专利名称：具有不通气通道的样品处理装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对分析物样品的分离和/或分级有用的装置。
背景技术：
用于蛋白质样品地二维分离系统是非常令人感兴趣的，这是由于与一维系统相比它们的峰值容量增加了。例如，当前采用二维聚(丙烯酰胺)凝胶电泳进行复合蛋白质混合物的分离，其中蛋白质首先通过它们的等电点分离，然后通过大小分离。该技术非常好地分离蛋白质混合物，然而非常耗时且劳动密集。而且，因为蛋白质嵌入在凝胶基质中，从而对于例如通过质谱测定法的进一步分析需要大量的试验方案，包括脱色、凝胶内消化、以及萃取。诸如需要大量人为干预的过程以及大量的流体传送等能导致误差、污染、以及暴露到潜在的生物危害中。因此，存在对如下装置的需求，该装置能为二维分离和随后的分析提供有限的使用者干预。
发明内容
本发明提供一种装置，该装置包括基片，该基片具有第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转轴线；以及不通气通道，该不通气通道适于对样品进行分级。在一个实施例中，不通气通道包括多个连接的隔室。在另一实施例中，装置还包括至少一个集成电极，所述至少一个集成电极能可松开地连接或集成到装置的基片上。
本发明也提供还包括连接结构和其它特征件的装置，这些特征件至少通过那些连接结构而连接到不通气通道上。
本发明还提供使用根据本发明装置的方法。例如，本发明的装置对进行分析物样品的处理、分离和/或分级是有用的。因此，在一些实施例中，这些装置可适于进行等电聚焦和/或毛细管电泳。
本发明的其它优点和特征将从以下详细说明、附图、以及权利要求中显而易见。
附图的简要说明
图1a、1b、1c、1d和1e为根据本发明的装置的平面图(a)单一半径；(b)可变半径；(c)螺旋；(d)平直；以及(e)角形。
图2a、2b、2c、2d和2e为在图1a、1b、1c、1d和1e中示出的装置的对置侧的平面图。
图3为根据本发明的装置的一部分的横截面图。
图4为根据本发明的不通气通道的一部分的平面图。
图5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g和5h示出了不通气通道的示例性设计。
图6a和6b示出了用于产生pH梯度的固定方案的实例。
图7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g、7h和7i示出了不同的几何形状(a)样品室；(b)具有阀的样品室；(c)具有两个阀以及收集容器的样品室；(d)具有两个阀和到盘上的毛细管电泳的连接的样品室；(e)与7d一样，具有单独一个毛细管；(f)多个样品室；(g)从样品移开的样品注入口；(h)具有连接结构的样品平直通道；和(i)具有连接结构的角形通道。
图8为装置的特征件的一部分的平面图。
图9a和9b为根据本发明的具有两个阀的装置的一部分的横截面图。
图10a、10b和10c示出了示例性毛细管电泳注入口结构的各个视图(a)横截面图；(b)顶视图；以及(c)底视图。
图11示出了根据本发明的毛细管电极结构的实例的横截面图。
图12a、12b和12c为根据本发明的集成电极的展开图。
图13a、13b和13c为根据本发明的集成电极的横截面图。
图14为集成到基部中的电极的横截面图，其中装置在该基部上旋转。
图15为根据本发明的用于等电聚焦的装置的平面图。
图16a和16b示出了从蛋白质级份中获得的二维实际凝胶，这些蛋白质级份是从用于等电聚焦的装置获得的。
图17a和17b为蛋白质样品的采用RotoforTM设备得到的考马斯染色的SDS-PAGE图像。
图18为根据本发明的用于蛋白质IEF、变性和毛细管电泳注入的装置的平面图。
图19a、19b和19c为变性的蛋白质样品的一维凝胶(a)在试管中变性，不加热；(b)在试管中加热到95℃下5分钟；而(c)在本发明的装置中加热到95℃下5分钟。
图20的图表示出了采用本发明的装置加热不同量的时间而获得的变性的淀粉葡萄糖苷酶的相对浓度之间的比较。
图21示出了采用本发明的装置加热不同量的时间而获得的变性的蛋白质的电泳谱图(荧光对迁移时间)。
图22为从本发明装置的等电聚焦容器获得的蛋白质级份的二维实际凝胶，在Agilent 2100生物分析仪上分析这些蛋白质级份。
图23a、23b、23c和23d为对分离的蛋白质级份进行等电聚焦的基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
图24a、24b和24c为来自图23a、23b、23c和23d中的一些图的等电聚焦的级份的MALDI肽指纹谱(m/z 700-4,000)的实例。
图25为根据本发明的构造成用于等电聚焦、变性和毛细管电泳的装置的平面图。
本发明的详细说明
本发明提供包括基片和不通气通道的装置。在本发明的一个实施例中，该装置能用于样品处理。例如，能利用该装置进行电泳分离，包括对样品的等电聚焦。
本发明的装置
在图1a中示出了根据本发明的装置100的一侧。在这里示出的该装置100包括基片102。在本发明的一个实施例中，该基片102具有大体扁平的圆形。该基片102还可具有不同于圆形的形状，例如椭圆形或正方形。
基片102包括第一主表面104和在图2a中示出的第二主表面106。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员应理解到在基片102上形成的特征件可在第一主表面104、第二主表面106中的任何一个主表面上形成，或者在这两个主表面的任何组合上形成。
在对根据本发明的装置100的描述中，会采用相对的术语“顶部”和“底部”。应理解到这些术语仅在它们的相对意义上使用。例如，关于基片102的第一主表面104和第二主表面106，可采用“顶部”和“底部”的短语来表示基片102的对置表面。注意在使用中，装置的取向是不相关的，而且对装置的“顶部”或“底部”的描述不意图以任何方式对本发明或其使用进行限制。
基片102的厚度可根据许多因素而改变，这些因素包括但不限于基片102内包含的特征件的深度。在本发明的一个实施例中，基片102为大约0.1毫米至大约100毫米厚。在另一实施例中，基片102为大约1毫米至大约4毫米厚。
基片102的尺寸也可根据许多因素而改变，这些因素包括但不限于在基片内形成的特征件的数量、类型和尺寸、将用于控制该装置的系统、以及要分析的样品的大小。一般地，在基片102为圆形形状的实施例中，基片102的直径为大约50毫米至大约500毫米。在另一实施例中，基片102具有大约80毫米至大约120毫米的直径。
基片102可由已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员认为对这种装置是合适的任何材料制成。这些材料的实例包括但不限于聚合物，如热塑性塑料，包括聚烯烃、聚丙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(来自杜邦的特氟纶)、聚硅氧烷或它们的组合。在本发明的一个实施例中，基片102由聚丙烯制成。
包含在其内形成的各种特征件的基片102能由已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的任何方法制作成。对在基片102内形成的特征件进行制作的这些方法的实例包括但不限于注模、机械加工、显微机械加工、挤出复制、冲压、激光烧蚀、反应离子刻蚀或它们的组合。
本发明的装置100还包括形成用于基片102的旋转中心轴线108的轴心。将本发明的装置100布置成使得装置100的绕旋转中心轴线108的旋转有助于装置100的不同特征件之内和之间的材料的传送或运动。图1a、1b、1c、1d和1e中的箭头DR示出了装置100的绕旋转中心轴线108的旋转。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将理解该装置也能在与图1a、1b、1c、1d和1e所示方向相反的方向上旋转。
