专利名称：全血乳酸生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种全血乳酸生物传感器。
背景技术：
全血乳酸生物传感器是一利用生物分子作为敏感元件来快速、准确、方便地测量血液等液体中乳酸含量的生物传感器，应用这种传感器测量人体血液中乳酸含量用于揭示某些疾病的严重程度，用于指导糖尿病患者适当服用降糖灵，过量服用降糖灵会引起糖酵解，使乳酸含量升高，引起酸中毒，危及患者生命；用于测量运动员乳酸的浓度，可以科学地控制运动员训练强度，达到最佳训练效果；在食品科学中可以通过检测乳酸的浓度，确定食品的新鲜程度。目前对乳酸的测量主要采用大型生化分析仪器，价格十分昂贵。所述的乳酸含量是指L-乳酸含量。
在电流型生物传感器中有人采用单一电子中介体加氧化酶的方式研制成一次性L-乳酸生物传感器[1]，该传感器由PVC底板、电极、腔体、反应层、腔体盖板组成，其中电极及电极引线采用单一材料制作，反应层是CMC、L-乳酸氧化酶、铁氰化钾(电子传导体)、缓冲液组成的反应层，腔体的进样孔开在电极另一端。该传感器的缺陷是加在电极引线上的电压较高，为0.5v，抗干扰能力欠佳，其原因是铁氰化钾直接在碳电极表面的氧化还原特性较差，需要提高电压来得到较好的响应电流。中国专利CN1219676A介绍了一种一次性双电子中介体双酶生物传感器，用来检测血液中的胆固醇、葡萄糖等，但这种传感器需要氧的参与，容易受血液中氧含量变化的干扰。
发明内容
一种全血L-乳酸生物传感器，包括底板1、电极2、腔体3、反应层4、腔体盖板5，反应层4布置在腔体3内，其特征在于电极2是用丝网印刷技术在底板1上印刷的碳电极，电极引线2a是用丝网印刷技术在底板1上印刷的银引线；腔体3是在电极2周围覆盖塑料薄膜形成的，其上有一个与腔体相通的横向进样孔，该进样孔是毛细孔，反应层4包含羧甲基纤维素CMC 4a，作为第二电子中介体的修饰碳钠米管4b，L-乳酸氧化酶、作为第一电子中介体的试剂、稳定剂、缓冲液组成的混合物4c，依次分层叠加在碳电极上，且逐层分别干燥；腔体盖板5上开有一个通气孔。羧甲基纤维素CMC 4a含量为10～40ug；第二电子中介体修饰碳钠米管4b是修饰有-COOH、-OH的碳钠米管，含量为4～20ug；反应层4中含L-乳酸氧化酶1～2个活力单位；反应层4中的第一电子中介体试剂选用铁氰化钾、亚甲基兰、普鲁士兰中的一种，含量为40～200ug；反应层4中的稳定剂选用海藻糖、甲壳素、丝素蛋白、牛血清白蛋白中的一种，其含量为20～80ug；反应层4中的缓冲液为磷酸缓冲液，其PH值为6.0～7.0，含量为60～240ug。
同现有技术比较，本发明具有如下突出优点1)在反应层中的修饰碳钠米管作为第二电子中介体使得亚铁氰化钾(第一电子中介体铁氰化钾的还原形式)很容易将电子传递给碳钠米管，碳钠米管在较低电压作用下即能快速地将电子传递给电极，从而显著提高L-乳酸浓度的响应灵敏性；2)同时碳纳米管可以有效的提高酶的活性，促使反应快速进行；3)碳纳米管中的纳米管道可有效的存贮结晶水，有利于酶的长期保存和稳定性；4)应用本传感器测量血液中L-乳酸含量时，加在电极上的电压为300mv，而现有技术施加的电压为0.5v；5)腔体的进样孔位于传感器侧翼，进样时手指夹持电极两侧不会引起传感器变形，避免吸入腔体内血液量的改变；6)本传感器需要的血样极少，只需2μl，而且测量时不需要对血样进行预处理。
图1为全血乳酸生物传感器的结构示意图。
图2为底板1、电极2、电极引线2a、腔体3、腔体盖板5的俯视图。
图3为电极的循环伏安曲线图，图中A为本传感器的循环伏安曲线，B为现有传感器的循环伏安曲线。表明加入第二电子中介体碳钠米管后，铁氰化钾反应的可逆性得到改善，亚铁氰化钾很容易将电子传递给碳钠米管。
图4为本传感器对血液中L-乳酸含量的电流响应关系图，图中C为本传感器电流响应关系，D为现有传感器的电流响应关系。表明加入碳钠米管后，传感器的响应灵敏度得到提高和改善。
具体实施例方式
实施例1一种全血乳酸生物传感器，如图1所示，应用丝网印刷技术分别在PVC底板1上制作厚膜碳电极2和银质电极引线2a，在碳电极2周围覆盖塑料薄膜形成腔体3，向腔体内点入2μl浓度为5mg/ml CMC溶液，溶液经60℃烘箱干燥后，形成CMC层4a；点加2μl修饰碳钠米管悬浮液，其浓度为2mg/ml，经60℃烘箱干燥后，形成碳钠米管层4b，再点加2μl混合液，成分为L-乳酸氧化酶500个活力单位/ml、铁氰化钾50mg/ml、海藻素20mg/ml、PH值为6.0，浓度为0.2M的磷酸缓冲液，经干燥箱干燥后形成的混合层4c，随后在腔体2上覆盖一层塑料薄膜确定腔体3的体积，该体积为2μl，此处的塑料薄膜即为腔体盖板5，其上开有通气孔。
