3)的示图。
图4显示本发明所得HbA1c值与由“拉匹地阿HbA1c”(“Rapidia HbA1c”)所得HbA1c值的相关性(实施例4)的示图。
图5显示本发明所得HbA1c值与由“拉匹地阿HbA1c”所得HbA1c值的相关性(实施例4)的示图。
图6显示本发明所得HbA1c值与由“拉匹地阿HbA1c”所得HbA1c值的相关性(实施例5)的示图。
图7显示本发明所得HbA1c值与由“拉匹地阿HbA1c”所得HbA1c值的相关性(实施例6)的示图。
实施发明的最佳方式本发明中的糖蛋白只要如前述是蛋白质与葡萄糖等醛糖非酶结合而生成的糖蛋白即可，没有特别的限定。例如作为来自机体的糖蛋白，有糖化白蛋白、糖化血红蛋白等，本发明适用于例如血红蛋白A1c(HbA1c)的测定。
作为含有糖蛋白的试样，可例举如全血、血细胞、血清、血浆、髓液、汗、尿、泪液、唾液、皮肤、粘膜、毛发等生物试样。另外，在果汁、调味品等食品中一般也含有糖蛋白。这些试样中较好为全血、血细胞、血清、血浆。这些试样可以直接也可经过滤或透析处理之后用于测定，另外也可适当地浓缩、萃取待测定的糖蛋白，甚至用水或缓冲液稀释该待测定的糖蛋白。
本发明中，首先使蛋白质分解酶作用于含有糖蛋白的试样，使糖肽(例如，果糖基肽等)、糖化氨基酸(例如，果糖基氨基酸等)游离。生物试样或食品中还含有在使蛋白质分解酶作用前糖蛋白已经被分解而游离的肽或氨基酸上结合葡萄糖之后，经阿马多利重排生成的果糖基肽或果糖基氨基酸，它们也包含在游离的果糖基肽或者果糖基氨基酸中。
作为蛋白质分解酶，只要具有蛋白质分解活性、肽分解活性即可，没有特别限定，较好的是能够在短时间内使果糖基肽或者果糖基氨基酸从糖蛋白高效地游离的蛋白质分解酶。当糖蛋白为HbA1c时，较好为使果糖基缬氨酰基肽或者果糖基缬氨酰组氨酸游离的蛋白分解酶，特好为使果糖基缬氨酰组氨酸游离的蛋白分解酶。
作为使果糖基肽或者果糖基氨基酸游离的蛋白质分解酶，可例举如来自杆菌属、曲霉属或者链霉菌属的微生物的蛋白质分解酶、来自动物的蛋白质分解酶、来自植物的蛋白分解酶等。另外，也可使用属于金属蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶的蛋白分解酶、将上述微生物的基因重组获得的蛋白分解酶。另外，有无化学修饰均可。
作为这样的蛋白质分解酶，可例举如蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜酶、链霉蛋白酶等用于研究的作为市售品容易得到的蛋白分解酶；ニユ一トラル蛋白酶、トヨチ一ムNEP(以上为东洋纺公司制)、スミチ一ムLP、スミチ一ムFP、スミチ一ムMP(以上为新日本化学工业公司制)、サモア一ゼP、プロチンA、プロチンP(以上为大和化成公司制)、アクチナ一ゼAS、アクチナ一ゼPF、アクチナ一ゼE(科研制药公司制)、ウマミザイム、蛋白酶S“アマノ”G、蛋白酶A“アマノ”G、蛋白酶P“アマノ”3G(以上为アマノエンザイム公司制)等工业用的市售品。上述蛋白质分解酶可以单独使用，也可将2种以上组合使用。
由于单独使用即可高效使果糖基缬氨酰组氨酸游离，因此上述蛋白质分解酶中特好为来自链霉菌属·灰霉(Streptomyces griseus)的蛋白质分解酶。作为来自链霉菌属·灰霉的蛋白质分解酶，具体可例举如アクチナ一ゼAS、アクチナ一ゼAF、アクチナ一ゼE(均为科研制药公司制)、链霉蛋白酶E(カルビオケム-ノバイオケム公司制、sigma公司制)等。另外，来自杆菌属的蛋白质分解酶较好为プロチンPC10F(大和化成公司制)、トヨチ一ム(东洋纺公司制)等。
上述蛋白质分解酶的最适pH较好为5.5～10，即，较好为pH1～5下的分解活性比pH5.5～10下的分解活性低的蛋白质分解酶。蛋白质分解酶的活性可通过以下方法来确认，即，将酪蛋白作为底物的方法，或者使蛋白质分解酶与糖肽等作用，再用毛细管-电泳法比较前后试样来确认。
试样的处理条件只要是所用的蛋白质分解酶与成为测定对象的糖蛋白作用，可在短时间高效率地游离糖肽或糖化氨基酸的条件即可。可根据试样中的糖蛋白的量或处理条件等，适当地选择所用的蛋白质分解酶的浓度，作为一个示例，可添加来自链霉菌属·灰霉的蛋白质分解酶(例如，アクチナ一ゼE、科研制药公司制)0.0001～500mg/mL，较好为0.001～300mg/mL。