根据本发明的装置100还包括不通气通道110。在图1a、1b、1c、1d和1e中可看到不通气通道110的各种结构的实例。对置侧即在图1a、1b、1c、1d和1e中示出的示例性装置的第二主表面106分别在图2a、2b、2c、2d和2e中示出。不通气通道110大体形成在第一主表面104、第二主表面106或其组合内。在图1a、1b、1c、1d和1e以及图2a、2b、2c、2d和2e中示出的实施例中，不通气通道110形成在第一主表面104内，如图1a、1b、1c、1d和1e上的实线以及图2a、2b、2c、2d和2e上的虚线示出的那样，图2中的虚线表示不通气通道110形成在图2a、2b、2c、2d和2e示出的基片102的隐藏侧或对置侧上或形成在其内。
如在这里使用的那样，短语“不通气通道”110中的词“不通气”表示在充满液体时，通过从该通道移置一部分流体能在该通道内产生真空。在某些实施例中，由来自装置内的气体填充能在通道内产生的该真空，而不是由来自装置外部的气体填充该真空。例如，当流体从通道移置(如通过旋转该装置)并进入连接结构时，进入的流体将迫使该连接结构中的气体进入通道内，而且连接结构中的气体将进入通道内的由流体移置而产生的真空。在这一意义上的不通气与通过从通道移置流体而将来自装置外部的气体吸入通道的通气系统不同。通气系统一般还将包括通气孔，以防止由于流体的移置而在通道内形成真空。采用词“不通气”并不表示通道不能包括通气孔，而是指通道展示出不通气系统或密封系统的上述特征。
在本发明的一个实施例中，不通气通道110大体沿着基片102的圆弧。在基片102具有大体圆形形状的一个示例性实施例中，不通气通道110可以具有大体沿着基片102的圆弧的圆弧，即绕基片的中心是圆形的或同心的圆弧。可以根据许多因素来选择不通气通道110的长度，这些因素包括但不限于不通气通道110的用途以及基片102的尺寸。在不通气通道110将用于等电聚焦(IEF)的实施例中，不通气通道110的长度可至少部分地取决于分离中所期望的pH敏感度即所期望的pH级份的数量、以及要分离的样品的特定种类。
可以用由不通气通道110形成的圆弧相对于装置100在使用过程中绕着旋转的旋转轴线108测量的角度大小来表征不通气通道110的长度。例如，在相对于装置100在使用过程中绕着旋转的旋转轴线108测量时，不通气通道110可形成约10°或更大的圆弧，可替换地约180°或更大。可替换地，不通气通道110可形成绕装置100的更长圆弧。例如，在相对于装置100在使用过程中绕着旋转的旋转轴线108测量时，不通气通道110可形成约320°或更大的圆弧。还应理解到，在一些实例中，不通气通道110能绕装置100延伸超过360°。在用圆弧角度表征不通气通道110的长度时，装置100的尺寸也将是决定不通气通道110的路径长度的因素。
还可用不通气通道110到旋转轴线108的距离表征该装置。这里的距离指的是不通气通道110的中心到旋转轴线108的距离。该距离在图1a中图示为半径r。在本发明的一个实施例中，不通气通道110的半径为至少约10毫米。在另一实施例中，不通气通道110的半径为大约10毫米至大约120毫米。在另一实施例中，不通气通道110的半径为大约20毫米至大约50毫米。
在本发明的一个实施例中，该半径并非沿不通气通道110的整个长度都是恒定的。在一个实施例中，该半径能随着不通气通道110的长度而增加。在图1b中可看到本发明装置的半径增加(r2＞r1)的一个实例。取决于相对的比较，这一装置也能表征为半径减小，即r2＜r1。具有非恒定半径的装置还能形成螺旋形的不通气通道110。在图1c中可看到这一装置的实例。在该实例中，r1＜r2＜r3。
在图1d中示出的另一实施例中，不通气通道可以沿着平直路径，该平直路径例如大致与旋转轴线108平行地沿基片的主表面延伸。可替换地，如图1e示出的那样，通道可以以绕基片中心同心布置的一系列平直部分为形式，或者如上所述离中心的距离是变化的。
不通气通道110的深度和宽度可以至少部分地取决于基片102的尺寸、不通气通道110的长度、样品的尺寸、或它们的某些组合。一般地，不通气通道110的深度为大约10微米至大约2000微米。在一个实施例中，不通气通道110的深度为大约100微米至大约500微米。与不那么深的不通气通道110相对比，具有较深不通气通道110的实施例能采用增加的样品载荷。然而，增加的通道深度会导致焦耳加热的增加，这是因为用于已设定电场强度的电流增加了。一般地，增加的焦耳加热是不期望的。因此，在本发明的一个实施例中，对具有能容许的焦耳加热量的所期望的样品尺寸的优化将至少部分地决定不通气通道110的尺寸。一般地，不通气通道110的宽度为大约10微米至大约2000微米。在一个实施例中，不通气通道110的宽度为大约100微米至大约1000微米。
不通气通道110的侧面或表面能具有大量不同的特征件，例如包括光滑表面、粗糙表面、波状表面、平直侧面、或倾斜侧面。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员还将理解到这些特征件或其组合可根据装置的不同用途而提供各种优点或缺点。
在根据本发明的装置100的一个实施例中，不通气通道110包括第一样品孔112和第二样品孔114。一般可将第一样品孔112和第二样品孔114描述为不通气通道110的两个端部上的隔室。第一样品孔112和第二样品孔114能具有许多功能，例如将样品引入至装置100、将一个或多个电极引入到装置100、将试剂或溶液引入至装置100、或这些功能的任何组合。在本发明的一个实施例中，利用第一样品孔112或第二样品孔114将样品引入到装置100中。在另一实施例中，能采用一个或多个第一样品孔112和/或第二样品孔114将两种不同的溶液、以及两个电极引入到装置100中。
在一个实施例中，第一样品孔112和第二样品孔114构造成允许使用者采用移液管或注射器将样品、试剂或溶液引入到装置100中。在装置的另一实施例中，第一样品孔112和第二样品孔114还构造成与以下将更加详细描述的集成电极一起起作用。
在本发明的一个实施例中，基片102中包含的特征件是密封的或是被覆盖的。图3示出了装置100的一部分的横截面、以及用于对装置100进行密封的示例方法。装置100包括具有第一主表面104和第二主表面106的基片102，在该基片102中至少形成不通气通道110。在本发明的该实施例中，覆盖膜120施加到基片102的第一主表面104上。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将理解到能将覆盖膜120仅施加到第一主表面104的包含特征件的区域上，或施加到整个第一主表面104上。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员还将理解到可以用覆盖膜120覆盖第一主表面104、或第二主表面106、或者这两个主表面，这取决于是否已经在两个表面内形成特征件还是仅在这些表面中的一个表面上形成特征件。
在本发明的一个实施例中，覆盖膜120具有约50微米至约1000微米的厚度。在另一实施例中，覆盖膜120具有约100微米至约250微米的厚度。覆盖膜120能由已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员认为合适的任何材料制成。这些材料的实例包括但不限于聚烯烃、聚丙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(来自杜邦的特氟纶)、聚硅氧烷以及它们的组合。在一个实施例中，用透明的聚烯烃压敏硅酮粘合剂密封基片102。
起到密封膜作用的覆盖膜120可以包括但不必须包括设置在衬底(如选定波长的电磁能量能透过的衬底)上的粘合剂，如压敏粘合剂。在一个实施例中，选择粘合剂使得粘合剂较好地粘附到制成传统分析容器的材料(如聚烯烃、聚苯乙烯、聚碳酸酯或它们的组合)上；在高温和低温贮藏(如约-80℃至约150℃)期间保持粘附，同时还提供对样品蒸发的有效密封；大致上不溶解于或者与生物样品混合物或其某些组合反应。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将理解到这些考虑中的一些考虑可能对一些应用是重要的，但一些考虑可能并不重要。在一个实施例中，粘合剂不干涉(例如结合蛋白质、溶解在溶液里等)装置100内进行的任何过程。示例性粘合剂可以包括那些通常在进行生物反应的分析装置的覆盖膜上使用的粘合剂。这些粘合剂包括但不限于例如在国际公开WO 00/45180(Ko等人)和WO00/68336(Ko等人)中描述的聚α烯烃及硅酮。
