专利名称：水稻茎秆机械强度控制基因bc10及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及水稻茎秆机械强度控制基因BC10，该基因编码的蛋白质及其功能类似物，编码其的核苷酸序列，含有该核苷酸的载体和含有该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及控制植物茎秆机械强度的方法和改良植物细胞壁成分、含量和结构育种的方法。
背景技术：
植株茎秆的机械强度是植物、尤其是农作物重要的农艺性状。而茎秆的机械强度又与茎秆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接有关，是组成植物细胞壁各种多聚物物理特性的综合体现。植物细胞壁是一种复杂的纤维网络结构，由不同的结构多糖、芳香族物质和蛋白质高度有序地组成[1]，其结构对保持细胞形态，维持植株直立生长的机械支撑力具有重要作用。植物细胞壁的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及纤维素、木质素和一些非纤维素成分的合成途径。因此，细胞壁中纤维素、木质素等主要成分的合成与分布以及沉积是影响植株茎秆支撑力的主要影响因素。对不同细胞壁突变体的研究是揭示与茎秆机械强度有关的细胞壁生物合成生理生化以及分子生物学机理的有效途径。植物茎秆机械强度首先与纤维素的合成与沉积密切相关。1996年Pear等人对EST随机测序，首先从棉花中克隆了植物纤维素合酶催化亚基CesA[2]。而纤维素合酶在植物体中行使功能最直接的证据则来自于对拟南芥突变体rsw的研究[3]，该突变体侧根发育异常，且纤维素含量大幅降低，从中以图位克隆的方法分离到拟南芥中第一个纤维素合酶 催化亚基基因AtCesAl。生物信息学分析表明，CesA基因是一个庞大的基因家族，它的各成员之间具有极高的保守性M。近年来的研究发现，任何一个目前已克隆的CesA基因发生突变后，都会引起比较严重的表型，这暗示着植物基因组中存在着诸多CesA基因在功能上 并不冗余，它们可能分别在不同的发育时期和部位起作用，也可能共同参与了同一个复合体的形成，协同作用完成纤维素的合成、晶体化和沉积[5]，但分子机理还很不清楚。关于纤维素的沉积，尽管目前已发现一些蛋白在纤维素的沉积中起着至关重要的作用，例如拟南芥脆性纤维基因FRAl(Fragile feber 1)编码的一个kenesin-like蛋白[6] ；FRA2编码的Katanin-Iike蛋白m以及COBRA蛋白[8]。但作为细胞壁最主要的组份，纤维素是高度有序并与细胞壁的其他组份有机连接在一起的，目前人们所了解的只是“冰山的一角”。此外，还有大量的糖基转移酶(GT)参与了非纤维素多糖和蛋白多糖的合成与修饰。以拟南芥为例， 预测具有415个GT[9]，但只有极少数被证明具有生化活性和功能[1°_12]。植物茎秆机械强度也与细胞次生壁的木质化有关。在拟南芥的研究中，发现一些木质化异常的突变体。如Jones在2001年[13]对一不正常木质部突变体irx4研究证实，木质素代谢途径中的一个关键酶即肉桂酰辅酶A还原酶(Cirmamoyl-CoA reductase, CCR)。 由於CCR基因的突变，导致木质素合成途径提前终止，细胞壁中木质素含量较正常植株减 少了 50%，从而导致茎秆支撑力度的下降。因此，植物茎秆机械强度是一个多基因控制的复杂形状，其机制仍十分不详，了解水稻控制茎秆机械强度的分子机制，对水稻的产量和秸秆的合理利用将产生深远影响。随着基因组测序工作的开展，人们获得了大量的核苷酸信息。因此在真核生物中 有一大类功能未知的结构域被人为归类排序，等待人们的研究结果加以注释。BClO含有一 个功能未知结构域DUF266，BClO功能的揭示为具该结构域的其他基因的注解提供了线索。
发明内容
针对上述研究背景，本发明的一个目的是提供一种控制水稻茎秆机械强度的基 因，所述基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎 秆机械强度功能的核苷酸序列。严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2， 7% SDS)中，65°C预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7.2,7% SDS,同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液 I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2,0. 1 % SDS)，65°C洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液 II(10mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH7. 2，0. 1% SDS)，65°C洗膜 10-15 分钟。本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因优选具有如图4和SEQ IDNO :1所示的DNA 序列。本发明的另一个目的是提供一种由本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因所编 码的蛋白质，所述蛋白质优选地具有如图5和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明中 的SEQ ID NO :2和图5所示的蛋白质含有DUF266结构域。含DUF266结构域的蛋白为植物 特有的蛋白，也是第一个功能被揭示的这类蛋白。本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的控制水稻茎秆机械强度的基因的 植物表达载体。在一个实施方案中，所述表达载体是如图3所示的pBClOF，该载体可以表达 由上述核酸序列编码的多肽。本发明的又一个目的是提供一种培育植物的方法，该方法可使植物茎秆机械组织 细胞壁的结构和成分发生改变，从而引起茎秆机械强度发生变化，所述方法包括下列步骤 用本发明的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。关于序列表的说明SEQ ID NO :1是BClO基因的CDS (氨基酸编码区DNA序列)；SEQ ID NO :2是BClO基因编码的氨基酸序列。