对用蛋白质分解酶处理时的pH没有特别限定，可用适当的pH调整剂调整至所用的酶的最适pH，如用缓冲液调整至pH5.5～10。对缓冲液没有特别限定，可例举如磷酸、苯二甲酸、枸橼酸、Tris、马来酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、醋酸、硼酸、Good’s的缓冲液等。对缓冲液的浓度也没有特别的限定，较好为0.00001～2mol/L，特好为0.001～1mol/L。处理温度较好为10～40℃。所得的处理液可以直接使用或根据需要进行适宜的加热、离心分离、浓缩、稀释等。
本发明的测定方法中，将使糖肽特异酶或者糖化氨基酸特异酶(作用于糖肽或者糖化氨基酸而生成过氧化氢的氧化酶，以下，称为“生成过氧化氢的氧化酶”)作用之前的反应液调整至pH1～5。特好为pH1～4。通过调整至pH1～5，可以控制蛋白质分解酶对生成过氧化氢的氧化酶的分解作用。本说明书中，“生成过氧化氢的氧化酶作用前的反应液”虽是指用蛋白分解酶处理试样而得的反应液，但也可以是包含用蛋白质分解酶处理前的试样溶液和处理后的反应液的反应液。因此，后者的情况下，将蛋白质分解酶处理前的试样溶液调整至pH1～5之后，在处理中、处理后也要维持该pH。从处理前开始将试样溶液的pH调整至1～5的情况时，也可以增加蛋白质分解酶的使用量或处理时间。
作为pH的调整剂，只要是可调至酸性pH条件的调整剂即可，没有特别限定，可使用盐酸、醋酸、硫酸、磷酸等无机酸；甘氨酸、苯二甲酸、马来酸、枸橼酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、醋酸、乳酸等有机酸。对无机酸或者有机酸的浓度没有特别的限定。只要是能够将生成过氧化氢的氧化酶作用前的反应液调至pH1～5，或者在生成过氧化氢的氧化酶的反应时能够将pH调整为4～9的浓度即可，较好为0.0001～1000mM。
生成过氧化氢的氧化酶作用前的反应液中，可添加具有聚氧乙烯结构的非离子表面活性剂或者阴离子表面活性剂。通过向含有糖蛋白的试样或者经蛋白质分解酶处理后的反应液中添加这些表面活性剂，不仅可以作为从红细胞中提取血红蛋白供于反应的前处理，还可以抑制试剂或者试样发生混浊。
作为非离子表面活性剂，可例举如聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯烷基苯基醚类、聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物类、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯多环型表面活性剂等，较好为聚氧乙烯烷基苯基醚类。作为阴离子表面活性剂，可例举如聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸盐类、聚氧乙烯烷基醚磷酸类、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸类、聚氧乙烯烷基醚羧酸盐类、聚氧乙烯烷基醚磺酸盐类等，较好的是聚氧乙烯烷基醚磷酸类、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类或者烷基磺基琥珀酸类、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类，特好为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类。
表面活性剂的使用量较好的是在生成过氧化氢的氧化酶作用前的反应液中为0.0001～10％，特好为0.001～10％。
可向pH已调整到1～5的反应液再添加使过氧化氢和过氧化物酶共同作用而生成色素的被氧化性显色试剂。在pH1～5的溶液中，该被氧化性显色试剂的稳定性高，可抑制经时呈现的非特异的显色。作为被氧化性显色试剂，只要是与过氧化氢反应而显色的试剂即可。可例举如4-氨基安替比林、3-甲基-2-苯并噻唑腙等偶联剂与苯胺系化合物的组合、无色色素等，其中较好为无色色素。