在本发明的装置100的一个实施例中，不通气通道110包括多个连接的隔室122。图4示出了包括多个连接的隔室122的不通气通道110的一个实施例的一部分。不通气通道110的内半径123可以包括或者不包括如锯齿的特征件。不通气通道110的外半径125可以包括或者不包括如锯齿的特征件。不通气通道110的特征可在于陡的角度，或可替换地为弯曲的。在该实施例中，这里一般将不通气通道110的结构称为“分成隔室的”。
在本发明的一个实施例中，多个连接的隔室中的每个隔室具有至少约1皮升(pL)的容积。在另一实施例中，多个连接的隔室中的每个隔室具有小于约100微升的容积。在本发明的一个实施例中，多个连接的隔室122中的至少一个隔室具有与所述多个连接的隔室122中的其它隔室不同的容积。这一实施例可允许所收集样品的变化。这也许能够通过仅聚焦感兴趣的样品而为使用者节约时间。这还可以有助于将多于一个的不通气通道110放置在单独一个装置100上。
如图4所见，所述多个连接的隔室122中的每个隔室具有前缘128和后缘130。后缘130是连接的隔室122的面向旋转方向DR的侧面。前缘128为每个相应的连接的隔室122的另一侧面，或者是背离旋转方向DR的侧面。不通气通道110的内半径123的前缘128到重心的角度(在图4中定义为a)一般在从约10°到约90°的范围内。在一个实施例中，不通气通道110的外半径125的前缘128到重心的角度(在图4中定义为b)约为45°。在一个实施例中，角度b大于或等于a。在另一实施例中，角度b等于a。在一个实施例中，后缘130到内半径123以及外半径125的角度由a和b决定，而且在一个实施例中，它们与a和b相同。在一个实施例中，由前缘128和后缘130的角度产生的锯齿状通道可起到减小在装置旋转的过程中不通气通道110内流体惯性的作用。
图5a示出了不通气通道110的另一示例性设计。在该实施例中，不通气通道110的多个连接的隔室122之间的过渡是光滑的。这一实施例可限制不通气通道110内的焦耳加热效应。
图5b示出了不通气通道110的另一示例性设计。该实施例示出了窄点505。窄点505一般指不通气通道110的在两个连接的隔室122之间的最窄的区域。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将理解到，内半径123(即通道的离基片旋转中心较近的侧面)以及外半径125(即通道的离基片旋转中心较远的侧面)的前缘128到旋转中心轴线108的角度能至少部分地决定窄点505的尺寸。在本发明的一个实施例中，在将本发明的装置用于蛋白质分离时，较小的窄点505能提供更加有效的分离。然而，随着窄点505的尺寸变小，焦耳加热效应就增加。在一个实施例中，窄点505的直径约200微米或小于200微米。在另一实施例中，窄点505的直径为约10微米。
在本发明的一个实施例中，多个连接的隔室122起到收集此时通过收集区域124的样品部分的功能(见图5a和5b)。通常，样品然后例如通过连接结构或通道从收集区域124向装置的至少一个另外的特征件行进。
如图5c和5d示出的那样，可将收集区域构造成使得样品以多种角度中的任何角度进入连接结构或通道或者离开隔室。例如，在图5c和5d中标识为角度X和Y的位于收集区域124和外半径125之间的角度可大约相等(例如见图5b)，或者如图5c和5d分别示出的那样，这些角度可以不同使得X＜Y或者X＞Y。在一个实施例中，X或Y约为180°。
在本发明的另一实施例中，不通气通道110不包括多个连接的隔室，但包括距旋转中心轴线108具有变化半径的结构。这一实施例可以描述为是蛇形的。在这一实施例中，不通气通道110的中部到旋转中心轴线108的距离在最小值和最大值之间波动。这种蛇形不通气通道110可以具有或者可以不具有从旋转中心轴线108到内半径123的恒定距离、以及从旋转中心轴线108到不通气通道110的外半径125的较大恒定距离。
在本发明的一个实施例中，离中心较近的通道壁(即内半径)离基片中心的距离是变化的。到中心的距离可例如在已设定最小值和最大值之间变化或波动，从而产生如图5f和5g所示的波状或Z字型图案。离中心较远的通道壁(即外半径)可同样地在期望的最小值和最大值之间变化或波动。如图5f和5g所示，这些内半径和外半径可以以相同的量波动，在该情形下，通道的宽度或横截面面积将保持相对恒定。可替换地，这些外半径和内半径可以以不同的量波动，这造成交替的窄点(通道变窄的区域)和隔室。在图4以及图5a和5b中示出了这一实施例的实例，其中内半径波动的量比外半径波动的量小。在图5g和5h示出的另外又一实施例中，在外半径波动的同时内半径可保持相对恒定，或者反之亦然。
在本发明的一个实施例中，不通气通道110能用于进行等电聚焦(IEF)，其中连接的隔室122起到产生用于从样品分离蛋白质的不同pH容器的功能。在这一实施例中，除了待分离的样品之外，还能将至少一种溶液添加到不通气通道110中。在使用中，可以在最终使用者获得装置100之前添加该至少一种溶液，或者可以由使用者添加该至少一种溶液。在不通气通道110用于IEF的实施例中，能将已分离的蛋白质级份从装置100中取出，以用于进一步的分析，或者可以将装置100构造成使得能在装置100自身上进行进一步的分析。
在本发明的将把不通气通道110用于蛋白质的IEF的实施例中，不通气通道可以是但不必须是表面改性的。
在一个实施例中，实际上能对装置内的任何特征件的任何表面进行改性，从而改变其某些性质。能够改变的性质的实例包括但不限于表面能、疏水性、亲水性或对特定部分的反应性。在一个实施例中，至少一个特征件的至少一个表面的表面能增加了。能用于对表面进行改性以增加表面能的材料的实例包括钻石状玻璃(diamond-likeglass)。能在WO 01/67087中找到关于钻石状玻璃的细节。
在一个实施例中，能够对不通气通道110的表面进行改性，从而在将溶液添加到不通气通道时产生pH梯度。在对不通气通道进行表面改性从而允许在装置中形成pH梯度时，表面改性在这里指的是“固定pH梯度”。能采用已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的任何方法来产生固定pH梯度。图6a和6b示出了能用于产生固定pH梯度的表面改性的两个实例。图6a中示出的实例包括通过用三甲基硅烷等离子体处理而使聚合表面硅烷化从而对不通气通道进行表面改性。丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由图6a中的601表示)首先键合到表面Si-OH基(由603表示)上。ImmobilineTM(Amersham Bioscience，Sunnyvale CA)单体然后能与601的丙烯酸官能团反应以移植所需的分子，从而产生pH梯度。也可采用具有与酰胺基反应的官能团的其它硅烷化学物。图6b示出了产生固定pH梯度的另一示例性方法，该方法包括使具有不同官能团(从而具有不同pKa值)的硅烷与等离子体处理的表面反应。该方法不需要将ImmobilineTM固定到通道表面上的附加步骤。
其它特征件
在一个实施例中，本发明的装置可包括除了以上所讨论的特征件之外的特征件。这些其它特征件的实例包括但不限于腔室、连接结构、阀、以及分析结构。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员应理解能以与不通气通道的方式类似的方式形成这些其它特征件。
在图7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g、7h和7i中能看到包括一些这样的特征件的装置的实例。图7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g、7h和7i中的装置仅示出了将在这一示例性装置中形成的特征件，而不是装置(即基片)本身。