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。图1.水稻脆秆突变体bclO的表型图2. BClO基因的图位克隆图3.pBC10F载体图谱图4. BClO基因的⑶S (氨基酸编码区DNA序列)序列图5. BClO基因编码的氨基酸序列
图6. BClO表达载体图谱图7. BClO融合蛋白的体外表达图8. BClO融合蛋白的酶活分析
具体实施例方式实施例1 1.水稻材料水稻(Oryzasativa ssp.)突变体 brittle culmlO (bclO)，是原始野生型材料粳 稻品种“黄金晴”的自发突变体材料(购自中国水稻所)。2.分析和定位群体 纯合的bclO突变体和水稻品种ZF802 (购自中国水稻所)进行杂交，F1代自交，共 得到870株F2个体，并以此作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。3.通过简单重复序列(SSR，Simple Sequence R印eat)，序列标记位点(STS， Sequence-tagged Sites)，和酶切扩增多态性序列(CAPS，Cleavedamplified polymorphic sequence)标记定位BClO基因。采用改进的CTAB方法[14]从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约 IOOmg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1. 5ml离心管里提取 DNA,获得的DNA沉淀溶解于100 μ 1超纯水中。每一个SSR、STS或CAPS反应用1 μ 1 DNA样品。4. BClO基因的初步定位在该阶段，对由150个F2个体组成的小群体进行SSR和STS分析。我们发现BClO 基因与两个标记连锁并位于二者之间。在此基础上，我们设计的PCR引物分别以两个亲本 (即bclO突变体和水稻品种ZF802)的基因组DNA为模板进行PCR扩增(94°C预变性5min， 94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，35cycles，72°C延伸 IOmins)，将 BClO 基因初步定位在 SSR标记RM7349和E3528之间(序列见表1)。表1克隆BClO基因所用引物序列
Markers TypeForword PrimerReverse PrimerEnzyme
RM7349 SSR!'-Τ ΧΤΤΤΤΟΤ ΧΤ ΧσΓΠΧΧ 5'-AGAGACGATCACTGCGCC-3'
E3528STS5'-GGGAAGAAGAGTAGAGGCTG-3'5'-TACACCCCAATATACCTTCG-3'
M1SSR5'-AAGCAAACAAGTGATACTACATAC-3'S'-GCTAGATGACCACCTGCTG^'
M2STS5，-TGCCATTACTGCTGCACG-3，S1-ACGGAGGAGATGCCAGATG-Sf
M3STS5'-ATGAGGTCGTCGGTGAGC-3'5'-GTCTGCCACGCCTTCTTG-3’
M4SSR5'-AACCTCTCCTACCTATTTAGACACC-3'5'-CTAACCTCTAACTAATCAATGAAGTCC-3
M5CAPS5，-CCAAACTTGCTTGCTTCACAC-3，5’-CACAGGCACTATTCCAAGCATAC-3’EarI为了将BClO定位在一个PAC克隆上，我们用已公布的水稻品种Nipponbare的PAC 文库(http://rgp. dna. affrc. go. jp)序列构建了 BClO位点附近的重叠群，设计的PCR引 物分别以两个亲本(籼稻品种明恢63和dul突变体)的基因组DNA为模板进行PCR扩增 (94°C预变性5分钟，94。C 1分钟，55。C 1分钟，72 dC 1分钟，35次循环，72°C延伸10分钟)。 以此发展了 STS和SSR标记(序列见表1)，并用于群体精细定位，最终将其定位在一个PAC克隆 AC084817 和 AC087553 上。 5. BClO基因的精细定位根据公布的PAC 克隆 AC084817 和 AC087553 的序列(http //rgp. dna. affrc. go. jp)，设计2个新标记M4和M5 (序列见表1)，最后通过连锁分析将BClO定位在51kb的 范围之内。6. BClO基因的克隆和全长cDNA的获得首先对51kb的全长基因组序列用GENSCAN软件(http://genes.mit. edu/ GENSCAN. html)预测可能的编码区(ORF)，发现这个区间共有10个0RF。逐个测序比较突 变体和野生型之间的区别，发现其中一个ORF具有17个碱基的缺失；缺失发生在该基因的 第二个内含子和第三个外显子交界处，从而造成第二个内含子不能被剪切掉，用DNAStar 软件(Lasergene)SeqEdit分析，该突变会引起基因的移码和翻译的提前终止。而该范围内 的其他基因测序后并没有发现任何变化，这样我们初步确定该基因就是BClO基因。将候 诛区域的基因组序列和KOME(http://cdna01. dna. affrc. go. jp/cDNA)中的cDNA数据进 行Blastn分析，结果在水稻全长cDNA文库中发现该基因的全长cDNA，该基因全长表达序 列具有1200bp (图4)，共399个氨基酸(图5)。