专利名称：电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸定量聚合酶链式反应(PCR)芯片的电化学检测技术，该新型的电化学PCR检测芯片和检测方法可用于生物科学和医学领域中多种核酸的并行定量扩增检测。
背景技术：
随着生命科学的发展，基因组的研究逐渐深入，从基因水平上认识生命的差异、疾病发生、发展的规律、以及药物与生命体的相互作用将成为可能。核酸序列信息的高通量检测和分析技术将成为医学等生命科学领域的核心技术之一。人们需要发展高通量、准确、低成本基因信息的检测方法。近来，基因芯片技术越来越受到人们的重视。但是，目前基因芯片技术在临床监测和诊断应用中尚存在瓶颈问题，严重影响其在生物学和医学临床中的实际应用。1)首先是定量检测问题。目前的基因芯片技术，基因的PCR扩增过程与检测过程是分开进行的，这样不能准确定量地检测基因的原始模板量。2)检测对象需要进行多步处理，并且要进行荧光标记。检测过程操作复杂，影响检测的可靠性。另外荧光检测需要较好的光学检测系统支持，在临床应用中成本较高。
因此，发展一种能够实时定量检测的基因芯片技术对芯片的临床应用会是一个巨大的推动，以电化学检测和PCR扩增相结合的技术是本芯片技术定量的关键，这必为生物芯片在生物医学和生命科学等领域中广泛应用奠定基础。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种可以实时定量检测的电化学定量PCR检测芯片的制备和检测方法，可以实现多个核酸片段的定量检测。
技术方案本发明提出了一种利用电化学方法定量检测PCR过程的生物芯片技术，它是一种核酸的定量检测技术。该技术的具体实施方案为(a)在固体载体的表面上制备一组电极微阵列，(b)在电极微阵列的电极上固定核酸捕获的分子探针，(c)在固定有核酸捕获的分子探针的电极区域制备一个能够装载液体的全封闭的微小腔体，腔体内可进行生化反应，腔体上有液体的注入口，(d)在固体载体的电极上接有连接电线，可与电化学检测装置相连接来对电极施加电压或电流，以及电信号的采集，电化学检测装置是指在电极表面发生生物化学反应时能够检测其电流和电压等变化的仪器，如恒电位仪。
所述的核酸捕获的分子探针直接固定在电极的表面，或通过某种手臂分子“NH2，HS”的作用与电极表面结合。
所述的电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的检测方法为a、把核酸、酶、脱氧核糖核苷酸、电化学活性物质等反应组分加入上述的电化学定量PCR芯片的全封闭的微小腔体中；b、将芯片置于一个可以进行温度控制的大腔体中，进行PCR扩增反应c、通过恒电位仪来检测电极表面的捕获DNA探针分子上因为发生反应面产生的电流电压的变化；d、PCR每循环一次或数次，就检测一次电流电压的变化通过检测不同电极上PCR循环过程中的电流电压的变化规律对多个基因进行PCR定量检测。
PCR的反应组分中电化学活性物质为染料试剂、金属粒子等具有电化学指示作用的物质。
PCR反应和检测仪器是包括温控系统、电信号检测系统和芯片的引入和取出部件。该芯片检测的对象可以是DNA、RNA、反转录cDNA(互补DNA)或是其他的核酸片断。
技术效果本发明提出的电化学实时定量检测PCR芯片技术具有以下特点1、该芯片最大的特点就是能够进行核酸的定量检测，是电化学技术和PCR技术相结合的核酸定量的新技术。
2、载体表面可以制备多个电极，在每个电极上制备特异性的核酸捕获分子探针，而且芯片上可以进行多重的PCR，从而实现多个位点并行检测，该体系检测不会存在相互污染问题。
3、该定量检测芯片是利用电化学方法对PCR扩增的过程进行检测，不需要任何的荧光标记，降低了检测成本，同时也避免了荧光检测过程中选择染料时受其激发波长范围的影响等问题。
4、电化学方法检测灵敏度高，可以对低拷贝的基因进行准确检测，操作简便，成本低。
本实时定量扩增的芯片技术，对生物芯片在生物科学和医学临床的定量检测方面的应用开拓了广阔的前景。
以下将结合附图对本技术作进一步说明。
图1、检测芯片基底横切面结构示意图，图2、检测芯片纵切面结构示意图，图3、检测芯片工作示意图，图4固定了探针的电极工作示意图，图5以50mv/s的速度扫描时检测到的不同样品循环伏安信号曲线，图6电化学定量PCR的电信号随着循环数变化的曲线。
以上的图中有第一工作电极1、第二工作电极2、参比电极3、第三工作电极4、第四工作电极5、对电极6、固体载体7、溶液池8、对电极电连接线9、参比电极电连接线10、工作电极电连接线11、溶液池盖12、电化学检测仪13、温度控制装置14、电化学定量检测芯片15、固定了探针的工作电极16、工作电极上的探针结合了扩增产物17、工作电极上的杂交产物结合了电活性物质18、扩增过程中不同循环时检测的样品的电化学信号曲线19、20、21。
具体实施例方式
该电化学定量PCR检测芯片是由一个可以进行PCR扩增的带有全封闭腔体的固体载体组成的。首先是在固体载体的表面制备电极微阵列，在电极区域有一定的空间用于液体存储和反应，然后再制备用于对该固体载体进行全封闭的微小腔体，该腔体上有用于加样的小孔。固体载体是由金属、玻璃、硅片、塑料、陶瓷等能够制备电极并且可以对其进行温度控制的材料组成；载体表面的电极上固定待检基因的捕获分子探针，该分子探针可以直接固定在电极上，也可以通过某种手臂分子(NH2，HS等)的作用与电极表面特异性的结合。