图7a中的示例性装置包括不通气通道710、第一样品孔712、第二样品孔714、至少一个隔室连接结构716以及至少一个腔室720。
根据本发明的不通气通道710、第一样品孔712、以及第二样品孔714可包括以上讨论的特征件中的一些特征件或这些特征件的任何组合。多个隔室连接结构716起到将不通气通道710的多个连接的隔室(在图7a中没有明确示出)连接到多个腔室720上的作用。在不通气通道110不由多个连接的隔室制成的实施例如示例性蛇形不通气通道中，多个连接的隔室一般与不通气通道110的外半径125在外半径125离旋转中心轴线108最远处接触。一般地，隔室连接结构716的物理特征，如长度、深度、宽度等将按照与它们连接的不通气通道710和腔室720的尺寸相同的比例而进行选择。隔室连接结构716的横截面几何形状可以例如是梯形、圆形、矩形或这些几何形状的任何变体。也可以对隔室连接结构716上的表面进行改性以改变表面特性，从而防止或促进溶液的毛细管作用，或者从而进行对化学溶液的改性。
一般地，所述多个腔室720可起到容纳已经通过隔室连接结构716从不通气通道710的连接的隔室(这里未示出)传送来的样品的作用。腔室720还可以但不必须起到反应孔、冷却或加热区域、保持区域或其任何组合的作用。一般地，隔室连接结构716的物理特征，如长度、深度、宽度等将按照与它们连接的不通气通道710和腔室720的尺寸相同的比例而进行选择。腔室720可以但不必须起到进行化学反应或对样品的改性的功能。在一个实施例中，一个连接的隔室(在图7a中未示出)可连续地连接到多于一个的腔室720上。这能允许在多于一组的条件下对样品进行处理。
在本发明的一个实施例中，多个腔室720能起到反应孔的作用。在这一实施例中，一般地，腔室720预先充有用于所期望的一个反应或多个反应的试剂。能在腔室720中进行的反应的一个实例包括蛋白质的变性。在该实例中，使蛋白质变性所需的试剂可在最终使用者获得装置之前就预先加载到腔室720中，或由使用者加载。
在本发明的另一实施例中，多个腔室720能起到蛋白质消化孔的作用，其中用蛋白酶如胰蛋白酶消化蛋白质样品，以产生作为结果的肽。
在多个腔室720起到加热区域作用的实施例中，能采用已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的任何方法对腔室进行加热。在WO 02/00347中能找到这些方法的实例。在另外又一实施例中，多个腔室720能既起到反应孔的作用又起到加热区域的作用。
在图7b中示出了本发明的另一示例性实施例。图7b中的装置包括图7a的所有特征件(标以相同的附图标记)、以及腔室720内或与腔室720相连的至少一个隔室阀718。以上关于图7a讨论的特征件可具有以上讨论的特征件和/或功能中的一些或其任何组合。隔室阀718起到对流体从不通气通道710的所述多个连接的隔室到腔室720的流动进行控制的作用。以下将更详细地讨论隔室阀718的示例性构造和功能。
图7c示出了根据本发明的装置的另一示例性实施例。在图7c中示出的装置特征件包括图7b中示出的装置的所有特征件(标以相同的附图标记)、以及至少一个腔室阀724、至少一个腔室连接结构722、和至少一个收集容器725。以上关于图7a和7b讨论的特征件可具有相同特征件和/或功能中的一些或其任何组合。在该实施例中，所述至少一个腔室阀724起到控制流体从腔室720到收集区域725的流动的作用。
在图7d中示出的示例性装置包括图7c中示出的装置的所有特征件(标以相同的附图标记)、以及至少一个测量电极726、至少一个通道728及通道728的附属电极730a和730b。以上关于图7a、7b和7c讨论的特征件可具有相同特征件和/或功能中的一些或其任何组合。在一个实施例中，样品室720包含能构造成对装置内在样品室720中的溶液的pH进行监测的测量电极。在一个实施例中，该测量电极为能够是离子敏感场效应晶体管(ISFET)的集成元件。该测量电极能监测的其它示例性特征包括但不限于温度、溶解氧、以及溶解离子浓度(例如用于测量脱盐)。
该实施例还包括通道728。该通道728可以但不必须构造成进行毛细管电泳。与通道728相关的是其电极730a和730b。关于形成、利用和设计用于毛细管电泳的通道728的示例性方法和细节能在美国专利No.6,532,997中找到。
如在图7a、7b、7c和7d中见到的那样，本发明的装置还可包括起到将装置特征件相互连接的作用的连接结构。连接结构的实例包括但不限于隔室连接结构716和腔室连接结构722。一般地，通过将装置绕其中心轴线旋转而实现流体通过连接结构从一个特征件到另一特征件的传输。实现流体完全从装置的一个特征件传送到另一特征件所需的装置旋转速度可根据多种因素而改变，这些因素包括但不限于特征件的尺寸、特征件的几何形状、流体的粘性、溶液与基片之间的表面性质差异、连接结构中阀的类型(以下将讨论)、旋转的速度、加速度和时间、或这些因素的任何组合。
在本发明的一个实施例中，约2000转/分或更高、在一些实例中约3000转/分或更高、在一些实例中约4000转/分或更高的旋转速度可以用于将流体从一个特征件传输到另一特征件。流体传送所需的时间也将取决于以上讨论的相同因素中的一些因素以及旋转速度。在本发明的一个实施例中，能以1转/分的转速使装置旋转至少约0.1秒，而在另一实施例中，能以10,000转/分的转速旋转至少约600秒。在另一实施例中，能以20,000转/分的转速使装置旋转约3,600秒。
在图7e中示出了本发明装置的特征件的另一示例性实施例。图7e中的装置具有与图7d的特征件相同的特征件，但具有单独一个通道728。在一个实施例中，图7d中的装置对装置上的每个腔室720具有一个通道728。可替换地，图7e中示出的装置具有一个通道728，腔室720的所有腔室连接结构722通过通道连接结构729而连接到该通道728上。
图7f示出了本发明装置的另外又一个示例性实施例。图7f中的装置具有与图7b的装置相同的特征件，但还包括腔室阀724、腔室连接结构722、包括第一阀734和第二阀736的第二腔室732、容器连接结构738以及容器740。在一个实施例中，第二腔室732能起到提供反应孔的作用。在另一实施例中，第二腔室732能以与以上关于腔室720讨论的方式相同的方式而起作用。
在本发明的另一实施例中，多个腔室720能起到蛋白质消化孔的功能，在其中用胰蛋白酶将蛋白质样品消化而产生肽。在连接到第一腔室(未示出)的第二腔室732中，能将样品脱盐以备引入随后的分析步骤。
图7g示出了根据本发明的装置的另一示例性实施例。图7g中的特征件包括不通气通道710、第一样品隔室715、第二样品隔室717、样品连接结构713、以及第一样品孔712和半径较大的第二样品孔714。在本发明的一个实施例中，样品连接结构713小于约2毫米。具有通过样品连接结构713而连接到样品隔室715上的样品孔712的优点在于，样品孔712中的溶液在装置旋转时不会溢出到不通气通道的连接的隔室中。然而，从样品隔室715(和/或717)去掉样品孔可导致样品开始在样品连接结构713中分离。因此，在本发明的具有样品连接结构713的实施例中，能将样品连接结构713的长度视为这两个因素之间的折衷。
已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将理解到，实际上能在基片102中形成特征件的任何组合。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员也将理解到，能以任何组合的方式对包括但不限于图7a至7g中的任何附图中的特征件的任何组合进行组合。还应理解，如有需要，能在第一主表面、第二主表面或其一些组合上形成这些特征件。如果在第一和第二主表面上都形成特征件，则能通过形成进入基片深度足够连接这两个特征件的连接结构而实现那些特征件之间的连接。