实施例2一种全血乳酸生物传感器，如图1所示，应用丝网印刷技术分别在PVC底板1上制作厚膜碳电极2和银质电极引线2a，在碳电极2周围覆盖塑料薄膜形成腔体3，向腔体内点入2μl浓度为20mg/ml的羧甲基纤维素CMC溶液，溶液经60℃烘箱干燥后，形成CMC层4a；点加2μl修饰碳钠米管悬浮液，其浓度为6mg/ml，经60℃烘箱干燥后，形成碳钠米管层4b，再点加2μl混合液，成分为L-乳酸氧化酶1000个活力单位/ml、铁氰化钾50mg/ml、牛血清白蛋白40mg/ml、PH值为7.0，浓度为0.4M的磷酸缓冲液，经干燥箱干燥后形成混合层4c，随后在腔体3上覆盖一层塑料薄膜，作为腔体盖板5，腔体3的体积为2μl，腔体盖板5上开有通气孔。
参考文献[1]Nobuo Shimojo，Keiichi Naka，Harumi Uenoyama，et al，Electrochemical Assay System withSingle-Use Electrode Strip for Measuring Lactate in Whole Blood，Clinical Chemistry，Vol.39，No.11，199权利要求
1.一种全血乳酸生物传感器，包括底板(1)、电极(2)、腔体(3)、反应层(4)、腔体盖板(5)，反应层(4)布置在腔体(3)内，其特征在于电极(2)是用丝网印刷在底板(1)上的碳电极，电极引线(2a)是用丝网印刷在底板(1)上的银引线；腔体(3)是在电极(2)周围覆盖塑料薄膜形成的，其上有一个与腔体相通的横向进样孔，该进样孔是毛细孔，反应层(4)包含羧甲基纤维素CMC(4a)，作为第二电子中介体的修饰碳钠米管(4b)，L-乳酸氧化酶、作为第一电子中介体的试剂、稳定剂、缓冲液组成的混合物(4c)，依次分层叠加在碳电极上，且逐层分别干燥；腔体盖板(5)上开有一个通气孔。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于羧甲基纤维素CMC(4a)其含量为10～40ug。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于修饰有-COOH、-OH的碳钠米管(4b)，其含量为4～20ug。
4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于反应层(4)中含L-乳酸氧化酶1～2个活力单位。
5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于反应层(4)中的试剂选用铁氰化钾、亚甲基兰、普鲁士兰中的一种，其含量为40～200ug。
6.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于反应层(4)中的稳定剂选用海藻糖、甲壳素、丝素蛋白、牛血清白蛋白中的一种，其含量为20～80ug。
7.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于反应层(4c)中的缓冲液为磷酸缓冲液，其PH值为6.0～7.0，其含量为60～240ug。
全文摘要
一种全血乳酸生物传感器，其特征是腔体(3)是在电极(2)周围覆盖塑料薄膜形成的，其上有一个与腔体相通的毛细孔，反应层(4)包含羧甲基纤维素CMC(4a)，作为第二电子中介体的修饰碳钠米管(4b)，L－乳酸氧化酶、作为第一电子中介体的试剂、稳定剂、缓冲液组成的混合物(4c)，依次叠加在腔体内。同现有技术比较，本发明具有如下突出优点1)在反应层中修饰碳钠米管作为第二电子中介体，显著提高L－乳酸浓度的响应灵敏性；2)测量血液中L－乳酸含量时，加在电极上的电压为300mv，而现有技术施加的电压为0.5v；3)腔体的进样孔位于传感器侧翼，进样时手指夹持电极两侧不会引起传感器变形，避免吸入腔体内血液量的改变；4)本传感器需要的血样极少，只需2μl，而且测量时不需要对血样进行预处理。
文档编号G01N27/327GK1462880SQ0312943
公开日2003年12月24日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者陈裕泉, 吴维明, 童基均 申请人:浙江大学