作为无色色素没有特别限定，可使用三苯甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯胺衍生物等。作为三苯甲烷衍生物，可使用在日本专利特开平3-206896号公报、日本专利特开平6-197795号公报等中记载的水溶性高的化合物，作为吩噻嗪衍生物，可使用在日本专利特公昭60-33479号公报中记载的化合物，作为二苯胺衍生物，可使用在日本专利特公昭60-33479号公报、日本专利特开昭62-93261号公报等中记载的化合物。其中，较好为无色孔雀石绿、无色龙胆紫、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)-二苯胺钠盐(DA-64；和光纯药工业公司制)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67和光纯药工业公司制)、10-(N-甲基氨基甲酰)-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP同仁化学公司制)、N，N，N’，N’，N”，N”-六-(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷(TPM-PS同仁化学公司制)等，更好为TPM-PS、DA-64、DA-67或者MCDP，特好为TPM-PS或者MCDP。无色色素通常在溶液中的保存稳定性低，但在pH1～5的溶液中长期稳定。
另外，还可使用二氨基联苯胺、羟基苯基丙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺等。
经蛋白质分解酶处理而游离的糖肽或者糖化氨基酸可通过使生成过氧化氢的氧化酶与它们进行反应，再测定生成的过氧化氢来测定。
作为上述生成过氧化氢的氧化酶，只要是可将果糖基肽等糖肽或者果糖基氨基酸等糖化氨基酸代谢的氧化酶即可，没有特别限定，可以是来自微生物的氧化酶、来自动物的氧化酶、来自植物的氧化酶等的任一种，另外也可以是通过将该微生物的基因重组而产生的氧化酶，有无化学修饰均可。具体可例举果糖基氨基酸氧化酶(日本专利特开2003-79386号公报及国际公开第97/20039号小册子)、酮胺氧化酶(日本专利特开平5-192193号公报)、果糖基肽氧化酶(日本专利特开2001-95598号公报及日本专利特开2003-235585号公报)等，特好为果糖基肽氧化酶。作为果糖基肽氧化酶，可例举将棒状杆菌属菌产生的果糖基氨基酸氧化酶改性后的酶(日本专利特开2001-95598号公报)、来自丝状菌的果糖基肽氧化酶(日本专利特开2003-235585号公报)等。特好为FPOX-CE或者FPOX-EE(均是キツコ一マン公司制)。这些生成过氧化氢的氧化酶可以是溶液状态也可以是干燥状态，也可以在不溶性载体上负载或结合，可以单独使用也可以将2种以上组合使用。
生成过氧化氢的氧化酶的使用量，因酶的种类不同而不同，较好为0.001～1000单位/mL，特好为0.1～500单位/mL。考虑到所用酶的最适pH，将使其发挥作用时的pH用缓冲液调整至4～9。作用温度为通常的酶反应中使用的温度，较好为10～40℃。作为缓冲液，可使用上述记载的缓冲液。对缓冲液的浓度也没有特别的限制，较好为0.00001～2mol/L，特好为0.001～1mol/L。
上述氧化酶可根据需要与其它酶、辅酶等组合使用。作为其它酶，可例举如硫辛酸脱氢酶或者不以果糖基缬氨酸为底物的氨基酸代谢酶等，还可使用抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等用于处理血液中的夹杂成分的酶。作为辅酶，可例举如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、硫代NAD、硫代NADP等。
过氧化物酶较好以0.01～100单位/mL的浓度使用来自西洋辣根、微生物等的过氧化物酶。
过氧化氢可通过使用过氧化物酶和被氧化性显色试剂的酶方法在短时间内简便测定。过氧化氢的测定通常是在使生成过氧化氢的氧化酶作用而产生过氧化氢的工序之后连续进行，过氧化氢的测定溶液较好用上述的缓冲液调至pH4～9。显色的程度(吸光度变化量)通过分光光度计测定，与作为标准的浓度已知的糖肽、糖化氨基酸等的吸光度比较，可测定试样中的糖蛋白、糖肽或者糖化氨基酸。测定时可使用通常的自动分析装置。
本发明的糖蛋白测定用试剂至少含有(1)与糖肽或者糖化氨基酸作用产生过氧化氢的氧化酶、(2)用于将反应液调至pH1～5的溶液以及(3)过氧化物酶。各种成分的具体内容如上所述。在此，上述(2)的“将反应液调至pH1～5的溶液”是指经上述的pH调整剂的调整后的溶液，另外，“反应液”是指试样用蛋白质分解酶处理所得的反应液，但也可以是包含用蛋白质分解酶处理之前的试样溶液和处理后的反应液的反应液。