尽管图7a至7i和图1a至1e中示出的不通气通道被表示为沿着弯曲、平直或角形路径的简单线，但应理解到，这些线的意图在于示出通道的总体结构或路径，但是通道的壁或侧面(即，内半径和/或外半径)仍然可以具有如上所讨论的锯齿状(参差不齐的)或蛇形形状，而且/或者通道可具有或可不具有隔室和窄点(即通道的宽度或横截面面积增加和减小的区域)。因此，即使通道作为整体沿着相对平滑的路径，但图7c至7i的不通气通道710以及图1a至1e的不通气通道110的侧面能具有例如在图4和图5a至5h中示出的形状的内半径和外半径。
阀系统
本发明的连接的隔室、腔室或连接结构可以包括但不必须包括一个或多个集成的阀结构。以上在图7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g、7h和7i中涉及这些阀结构。在图8和图9a中能看到集成阀结构的一个实例。在本发明的该实施例中的阀结构以唇缘140为形式，该唇缘140突出到如由壁141限定的由附图标记139表示的连接的隔室、腔室或连接结构(这里统称为“特征件”)的外围中(见图9a)，该壁141绕特征件139的整个外围以大体圆形形状延伸(在图8中以实线和虚(隐)线的组合示出特征件139的外围)。将理解到，其它的处理腔室可具有分解成如三角形、正方形等片断的侧壁。
特征件139的底表面143或覆盖膜120能够进一步限定特征件139的边界，该底表面143又能由基片102限定(如图9b所示)。如在例如图9a中看到的那样，唇缘140a以进入特征件139容积中的底切延伸件为形式。结果，特征件139容积的一部分位于唇缘140a和140b以及覆盖膜120之间。在图8和9a中示出的特定实施例在特征件139的两个侧面上具有阀结构。因此，特征件容积的一部分还位于唇缘140b和覆盖膜120之间。
连接结构137b的一部分延伸进入唇缘140b中，而连接结构137b的对置端位于下一个特征件139c内。在连接结构137b延伸到唇缘140b上时，薄区域142b相对于唇缘140b的其余部分形成有减小的厚度。特征件139的其中连接结构137a的一部分延伸到唇缘140a上的对置端上也形成类似的薄区域142a。
在唇缘140内或在由连接结构137b占有的薄区域142内设置开口时，特征件139a内的样品材料能移动进入连接结构137b中，以便输送给特征件139b。在唇缘140a和140b中没有开口时，唇缘140a和140b防止材料移动到特征件139a或139b中，这些唇缘140a和140b另外密封覆盖膜120，从而防止样品材料在这一情形下从特征件139a中流出。
能够由任何合适的一种或多种技术形成唇缘140中的开口。例如，唇缘140可由机械刺穿、用激光能烧蚀等形成。在其它的实施例中，可将阀结构结合在唇缘140中，从而在打开该阀结构时，材料能从特征件139a移动进入连接结构137b中。一些阀结构的实例可包括如在美国专利申请公开20020047003中描述的泡沫、形状记忆材料等。
唇缘140在由连接结构137b占有的区域142内的减小的厚度可提供许多优点。例如，它可限制唇缘140可容易刺穿或变形以提供所需开口的一个或多个位置，即唇缘140的围绕区域142的较厚部分可对任何可能用来形成穿过唇缘140的开口的技术带来的变形更具抵抗力。具有减小的厚度的区域142的另一潜在优点在于它能与例如其它的特征件和连接结构一起模制成基片102。
不管采用的阀结构的确切性质如何，具有如图8和9中示出的集成阀结构的特征件或连接结构的一个优点在于在特征件139a和阀之间不产生死区。换言之，位于特征件139a中的所有样品材料在处理过程中受到大致相同条件的影响。如果阀位于特征件139a的沿连接结构137b的下游，情况就可能不是如此。在这一情形下，位于特征件139a和阀之间的连接结构的容积内的任何样品材料在处理过程中可能经历不同的条件，而不是受同样的暴露于在处理特征件139a中的试剂或其它材料等。
通过利用至少用于覆盖膜120的能被激光刺穿的材料也能实现阀。在该装置的所需的一个或多个区域处引导激光将打开这种阀。在一个实施例中，给盘加载有吸收某波长的激光能的材料能形成这种阀。然后，仅向待“打开”的所需区域引导激光，该激光发射至少该波长的激光。在一个实施例中，基片能加载有能量吸收材料，而第一主表面和第二主表面上的覆盖膜没有加载。在将激光导向该装置的所需区域时，基片将让路允许流体进入另一特征件，而不允许流体脱离该装置。
能够采用已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的合适的能量吸收材料。实例包括加载碳或其它吸收材料如染料分子。在一个实施例中采用碳。
对于起到将样品从一个特征件传送到用于毛细管电泳的通道中的功能的连接结构来说，可能希望采用另一类型的阀系统。这些阀系统的实例能在US6,532,997中找到。
尽管这里示出了特定种类的阀，但是已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将意识到能代替示例性阀或收缩通路的许多其它装置或结构。这些替换物可包括但不限于多孔塞、多孔膜、曲折通路、表面的疏水性差异、气动或压电或机械操作的阀。
毛细管电泳接口
本发明的装置还可包括构造成与单独一个毛细管或毛细管阵列接口的注入口，从而通过毛细管电泳从装置传送一个或多个样品用于分离。
图10a、10b和10c示出了能结合到装置内的注入口600的示例性结构。该注入口设计成允许毛细管和电极刺穿覆盖注入口的薄膜并与已处理的样品溶液接触，从而能将等分量的溶液从装置中取出用于分析和/或进一步处理。这些注入口可位于例如允许通向装置的隔室或壁的位置，该隔室或壁又可与隔室连接结构616接触。
在图10a、10b和10c中示出的毛细管注入口600包括针空隙610、角形进入通道612和膜614。该针空隙610起到允许样品收集针(在图11中示出了其实例)通向容纳在装置中的已处理的样品的功能。针空隙610还能设计成允许任何常用的样品收集针与本发明的装置一起使用。
膜614起到密封毛细管注入口600直到针空隙610被接通的功能。在一个实施例中，膜614由与以上讨论的覆盖膜120相同类型的膜制成。在一个实施例中，膜614和覆盖膜120为同一个膜，即一片材料覆盖整个装置。在另一实施例中，膜614(而且也可替换地是覆盖膜120)由一旦样品针移走后就能够自身重新密封的膜制成。注入口600设计成具有角形进入通道612和放气槽口618，以在毛细管和电极刺穿膜614时允许空气从注入口600中逸出而不干扰溶液。
图11示出了示例性样品收集针700。该样品收集针700包括毛细管702和电极704。在一个实施例中，通过使用粘合剂706将毛细管702保持在电极704内。在一个实施例中，粘合剂706是环氧树脂。毛细管702可延伸超出电极704的端部之外，以避免在样品萃取和分离期间将气泡引入毛细管中。
在毛细管702被引入装置的注入口600之前，毛细管702可预加载有分离缓冲液。在毛细管和电极已经与已处理的样品溶液接触时，可通过电动注入将较小等分量的溶液引入到毛细管中。在将已处理的样品溶液注入到毛细管中之后，将样品收集针从装置移开，而膜重新密封。膜的重新密封特征使得装置和剩余的样品溶液能归档。在美国申请No.10/324,283或美国申请No.10/339,447中可找到这类示例性接口结构和构造的进一步的细节。
集成电极
本发明的装置还能包括集成电极。集成电极为具有其可松开地连接到基片上的至少一部分的电极。在一个实施例中，本发明的装置包括与不通气通道相连的集成电极。在这一实施例中，可以采用但不必须采用该不通气通道用于IEF。在不通气通道用于IEF的情形下，集成电极的一个优点在于它允许在从连接的隔室传送样品之前的对电极和/或装置的最小的使用者干预。最小的使用者干预能使样品的IEF分离和级份的传送之间的时间延迟最小，这又能使分析物在不通气通道的pH容器之间的扩散最小。这些连接电极的另一优点在于它们防止阳极电解液或阴极电解液在旋转过程中从装置排出。
本发明的装置还能包括与装置的其它特征件相连的集成电极。这些其它特征件的实例包括但不限于连接结构，在这些连接结构中，集成电极起到对连接结构内的或经过连接结构的溶液的pH或其它特性进行确定的作用；以及能用于毛细管电泳的通道。