将氨基酸序列送到GenBank数据库中进行 BlastP分析，发现除了在N端第20到42位氨基酸为一次跨膜区外，C端还含有唯一的一个 结构域，但其功能却从未有人证实过，被称为DUF266结构域。BlastX搜索同源序列，发现凡 具有该结构域的基因均来自于植物，说明它为植物所特有的功能域，可能与细胞壁的生物 合成有关。实施例2水稻茎秆机械强度控制基因BClO的功能互补及转基因研究含该基因的BAC克隆(购自上海生命所)用Sal I酶切释放出BClO的全部基因 组片段，共8696bp，包含起始密码子ATG上游的1980个碱基和终止密码子TAA后的2337个 碱基的全长序列，将该基因组片段插入到双元载体PCAMBIA1300 (购自CAMIA公司，澳大利 亚)中的Sal I位点间，从而获得了用于转化的质粒pBClOF(图3)。质粒通过电击的方法 转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105 (购自CAMIA公司，澳大利亚)中 转化水稻，其过程如下1.水稻幼胚培养.将bclO突变体的幼胚脱壳，70%乙醇表面消毒3min后，用 0. 1 %氯化汞5分钟，10%次氯酸钠溶液浸泡20分钟，无菌水冲冼3-4次，点播于NB培养基 上诱导愈伤组织，20天左右从成熟胚盾片处长出的愈伤组织继代于NB培养基上，以后每2 周继代一次，每次继代时都挑选色泽淡黄较致密的胚性愈伤组织。2.农杆菌培养.一 70°C保存的农杆菌菌株接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L 利福平的YEP培养基上，26-28°C，150rpm暗培养16-18小时活化菌种，YEP固体培养基上划 平板，于26-28°C暗培养1天，挑取单菌落于YEP液体培养基中，26_28°C，150rpm悬浮培养 16小时，倒入250ml离心管中4000rpm离心收集农杆菌菌体，并用液体培养基悬浮菌体至 0. D600为0. 8-1. 0，用于各种水稻材料的转化。3.水稻材料与农杆菌的共培养.水稻愈伤在与农杆菌菌液感染前均需先在新鲜 的继代培养基上培养4天后，才可用于转化。转化时先将经预培养4天的愈伤组织转移到 IOOml无菌三角锥形瓶中，然后将适量农杆菌悬浮液倒入(保证有足够的菌液把材料淹没) 上述含有水稻材料的锥形瓶中，室温下放置20分钟，并不时晃动，然后将水稻材料取出，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的NB-AS固体培养基上，在26°C 条件下暗培养2-3天。共培养后，从固体共培养培养基上取出转化过的水稻材料，转入含有 50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选培养。4.抗性愈伤组织的筛选及植株再生。第一轮选择2周后，转到第二轮选择培养基 上继续筛选2周，然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基或直接转移到分 化培养基上分化(16小时光照/天)，再生的小苗在1/2MS上生根壮苗，随后移入温室。共 获得PBClOF质粒的转基因株系18个，均完全恢复了野生表型。这一结果证明该基因具有 调节水稻茎秆机械强度的作用。实施例3 =BClO蛋白的体外表达和功能验证1.BC10表达载体的构建利用带有XhoI和BamHI的限制性内切酶位点的引物从野生型的cDNA中扩增出 BClO基因。所用引物序列如下正向5'-ctcgagAGCTGCACAGATGC-3‘反向5,-ggatccTGCCACCAGGA GGAGGA-3，94 V预变性5分钟,940C 1分钟,60 °C 1分钟,72 °C 1分钟，35次循环,72 °C延伸 10分钟获得PCR产物，将PCR产物连接到T-easy载体(购自Promega)，然后通过电击法将 连接产物转化DHlOB感受态细胞，并用ABI3730DNAanalyzers型测序仪测序(ABI公司，美 国)，挑选序列完全正确的克隆。通过XholI和BamHI酶切插入到具相同酶切位点的载体 PEGFP-Nl (购自Clontech公司)中(图6)，测序验证其编码框的正确性。2. BClO-GFP融合蛋白的表达将构建好的质粒，利用质粒提取试剂盒(购自北京天庚生物科技有限公司)纯化好后，利用脂质体转染到中国仓鼠上皮细胞(CHO)(购自ATCCCCL-61)中进行表达。转染表 达时，由于含有BClO基因的pEGFP-m载体同时也具有同框的GFP基因，因此在荧光显微镜 下可观察到绿色荧光，证明BClO能在CHO细胞中表达。转染两天后，收集细胞，并在裂解液 (IOmMTrisCl，pH8. 0,0. ImM EDTA, 5mM DTT,0. 9% NaCl，和 Triton X-100)用枪头吹打 破碎，在冰上放置两小时后，2700rpm离心分别收集上清和沉淀，用Bio-Rad蛋白分析试剂 盒(购自Bio-Rad)定量后取10 μ g上清和沉淀分别进行Western Blot分析。结果显示， 当用GFP单克隆抗体(购自Roche)杂交时，BClO-GFP融合蛋白的信号主要在沉淀中(图 7)，说明它的确为一个膜蛋白。3. BClO-GFP融合蛋白的功能当我们将BClO蛋白序列送到GenBank中进行保守结构域空间构象比对 [conserved domain architecture retrieval tool (CDART)]时发现，DUF266 与动物 中的修饰蛋白糖基化的Core2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(C2GnT)具有一定的同源性， 因此我们将在CHO细胞中表达的BClO蛋白进行体外C2GnT的酶活分析，具体步骤如 下将CHO细胞裂解液沉淀部分的250 μ g粗蛋白与反应液[50mM HEPES-NaOH, pH7. 0 ； ImM UDP-[glucosamine-U-14C]-GlcNAc(3. 