本发明的糖蛋白测定用试剂中还可含有蛋白质分解酶。除此之外，还可添加处理血液中的夹杂成分的酶；反应调整剂；稳定剂；白蛋白等蛋白质类；氯化钠、氯化钾、亚铁氰化钾等盐；赖氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸，肽，聚氨基酸类；用于避免还原性物质的影响的四唑盐；抗生物质、叠氮化钠、硼酸等防腐剂；阳离子性表面活性剂等。
本发明的糖蛋白测定用试剂不仅可以溶液状态还可以干燥状态或者凝胶状态提供。另外，除了填充在玻璃瓶、塑料容器等中之外，还可以涂布、浸渍于不溶性载体的形态等来提供。以溶液状态长期保存时，通常最好对保存容器进行遮光处理。
实施例以下，例举实施例更详细地说明本发明，但是本发明不限于此。
蛋白质分解酶的控制效果(1)试样的制备在蒸馏水中溶解蛋白质分解酶(アクチナ一ゼE、科研制药公司制)，使浓度分别为0、1、5、10mg/mL，作为试样。
(2)测定<第一试剂>
3μM果糖基缬氨酸20μM TPM-PS(N，N，N’，N’，N”，N”-六-(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷、同仁化学公司制)10mM 马来酸液(pH3)<第二试剂>
4单位/mL 果糖基肽酸化酶(FPOX-CE、キツコ一マン公司制)20单位/mL POD(东洋纺公司制)200mM 枸橼酸缓冲液(pH6)向各试样20μL中加入第一试剂240μL，在37℃加热5分钟之后，再添加第二试剂80μL，在37℃加热5分钟后，使用日立7150型自动分析装置，测定波长600nm下的吸光度。以试样中蛋白质分解酶浓度为0mg/mL的测定值作为100，求出吸光度的变化量的相对值。结果示于表1。
除了使用0.1N氢氧化钠溶液将第一试剂中的马来酸液调至pH7之外，与实施例1同样操作，测定吸光度。
表1
由表1可确认，在pH1～5中进行第一反应时，可以抑制由蛋白质分解酶造成的FPOX-CE和POD的分解。
糖化血红蛋白的测定
<溶血试剂>
2％艾玛璐20C(花王公司制)1mg/mL アクチナ一ゼE(科研制药公司制)20mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸)缓冲液(pH8)。
*艾玛璐 20C聚氧乙烯(3)月桂基醚硫酸钠<酸性试剂>
0.1％ Triton X-10020μM TPM-PS(同仁化学公司制)0.05％ 叠氮化钠5mM 马来酸液(pH2.8)<酶试剂>
20单位/mL POD(东洋纺公司制)4单位/mL FPOX-CE(キツコ一マン公司制)200mM 枸橼酸缓冲液(pH6)(1)溶血试样的制备将使用市售试剂盒“拉匹地阿HbA1c”(富士レビオ公司制)已知HbA1c浓度的人血细胞作为试样使用，向试样10μL中添加溶血试剂300μL，作为溶血试样。
(2)测定向溶血试样20μL中添加酸性试剂240μL，在37℃加热5分钟之后，测定波长600nm的吸光度，再向该反应液中添加酶试剂80μL，在37℃反应5分钟，测定波长600nm的吸光度变化量。结果示于表2。
除了使用下述的中性试剂代替酸性试剂之外，与实施例2同样操作。
<中性试剂>
0.1％ Triton X-10020μM TPM-PS(同仁化学公司制)0.05％ 叠氮化钠5mM 马来酸液(pH7)
表2
由表2可知，实施例2的测定值较比较例2高，与已知浓度的相关系数也较比较例2大，说明蛋白质分解酶对试剂中的其它酶的影响减弱。
血红蛋白浓度的测定(1)试样的制备向10μL的人血细胞溶液中加入200μL的1％艾玛璐20C，混合使之发生溶血，再将其用1％艾玛璐20C液进行5段稀释，作为试样。
(2)测定向试样20μL中加入由50mM枸橼酸缓冲液形成的试剂240μL，在37℃加热5分钟之后，测定波长600nm的吸光度。另外，作为枸橼酸缓冲液，先分别制备pH为3、4和5的缓冲液，再向其中添加作为表面活性剂的0.5％ Triton X-100或者1％艾玛璐20C。结果示于图1、2。
除了表面活性剂之外，与实施例3同样操作。结果示于图3。
由图1～3可知，向枸橼酸缓冲液中添加有表面活性剂的情况下，确认了依赖于血红蛋白浓度的吸光度变化。另-方面，不添加表面活性剂的情况下，由于人血细胞溶血试样和酸性试剂的混合产生混浊，因此没有得到与分段稀释对应的吸光度。