在本发明的一个实施例中，集成电极通过螺纹可松开地连接到装置的基片802上。在图12a中能看到这一实施例的横截面的实例。集成电极800的该实施例包括第一部件804和第二部件806。该第一部件804通常为在两端开口并构造为放置成与基片802接触的圆柱体。第一部件804包括在第一部件804的外表面上的螺纹803。
第一部件804通常具有约1毫米至约10毫米的外径804a。在一个实施例中，第一部件804的外径804a约为3至5毫米。在另外又一实施例中，第一部件的外径804a约为4毫米。第一部件804的外径804a也决定基片802内的插入孔801的直径。在基片802内的插入孔801之下，空间可以但不必须变窄，从而第一部件804在基片802内具有壁架以搁在上面。还应理解，图12a中的基片802在波浪线所示下方连续，从而使得导电部分808将与装置特征件内的样品相连。
圆柱形第一部件804内部的内径为804b。一般地，内径804b为约0.5毫米至约9毫米。在一个实施例中，内径804b为约1毫米至约3毫米。在另外又一实施例中，内径804b约为2毫米。第一部件804的高度804c至少部分地由第二部件806的高度806c决定。
第二部件806包括盖809和导电件808，并且一般可以描述为配合在第一部件804上。第二部件806在盖809的内侧表面807上具有螺纹，该螺纹将第二部件806紧固到第一部件804上的合适位置。第二部件806的内径806a由第一部件804的外径804a决定。第二部件806的外径806b至少部分地由内径806a和盖809的厚度809a决定。在一个实施例中，盖809包括延伸件810，该延伸件810从盖809的主要部分向外延伸，并在装配集成电极800时搁在基片802的第一主表面799上。在这一实施例中，外径806b一般为约3毫米至约15毫米。在一个实施例中，该外径为约7毫米至约9毫米。在另外又一实施例中，该外径约为8毫米。第二部件的高度806c至少部分地由第一部件804的高度决定。一般地，第二部件806的高度806c为约1毫米至约10毫米。在一个实施例中，第二部件806的高度为约5毫米至约7毫米。在另外又一实施例中，第二部件806的高度约为6毫米。
第二部件806还包括导电件808。该导电件808一般在盖809的中心，并从盖809的顶部向盖809的基部向下延伸。导电件808的材料延伸穿过盖809的整体，从而在盖809的表面上能形成与导电件808的电接触。在一个实施例中，导电件808具有顶部811，该顶部811具有比导电件808的其余部分宽的直径。较宽的顶部811的功能在于更容易在导电件808与电源(未示出)之间形成电接触。导电件的长度可在确保与溶液良好接触的较长导电件与较为坚固的较短导电件之间折衷。在一个实施例中，导电件808延伸到盖809的基部。
在一个实施例中，第二部件809还包括O形环812。该O形环812起到在804与806之间产生密封的功能。一般地，O形环812的尺寸至少部分地由第一部件804和第二部件806的总体尺寸决定。在一个实施例中，O形环812具有2毫米的内径并为1毫米宽。在另一实施例中，能采用橡胶、硅橡胶垫圈、或高粘度油来在804与806之间产生密封。
在一个实施例中，第二部件806还包括气孔813。该气孔813起到防止集成电极800内的样品破坏的功能，在将第二部件806紧固到第一部件804上的合适位置时，压力的增加可能导致这一破坏。气孔813还起到允许将可能在导电件808处形成的气体释放的功能。在一个实施例中，气孔的直径小于1毫米，并设计成不干涉O形环。
在本发明的另一实施例中，集成电极通过插脚和插槽机构可松开地连接到装置的基片802上。在图12b(分离构件的横截面图)和图12c(装配的电极的横截面图)中能见到这一实施例的实例。集成电极800的该实施例包括第一部件804和第二部件806。该第一部件804通常为在两端开口且构造为放置成与基片102接触的圆柱体。第一部件804包括在第一部件804的外表面上的与插槽814匹配的插脚803。
在一个实施例中，第一部件804和第二部件806的盖809由相同的材料制成，而在另一实施例中，第一部件804和第二部件806的盖809由不同的材料制成。能采用已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的任何适于制造第一部件804和第二部件806的盖809的材料。这些材料的实例包括但不限于聚烯烃、聚丙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(来自杜邦的特氟纶)、聚硅氧烷或它们的组合。在一个实施例中，第一部件804和第二部件806的盖809由聚丙烯制成。能由本领域内熟练技术人员已知的任何合适方法制作第一部件804和第二部件的盖809。这些方法的实例包括但不限于例如注模和显微机械加工。在一个实施例中，第一部件804和盖809通过注模制作。
能够由本领域内熟练技术人员已知的适于制造电极的任何材料制成导电材料808。这些材料的实例包括铂、金、铜、或合金。在一个实施例中，导电材料808由铂制成。能通过本领域内熟练技术人员已知的任何合适方法制作导电材料808。这些方法的实例包括但不限于拉丝、金属铸造或焊接分立部件。在一个实施例中，导电材料808是通过将金属丝焊接到电极板上而制作的。可以在盖809内制作导电材料808，或者可以在盖809外部制作导电材料808并在制作之后将导电材料808放置在盖内。在任何情形下，能将导电材料808简单地放置在盖809内，或能将其固定在盖809内。如果导电材料808要固定在盖809内，可将导电材料808粘附到盖809上。能用于将导电材料808粘附到盖809上的粘合剂的实例包括但不限于环氧树脂。在一个实施例中，通过环氧树脂将导电材料808粘附到盖809上。
在本发明的一个实施例中，集成电极连接到装置的基片902上。在图13a中能见到这一实施例的实例。集成电极904的这一实施例包括结合到装置内的电极。在接触点915处能实现与电极904的接触，这些接触点915都在装置的边缘处，来自装置的顶侧或来自装置的侧面。电极904的一端构造成与电极孔912内的溶液接触。
在电极孔912充有溶液之后，可用多孔材料916覆盖电极孔912。该多孔材料916通过粘合剂921而连接到装置上。多孔材料916起到允许由水的电解在电极孔912内形成的电解气逸出的作用。多孔材料916还防止溶液在旋转过程中从装置排出。一般地，多孔材料916是疏水的。这些材料的实例包括但不限于膜、非织物、以及陶瓷。在一个实施例中，多孔材料916由聚丙烯通过热致相分离(TIPS)过程制造而制成。
在本发明的一个实施例中，集成电极904安置在装置的覆盖膜920上。在图13b中能看到这一实施例的实例。在位于装置的顶侧处的接触点915处能实现与电极904的接触。电极904的一端构造成与电极孔912内的溶液接触。
在图13c中可看到集成电极的另一实施例。该实施例允许穿过装置的底部而形成接触，将通过用电极材料封入覆盖膜920内的通孔而形成电极904。这然后将提供用于从装置平台到装置的电连续性的装置。
电极904通常例如由导电材料例如铂、金、铜或合金的薄膜制成。在一个实施例中，电极904为金。能由蒸汽沉积、真空沉积、金属溅镀、导电材料(墨)印刷或已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员已知的任何其它方法形成导电迹线。在一个实施例中，电极由蒸汽沉积制造。
在本发明的一个实施例中，将电极集成到能在其上使用该装置的旋转平台中。在图14中能看到这一实施例的实例。穿过能在其上旋转该装置的平台930能实现与电极934的接触。在一个实施例中，平台930具有维持旋转系统中电流的水银接合点。还能通过平台的下侧而形成接触。在穿过装置底部形成接触的电极构造中，电极934的上端935构造成与电极孔912内的溶液接触。
电极934可以为例如铂、金、铜或合金的细金属丝。在一个实施例中，电极934为铂。电极934还能是可刺穿粘附到装置上的覆盖膜920的插脚。在装置从平台930移开时，覆盖膜120能重新密封，从而防止溶液脱离盘。
本发明装置的控制系统
本发明的装置能与用于对装置和装置存在的状况进行控制的系统结合使用。这些系统的实例包括但不限于个人电脑(pc)控制的基部，用于对装置的旋转进行控制；冷却系统，用于对整个装置或装置的所选部分进行冷却；加热系统，用于对整个装置或装置的所选部分进行加热；激光系统，用于打开阀；以及电极接触/连接系统。