7kBq, _ 自 Amersham Pharmacia Biotech)； ImMGal β 1 — 3GalNAc α 1 — PNP (购自 Sigma) ；0. IM GlcNAc ；5mM DTT]共 50 μ 1 在 37°C 温浴2小时后，加入5ml去离子水终止反应；接着过C18S印-Pak柱(购自Waters公司)； 20ml去离子水充分洗涤柱床后，用4ml甲醇洗脱反应产物；将甲醇冷冻干燥，再溶于Iml甲醇并在液体闪烁检测仪(1450MicroBeta TriLux ；Perkin-Elmer)上记录放射性读数，计算 酶活。图8显示，与阴性对照比较，BC10的确具有一定的C2GnT活性，证明BC10为一种糖基 转移酶。参考文献1. Bacic, A. , et al. Edi :Priess, J. The biochemistry of plants. New York, Academic Press,14 297-3712.Pear, J. R.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996,93 :12637-126423. Arioli, T. , et al. Science. 279，717-720.4. Richmond, T. A.，et al. Plant Physiol. 2000，124 :495_498.5. Taylor, N. G.，et al. Plant Cell. 2000，12 :2529_2540.6. Zhong, R.，et al. Plant Cell. 2002，14 :3101_3117.7. Burk, D. H.，et al. Plant Cell. 2001，13 :807_827.8. Roudier, F.，et al. Plant Cell. 2005，17 :1749-1763.9. Scheible, ff. R.，et al. Curr Op in Plant Biol. 2004，7 :285_295.10. Sarria, R.，et al. Plant Physiol. 2001，127 1595-1606.11. Faik, A.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002,99 :7797_7802.12. Madson, M.，et al. Plant Cell. 2003，15 1662-1670.13. Jones, L, et al. Plant J. 2001，26 :205_21614. Li X，et al. Nature. 2003，422 (6932) :618_621SEQUENCE LISTING<110>中国科学院遗传所<120>水稻茎秆机械强度控制基因BC10及其应用<130>IB087285<160>2
<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1200<212>DNA<213>0ryza sativa<400>1atgaagccgc cgcggaggtg gatgtacggg cggggcggcg ggaaggggaa gccggcgggg 60ctgctgctgc tgggggtgtt cctctgcttg tcggtggtgc tgctgctgct gctgcacggc 120tcgtccccgt cgctggaggg cgaggggagg aagcctgagg cggtggaggc ggcgggggga 180
gggggagaggaggaggaggtggcggtggcgcgggcggaggtggaggaggc gccgctgccg240
ccggggaacgcgcggctcgccttcctcttcatcgcccgcaaccgcctccc gctcgacctc300
gtctgggacgccttcttccgcggtgacaaggaagggagattctccatctt cgtgcactcg360
cggccggggttcgtgctcacccgcgccaccacccgatccggcttcttcta caatcggcag420
gtcaacaacagcgtccaggtggattggggggaggcgagcatgatcgaggc tgagcgtgtt480
ctactcgcccacgcgctcaaggaccccttaaacgagcgcttcgtgttcgt ctccgacagc540
tgtgtgccattgtacaacttcaactacacttacgactacataatgtcttc gtcaaccagt600
tttgttgacagttttgctgatacaaaagcgggtcggtataatccaagaat ggacccaatt660
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<210>2
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0116]
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0130]
0131]
0132]
<400>2 Met Lys
1
Lys
Val
Gly
Glu
65
Pro
Pro
Arg
Pro
Leu
Arg
50
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Gly
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Phe
Pro Pro Ala
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Asp
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Gly 20 Leu