还有一个能够容纳该电化学定量PCR检测芯片的温度控制装置，该装置能够使固体载体表面上电极区域的液体进行PCR反应。
该电化学定量PCR检测芯片还有一组电极连接线。该连接线与电化学检测装置相连接来对电极施加电压或电流，以及电信号的采集；该连接线的制备不影响固体载体的全封闭。该电化学检测装置的特点是能够同时进行多个电极信号的采集分析。
该芯片检测过程是将待检基因连同PCR反应体系和电化学检测活性物质一起加入到芯片上的电极区域，封闭该芯片并且放入到温度控制装置里进行PCR反应，PCR反应的同时通过电化学检测装置进行相关的电压、电流等的供应和电信号的采集。PCR过程中，产生的待检基因片断就会不断的与捕获探针形成双链DNA，通过检测电化学活性物质上的电化学信号随着PCR进程的变化规律，就可以检测特检基因的扩增情况。PCR每循环一次或数次，就采集一次电化学信号；通过检测不同电极上PCR循环过程中的电化学信号的变化规律来检测多个基因的PCR定量检测。PCR的反应组分中电化学活性物质为染料试剂、金属粒子等具有电化学指示作用的物质。
实例1电化学与PCR结合检测p16基因的甲基化状态1、电极及其探针的制备在金电极上固定特异性的可以检测甲基化状态的探针。首先进行电极预处理，金电极经Piranha溶液、丙酮、无水乙醇依次浸泡0.5min，然后用0.05μm Al2O3磨垫抛光，超声波清洗约1min，氮气干燥。将金电极浸入含有100μg/ml HS2ssDNA的TE缓冲液中，于4℃放置12h，得到单链DNA修饰电极(HS2ssDNA/Au电极)。
2、PCR扩增待检样品DNA提取以后，将电化学指示剂加入其中，进行普通的PCR扩增。
3、扩增产物的检测扩增产物与电极上的探针结合后，在电化学指示剂的作用下，用电化学仪在80mV的作用下进行检测。每一个PCR循环，检测一次，从面可以对相应的样品中被检DNA原始模板量的情况进行定量检测。(试验结果见图5)实施2母体血浆中胎儿DNA的电化学PCR芯片检测1、设计了几组扩增检测胎儿特异(Y染色体上特异的区段)的基因探针和引物序列，用普通的电泳法检测筛选出了最佳的引物探针组合进行电化学实时检测。
2、电极及胎儿DNA特异性的探针的制作固定方法同上3、样品处理及PCR扩增首先从血浆样品中提取纯化出DNA，然后在合适的温度循环下(94℃，30s-50℃，30s-72℃，30s)进行扩增，在每个PCR循环后用电化学仪采集相关的信号，并且进行处理，结果显示胎儿DNA的随着PCR循环数的增加而逐渐增加。(如图6，a为阴性对照b、c、d、e为不同的样品)
权利要求
1.一种电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备方法，其特征是制备的方法为(a)在固体载体的表面上制备一组电极微阵列，(b)在电极微阵列的电极上固定核酸捕获的分子探针，(c)在固定有核酸捕获的分子探针的电极区域制备一个能够装载液体的全封闭的微小腔体，腔体内可进行生化反应，腔体上有液体的注入口，(d)在固体载体的电极上接有连接电线，可与电化学检测装置相连接来对电极施加电压或电流，以及电信号的采集，
2.根据权利要求1所述的电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备方法，其特征在于所述的核酸捕获的分子探针直接固定在电极的表面，或通过某种手臂分子“NH2，HS”的作用与电极表面结合。
3.一种如权利要求1所述的电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的检测方法，其特征是检测方法为a、把核酸、酶、脱氧核糖核苷酸、电化学活性物质等反应组分加入上述的电化学定量PCR芯片的全封闭的微小腔体中；b、将芯片置于一个可以进行温度控制的大腔体中，进行PCR扩增反应；c、通过恒电位仪来检测电极表面的捕获DNA探针分子上因为发生反应面产生的电流电压的变化；d、PCR每循环一次或数次，就检测一次电流电压的变化；通过检测不同电极上PCR循环过程中的电流电压的变化规律对多个基因进行PCR定量检测。
4.根据权利要求3所述的电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的检测方法，其特征是PCR的反应组分中电化学活性物质为染料试剂、金属粒子等具有电化学指示作用的物质。
全文摘要
电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备方法涉及一种核酸定量聚合酶链式反应芯片的电化学检测技术，其制备的方法为在固体载体的表面上制备一组电极微阵列；在电极微阵列的电极上固定核酸捕获的分子探针；在固定有核酸捕获的分子探针的电极区域制备一个能够装载液体的全封闭的微小腔体；在固体载体的电极上接有连接电线，检测方法为；把核酸、酶、脱氧核糖核苷酸、电化学活性物质等反应组分加入微小腔体中；将芯片置于一个可以进行温度控制的大腔体中；通过恒电位仪来检测电极表面的捕获DNA探针分子上因为发生反应而产生的电流电压的变化；通过检测不同电极上PGR循环过程中的电流电压的变化规律对多个基因进行PCR定量检测。
文档编号G01N27/26GK1605861SQ20041006571
公开日2005年4月13日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者陆祖宏, 葛芹玉, 刘全俊, 白云飞 申请人:东南大学