能用于控制装置的系统的一个实例为pc控制的基部，该基部用于对装置的旋转进行控制。在一个实施例中，采用pc通过外部驱动器和无刷电动马达上的光学编码器来控制该马达的旋转。与盘接口的平台连接到马达的驱动轴上。pc对马达运动的位置、速度、加速度和时间进行控制，并从而对盘进行控制。
用于对整个装置或装置的所选部分进行冷却的冷却系统的一个实例包括与pc控制的基部相连的由具有较高导热性的材料制成的环。这些材料的实例包括但不限于铝、铜和金。在一个实施例中，铝环能够例如构造成位于整个装置之下，而在另一实施例中，铝环可构造成只位于装置的一部分之下。在本发明的将不通气通道用于IEF的实施例中，一般将铝环构造成至少位于不通气通道之下。这一构造起到减小焦耳加热效应的作用。铝环通过自身冷却并接着从装置吸收热从而使装置的与铝环接触的部分冷却。一种使铝环冷却的方法包括将已冷却的空气吹到环上。也可通过采用非空气的气体和珀尔帖冷却系统进行冷却。
用来对整个装置或装置的所选部分进行加热的加热系统的一个实例包括在WO 02/00347中找到的那些实例。
在本发明的一个实施例中，还能采用机械系统来控制电极接触/连接系统。电极连接系统向装置提供电势，或者向装置的顶表面或底表面提供电势。能够机械地降低与顶表面接口的电源电极，使之与在装置顶表面上的集成电极接触。在试验结束时，能够机械地升高电极。电源电极能通过旋转平台与装置接口。通过平台与马达之间的水银连接对平台供电。平台的特征在于与装置直接接触的电极。以上已经描述了集成电极构造的实例。
使用本发明装置的方法
构造装置的特定应用至少部分地决定使用本发明装置的具体方法。
在装置构造成用于蛋白质样品的IEF的实施例中，使用本发明装置的一个示例性方法如下。将蛋白质样品加载到不通气通道的第一样品孔中。然后允许或迫使样品进入IEF通道，直到样品到达另一室。然后在其中一个室中加入阳极电解液溶液，而在另一室中加入阴极电解液溶液。在加载样品和溶液后，电极(带有阳极电解液的阳极和带有阴极电解液的阴极)就与样品孔内的溶液接触。可替换地，可以将装置放置在平台上，并如描述的那样加载样品。将阳极电解液加载到阳极孔中，而将阴极电解液加载到阴极室中。然后用多孔膜覆盖这些室，并用粘合剂将这些室保持在合适的位置。然后对电极接通电源并施加电压。一直施加电压，直到电流减小并达到稳态值。然后使装置旋转，从而使蛋白质级份从不通气通道的连接的隔室通过所述多个隔室连接结构而传送到所述多个腔室中。然后能利用本领域内熟练技术人员已知的能应用于蛋白质级份的任何技术对腔室内的蛋白质级份进行进一步分析。
在装置包括集成电极的实施例中，使电极与溶液接触的步骤将包括将集成电极的第二部件紧固到集成电极的第一部件上，从而确保导电材料与样品孔内的溶液接触。
在装置构造成用于蛋白质样品的IEF和随后处理的实施例中，示例性方法包括用于IEF方法的以上步骤，这些步骤之后还有以下步骤。蛋白质级份一旦在腔室中，就可进行随后处理。如果随后处理是蛋白质的变性，就对能预先充有试剂的所述多个腔室进行加热。然后能从装置中取出变性的蛋白质以进行进一步的分析。
在另一实施例中，在使蛋白质变性的同时可以对蛋白质进行标记，以便于随后的探测。在这一实施例中，步骤与以上讨论的一样，但腔室中容纳的试剂包括标记试剂以及变性试剂。
在另外又一实施例中，还能在本发明的装置上进行在蛋白质变性和标记之后的分析如毛细管电泳。在蛋白质变性和标记之后，打开所述多个腔室连接结构中的阀。然后使装置旋转，从而将变性的、标记的蛋白质传送到毛细管电泳通道中。然后将电极与毛细管电泳通道和电源连接。然后能利用激光诱导荧光探测分离的蛋白质。
在另一实施例中，能通过质谱分析进一步对通过毛细管电泳分离的蛋白质进行分析。
在另一实施例中，已经由IEF在不通气通道内分离的样品能在腔室或容器中经受胰蛋白酶化作用。可替换地，消化的样品也可脱盐。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员将知道这些步骤、反应条件、和进行这些步骤所需的试剂。
在另一实施例中，样品能在任何时刻从装置中取出，并传送以进行其它分析，例如毛细管电泳(脱离装置的)、液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及质谱分析。本发明的装置可以但不必须构造成用于样品的自动传送。
本发明的一个实施例包括进行蛋白质样品等电聚焦的方法，该方法包括将包含蛋白质的样品加载到本发明装置的第一样品孔内；允许或迫使样品进入不通气通道，直到样品到达第二样品孔；将阳极电解液溶液加入到第一样品孔中；将阴极电解液溶液加入到第二样品孔中；使装置的集成电极与样品孔内的溶液接触；以及对电极施加电压。可替换地，能够在对电极施加电压之前或之后用多孔膜覆盖第一和第二样品孔。
本发明的另一个实施例包括进行蛋白质样品等电聚焦的方法，该方法包括将包含蛋白质的样品加载到本发明装置的第一样品孔内；允许或迫使样品进入不通气通道，直到样品到达第二样品孔；将阳极电解液溶液加入到第一样品孔中；将阴极电解液溶液加入到第二样品孔中；使装置的集成电极与样品孔内的溶液接触；对电极施加电压；用多孔膜覆盖第一和第二样品孔(在对电极施加电压之前或之后)；以及使装置旋转，以将蛋白质级份从不通气通道的连接的隔室传送到腔室。可以如以上所讨论的转速和时间量旋转装置。
本发明的另一实施例包括用于在样品上进行等电聚焦并对分级后的样品进行随后处理的方法，该方法包括将包含蛋白质的样品加载到本发明装置的第一样品孔内；允许或迫使样品进入不通气通道，直到样品到达第二样品孔；将阳极电解液溶液加入到第一样品孔中；将阴极电解液溶液加入到第二样品孔中；使装置的集成电极与样品孔内的溶液接触；对电极施加电压；用多孔膜覆盖第一和第二样品孔(在对电极施加电压之前或之后)；使装置旋转，以将蛋白质级份从不通气通道的连接的隔室传送到腔室；以及对预先充有能使蛋白质变性的试剂的腔室进行加热，以使蛋白质变性。另一实施例包括在蛋白质正被变性的相同或不同腔室内对蛋白质进行标记。可替换地，蛋白质能够在第一腔室或随后的腔室中经受胰蛋白酶化作用。已经经受胰蛋白酶化作用的蛋白质样品还能随后脱盐。
另一实施例包括用于对包含蛋白质的样品进行等电聚焦、处理和毛细管电泳的方法，该方法包括将包含蛋白质的样品加载到本发明装置的第一样品孔内；允许或迫使样品进入不通气通道，直到样品到达第二样品孔；将阳极电解液溶液加入到第一样品孔中；将阴极电解液溶液加入到第二样品孔中；使装置的集成电极与样品孔内的溶液接触；对电极施加电压；用多孔膜覆盖第一和第二样品孔(在对电极施加电压之前或之后)；使装置旋转，以将蛋白质级份从不通气通道的连接的隔室传送到腔室；以及使蛋白质级份在腔室中反应，从而使它们变性以及对它们进行标记；将装置内的腔室连接结构内的阀打开；使装置旋转，从而将变性的、标记的蛋白质传送到毛细管电泳通道中；以及将电极连接到毛细管电泳通道电极和电源上。能够利用许多技术，包括激光诱导荧光或质谱分析，对由毛细管电泳分离的变性的、标记的蛋白质级份进行探测。
根据已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员的知识，能够对以上方法中的任何方法或用于使用本发明装置的其它设想方法进行改进，例如，在处理过程中的任何时刻能将样品取出，以进行其它脱离装置的分析，例如毛细管电泳(脱离装置的)、液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及质谱分析。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员还将理解到，实际上能在本发明的方法中采用以上关于装置所讨论的装置特征件的任何组合。已经阅读本说明书的本领域内熟练技术人员还将理解到，在最终使用者获得装置之前可以将许多试剂或溶液加载到本发明的装置中，而且本领域内熟练技术人员将理解到这将相应地改变方法步骤。
实例
所有的化学制品都从Aldrich(密尔沃基，威斯康星)获得，而且除非另有说明，使用这些化学制品无需进一步净化。