Pro
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Ala
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Leu
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Lys 110 Leu
Lys
15
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Arg
95
Glu
Gly
Val
Glu
Glu
Pro 80 Leu
Gly Thr Arg
115120125
AlaThrThrArgSerGlyPhePheTyrAsnArgGinValAsnAsnSer
130135140
ValGinValAspTrpGlyGluAlaSerMetlieGluAlaGluArgVal
145150155160
LeuLeuAlaHisAlaLeuLysAspProLeuAsnGluArgPheValPhe
165170175
ValSerAspSerCysValProLeuTyrAsnPheAsnTyrThrTyrAsp
180185190
TyrlieMetSerSerSerThrSerPheValAspSerPheAlaAspThr
195200205
LysAlaGlyArgTyrAsnProArgMetAspProlielieProValGlu
210215220
AsnTrpArgLysGlySerGinTrpAlaValLeuThrArgLysHisAla
225230235240
GluValValValGluAspGluGluValLeuProGluPheGinLysHis
245250255
CysArgArgArgProLeuProGluPheTrpArgAspTrpAspArgPro
260265270
lieProAlaGluAlaTrpLysAlaHisAsnCyslieProAspGluHis
275280285
TyrValGinThrLeuLeuAlaGinHisGlyLeuGluGluGluLeuThr
290295300
ArgArgSerValThrHisSerAlaTrpAspLeuSerSerSerLysAsp
305310315320
ArgGluArgArgGlyTrpHisProValThrTyrLyslieSerAspAla
325330335
ThrProAlaLeuValLysSerlieLysAsplieAspAsnlieTyrTyr
340345350
GluThrGluAsnArgLysGluTrpCysThrSerAsnGlyLysProAla
355360365
ProCysPheLeuPheAlaArgLysPheThrArgAlaAlaGlyLeuLys
370375380
LeuLeuAspLeuSerLeulle Ala Ala Asn Gly Ala Ser Thr Met
38539039权利要求
一种控制水稻茎秆机械强度的基因，该基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制植物茎秆机械强度功能的核苷酸序列，所述严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液中，所述预杂交液是0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，在65℃预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液，所述杂交液是0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段，在65℃杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液I，所述洗膜液I是20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液II，所述洗膜液II是10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜10-15分钟。
2.按照权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQID NO :1所示的DNA序列。
3. 一种由权利要求1或2所述的核苷酸序列编码的蛋白质。
4.按照权利要求3所述的蛋白质，其特征在于它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
5. 一种含有权利要求1或2所述的控制水稻茎秆机械强度的基因的植物表达载体。
6.按照权利要求5所述的表达载体，所述表达载体是PBC10F。
7. 一种培育植物的方法，所述方法可使植物茎秆机械组织细胞壁的结构和成分发生改 变，从而引起茎秆机械强度发生变化，其特征在于包括下列步骤用按照权利要求5所述的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
全文摘要
本发明提供了一种可控制水稻茎秆机械强度的基因，该基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎秆机械强度功能的功能类似物。本发明还提供了该基因编码的蛋白质，含有该基因的表达载体，和利用该表达载体改变植物茎秆机械强度的方法。
文档编号C12N15/82GK101798574SQ200910077629
公开日2010年8月11日 申请日期2009年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者周奕华, 李家洋, 钱前 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所