HbA1c浓度的测定<溶血试剂1>
2％ 艾玛璐 20C(花王公司制)1mg/mL アクチナ一ゼE(科研制药公司制)20mM HEPES缓冲液(pH8)
<溶血试剂2>
2％ 艾玛璐 20C(花王公司制)1mg/mL アクチナ一ゼE(科研制药公司制)260μM TPM-PS(同仁化学公司制)20mM HEPES(pH8)<酸性试剂1>
0.1％ Triton X-10020μM TPM-PS(同仁化学公司制)5mM 马来酸液(pH3)<酸性试剂2>
0.1％ Triton X-1005mM 马来酸液(pH3)<酶试剂>
20单位/mL POD(东洋纺公司制)3单位/mL FPOX-CE(キツコ一マン公司制)200mM 枸橼酸缓冲液(pH6)(1)溶血试样的制备使用10例人血细胞试样，向各血球试样10μL中添加溶血试剂1或溶血试剂2300μL，分别制备溶血试样。另外，下面的测定中，(A)在溶血试样的制备中用溶血试剂1的情况下使用酸性试剂1进行实施，(B)在溶血试样的制备中用溶血试剂2的情况下使用酸性试剂2进行实施。
(2)测定向溶血试样20μL中添加酸性试剂240μL，在37℃加热5分钟之后，测定波长600nm的吸光度，求得依赖于血红蛋白浓度的测定值(samp Hb)。再向该反应液中添加酶试剂80μL，使之在37℃反应5分钟。测定波长600nmd的吸光度变化量，求得依赖于HbA1c浓度的测定值(samp A1)，由上述值和使用已知HbA1c浓度(％)的试样同样操作时的依赖于血红蛋白浓度的测定值(std Hb)以及依赖于HbA1c浓度的测定值(std A1)，通过下式计算出HbA1c值(％)。
HbA1c(％)＝std HbA1×(std Hb/std A1)×(samp A1/samp Hb)(std HbA1；已知HbA1c浓度的试样的HbA1c(％)值)与由基于免疫学测定方法的市售试剂盒“拉匹地阿HbA1c”(富士レビオ公司制)测得的HbA1c值(％)(参照例)之间的相关性示于图4、图5。
由图4、图5可知，本发明法显示了与拉匹地阿HbA1c的良好相关性。
HbA1c浓度的测定<溶血试剂>
2％ 艾玛璐 20C(花王公司制)1mg/mL アクチナ一ゼE(科研制药公司制)20mM HEPES(pH8)<酸性试剂>
0.1％ Triton X-10020μM MCDP(10-(N-甲基氨基甲酰)-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(同仁化学公司制)10mM 马来酸液(pH3)<酶试剂>
20单位/mL POD(东洋纺公司制)4单位/mL FPOX-CE(キツコ一マン公司制)200mM 枸橼酸缓冲液(pH6)(1)溶血试样的制备向人血细胞试样10μL中添加溶血试剂300μL制备溶血试样。
(2)测定向溶血试样10μL中添加酸性试剂240μL，在37℃中加热5分钟之后，测定波长600nm的吸光度，求得依赖于血红蛋白浓度的测定值。再向该反应液中添加酶试剂80μL，于37℃使其反应5分钟，测定波长600nm的吸光度变化量，求得依赖于HbA1c浓度的测定值，与实施例4同样算出HbA1c值(％)。与通过“拉匹地阿HbA1c”(富士レビオ公司制)测定的HbA1c值(％)之间的相关性示于图6。
由图6可知，本发明法显示了与拉匹地阿HbA1c的良好相关性。
HbA1c浓度的测定<溶血试剂>
2％ 艾玛璐20C(花王公司制)10mg/mL プロチンPC10F(大和化成公司制)20mM HEPES(pH8)<酸性试剂>
0.1％ Triton X-10020μM TPM-PS(同仁化学公司制)10mM 马来酸液(pH3)<酶试剂>
20单位/mL POD(东洋纺公司制)3单位/mL FPOX-CE(キツコ一マン公司制)200mM 枸橼酸缓冲液(pH6)(1)溶血试样的制备向人血细胞试样10μL中添加溶血试剂300μL制备溶血试样。
(2)测定向溶血试样10μL中添加酸性试剂240μL，在37℃加热5分钟之后，测定波长600nm的吸光度，求得依赖于血红蛋白浓度的测定值。再向该反应液中添加酶试剂80μL，使之在37℃反应5分钟，测定波长600nm的吸光度变化量，求得依赖于HbA1c浓度的测定值，与实施例4同样计算出HbA1c值(％)。与通过“拉匹地阿HbA1c”(富士レビオ公司制)测得的HbA1c值(％)(参照例)之间的相关性示于图7。
由图7可知，本发明法显示了与拉匹地阿HbA1c的良好相关性。
TPM-PS的稳定化-1在下述的各水溶液中溶解TPM-PS，使其浓度为60μM，之后在37℃保存，测定波长600nm下的吸光度。表3中显示了0时间后、2周后、3周后的吸光度。
表3
*PB-K磷酸钾溶液由表3可知，TPM-PS在pH1～5的水溶液中可抑制非特异显色，是稳定的。
实施例8TPM-PS的稳定性-2在下述的各水溶液中溶解TPM-PS，使其浓度为100μM，之后在25℃保存10天，测定波长600nm下的吸光度。结果示于表4。
表4
由表4可知，TPM-PS在pH1～5的水溶液中吸光度的变化量小，是稳定的。
实施例9MCDP的稳定性在甲醇中溶解MCDP至4mM后，溶解于含有0.1％ Triton X-100的下述各水溶液中，使浓度达到100μM。在37℃保存24小时，测定波长600nm下的吸光度。结果示于表5。
表5
由表5可知，MCDP在pH1～5的水溶液中吸光度的变化量小，可抑制非特异显色，是稳定的。
权利要求
1.糖蛋白、糖肽或糖化氨基酸的测定方法，它是用蛋白质分解酶处理含有糖蛋白的试样，使与游离的糖肽或者糖化氨基酸对应的氧化酶作用，使用过氧化物酶及被氧化性显色试剂测定生成的过氧化氢的方法，其特征在于，将该氧化酶作用前的反应液调至pH1～5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，糖蛋白是糖化血红蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，蛋白质分解酶来自杆菌属、曲霉属或链霉菌属，或者通过将该微生物的基因重组而获得，其最适pH为5.5～10，单独使用或并用使果糖基缬氨酰组氨酸游离。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，蛋白质分解酶通过来自链霉菌属·灰霉的微生物获得，其最适pH为5.5～10，单独使用使果糖基缬氨酰组氨酸游离。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，氧化酶作用前的反应液含有具备聚氧乙烯结构的阴离子性表面活性剂或者非离子表面活性剂。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，调整至pH1～5的反应液含有被氧化性显色试剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，被氧化性显色试剂为选自三苯甲烷系、吩噻嗪系及二苯胺系的无色色素。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，三苯甲烷系无色色素为N，N，N’，N’，N”，N”-六-(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，吩噻嗪系无色色素为10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪或者10-(N-甲基氨基甲酰)-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征在于，使用选自盐酸、硫酸、磷酸及有机酸的1种以上进行pH调整。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，有机酸为甘氨酸、马来酸或者枸橼酸。
12.糖蛋白、糖肽或者糖化氨基酸测定用试剂，其特征在于，至少包含(1)作用于糖肽或者糖化氨基酸而生成过氧化氢的氧化酶、(2)用于将反应液调整至pH1～5的溶液以及(3)过氧化物酶。
全文摘要
本发明提供了控制蛋白质分解酶的分解作用，以良好的精度测定糖蛋白、糖肽或糖化氨基酸的方法以及用于该测定方法的测定试剂。该方法是用蛋白质分解酶处理含有糖蛋白的试样，使与游离的糖肽或者糖化氨基酸对应的氧化酶作用，用过氧化物酶及被氧化性显色试剂测定生成的过氧化氢的方法，其特征在于，将该氧化酶作用前的反应液调整至pH1～5。
文档编号C12Q1/26GK1957090SQ20058000864
公开日2007年5月2日 申请日期2005年3月16日 优先权日2004年3月17日
发明者谷口由利子, 西尾朋久, 齋藤和典 申请人:第一化学药品株式会社