实例1通过包括集成电极的本发明装置与通过市场上可买到的系统进行IEF分离的比较
制作根据本发明的、构造成进行IEF的装置，并将该装置与标准系统进行比较。
基片由聚丙烯制作成，而且在第一主表面上通过压敏粘合剂用由聚烯烃制成的覆盖膜将基片密封。在图15中能见到该装置的构造。在图15中，311代表用于绕中心轴线旋转的轴心，310代表构造成用于IEF的不通气通道，312代表第一样品孔，314代表第二样品孔，340代表多个隔室连接结构中的一个隔室连接结构，而344代表多个腔室中的一个腔室。
用于IEF的不通气通道的弧长约为100毫米，而且具有20个连接的隔室。这些连接的隔室中前缘和后缘的角度约为10°。这些连接的隔室的容积约为5微升。这些连接的隔室的前缘和后缘角度被认为使得不通气通道内的流体惯量最小。
装置放置在构造成使装置旋转的基部上，而且装置由PC控制。对基部加入冷却能力，以减小与焦耳加热相关的温度效应。温度受控的空气通过空气管路引入，并在装置的下侧处导向铝环。装置和基部构造成使得铝环直接位于不通气通道之下。
装置还包括集成电极。第一部件咬入并压配合到那些样品孔中的一个样品孔内，并起到流体储备池的作用。第一部件在第一部件的外侧上具有螺纹，第二部件紧固到该螺纹上的适当位置处。第二部件在第二部件的中心处容纳作为导电材料的Pt，并覆盖样品储备池。Pt穿过盖延伸到导电触控垫。通过触控垫和Pt形成从电源到溶液的电接触。盖还具有通气孔以防止对室内流体的破坏，当盖紧固在合适位置时，压力的增加将导致这一破坏。
使细胞色素C、肌红蛋白、人血清白蛋白(HSA)和藻青蛋白(Sigma，圣路易斯，MO)的4蛋白质样品溶解在2.5％的BioRad 3-10两性电解质(pH 3-10)(目录#163-1113)(Bio-Rad，Hercules，CA)、20mM辛基吡喃葡萄糖苷(OGP)(Alexis公司，Lausen，瑞士)、6.0M尿素溶液和去离子H2O中，从而得到每种蛋白质的最终浓度为4毫克/毫升的溶液。阳极电解液为0.3M的H3PO4，而阴极电解液为0.3M的NaOH。
两性电解质分子是侧基为不同pKa值的丙烯酰胺低聚物，并在溶液中形成阳极电解液与阴极电解液之间的pH梯度。仔细地将蛋白质-两性电解质样品溶液充入不通气通道，确保不形成气泡。第一(阳极)样品孔充有低pH阳极电解液溶液，而第二(阴极)样品孔充有高pH阴极电解液溶液。
然后将集成电极紧固在样品孔内，确保Pt和溶液之间的接触。然后将来自高压电源的电极放置成与Pt电极触控垫接触。施加电压，并对焦耳加热产生的电流和温度进行监测。采用的电场强度为200V/cm。电流在蛋白质样品聚焦过程中减小，这是由于溶液中带电部分数量减小了。观察到电流在蛋白质IEF完成时达到稳态值。IEF设备达到稳态通常所花的时间取决于每种蛋白质的电泳淌度，蛋白质的电泳淌度又取决于温度、溶液粘度和电场强度。在这一实例中，向溶液施加电场约45分钟。
在蛋白质IEF之后，使平台上的装置以5000转/分的转速旋转约10秒，加速度约为100rad.s-2。离心力确保通道内溶液上的均匀压力，从而确保来自IEF容器的在相同半径处的均匀的流动传送。通过不通气通道的锯齿状设计，使得由不通气通道内的隔室形成的相邻pH容器之间的扩散最小。
采用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)对来自pH容器的蛋白质样品进行分子量分离。装置离心作用后，收集二十个蛋白质级份，并准备按照标准试验方案用Agilent生物分析仪进行分析。这二十个级份放置在两个生物分析仪Labchip(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)上的相应样品孔内，然后这些级份被单独加载并在分析单元上运行。对每个蛋白质级份收集电泳谱图。图16a和16b示出了采用Agilent生物分析仪软件将电泳谱图转化而生成的图像。第一泳道代表用于校准设备的标准蛋白梯，而随后的泳道代表pH增加的20个蛋白质级份。在下面的表1中示出的理论的蛋白质pI和Mw用于分派4蛋白质标准的实际二维凝胶图像中的蛋白质。
表1
为了比较的目的，将二十个容器中的蛋白质组成直接与BioRadRotoforTM(Bio-Rad，Hercules，CA)系统的输出进行比较。BioRadRotoforTM是市场上可买到的设备，其用来进行复合蛋白质混合物的较大规模IEF。在这些试验中，如上述那样制备蛋白质样品、阳极电解液以及阴极电解液溶液。
与380微升的Bio-Rad的两性电解质3-10(2.0％)和95微升的Serva的两性电解质9-11(0.5％)(Serva，海德堡，德国)一起加载0.4毫克每(100微升)的藻青蛋白、HSA、肌红蛋白和细胞色素C。用含有0.1％ OGP的8.0M的尿素将该溶液变为19毫升。电解液为0.3M的NaOH和H3PO4。Rotofor运行四个小时，而电压在3个小时后在3000V达到高峰水平。采集级份，并立即测量pH和容积。从每个级份中取出等量的溶液用于SDS-PAGE分析。
图17a和17b中的凝胶图像代表来自Rotofor运行的20个级份，其中从20个级份中的每个级份中取出固定量的样品，并使之在SDS-PAGE凝胶上运行，然后用考马斯蓝(Bio-Rad，Hercules，CA)染色。如这里示出的那样，已知藻青蛋白在凝胶上分离时分为三个谱带，而肌红蛋白分为两个谱带。HSA的复杂性质表现为除了形成“厚的”谱带之外，在其正下方通常有另一谱带。凝胶图像表明这四种蛋白质正根据它们的等电点进行分离。在以下的表2中能看到这二十个级份的细节。
表2
在以下的表3中示出了蛋白质分离系统和BioRad RotoforTM之间的蛋白质组成的比较。如在表中见到的那样，分离是可比的。大体上，比较凝胶图像和蛋白质位置，这两个系统产生对四种蛋白质样品的类似分离。
表3
实例2使用本发明的装置
用于蛋白质变性和脱离装置的毛细管电泳
制作根据本发明的装置，该装置构造成进行等电聚焦、随后的蛋白质变性，并构造成与毛细管电泳接口，而且对在装置中使蛋白质变性的可行性进行研究。
基片由聚丙烯制作成，而且在第一主表面上通过压敏粘合剂用由聚烯烃制成的覆盖膜将基片密封。在图18中能见到该装置的结构。在图18中，411代表用于绕中心轴线旋转的轴心，410代表构造成用于等电聚焦的不通气通道，412代表第一样品孔，414代表第二样品孔，440代表多个隔室连接结构中的一个隔室连接结构，444代表多个变性腔室中的一个变性腔室，446代表多个变性腔室连接结构中的一个变性腔室连接结构，而448代表多个收集腔室中的一个收集腔室。
变性腔室包括对流体从隔室连接结构到变性腔室的流动以及从变性腔室到变性腔室连接结构的流动进行控制的阀。通过激光能撞击到该装置上而使这些阀运行。由装置的加碳覆盖膜和基片吸收激光能，从而允许流体从容纳流体的容积传递到下一个连接容积。
该装置构造成用于通过美国专利No.6,532,997中公开的方法加热。
使三蛋白质样品(细胞色素c、β-乳球蛋白、淀粉葡萄糖苷酶)溶解在20mM的辛基吡喃葡萄糖苷溶液中，从而对每种蛋白质得到最终浓度为2毫克/毫升。辛基吡喃葡萄糖苷为非变性表面活性剂，它有助于蛋白质溶解，同时使蛋白质维持原电荷。
采用来自Agilent 2100生物分析仪的样品制备缓冲液作为变性溶液。该缓冲液含有十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂和二硫苏糖醇。溶液还包含用于校准和分析样品电泳谱图的下标志和上标志。
三蛋白质样品与变性化学物结合并经受三种不同条件。第一样品在离心管中在室温下保持5分钟，第二样品在离心管中加热到95℃下5分钟(标准试验方案)，而第三样品在上述装置的变性腔室中加热到95℃。
采用Agilent 2100生物分析仪对样品进行收集与分析，从而测量变性的蛋白质的量。蛋白质变性的程度由蛋白质峰值的荧光强度决定。完全变性的蛋白质样品将提供尖锐而强烈的峰值，而变性较差的样品导致相对较小的宽峰值。在图19a、19b和19c中给出了样品分析的结果。
图19中的每种凝胶包括标准蛋白梯(泳道1、4、7、10)，变性溶液(泳道2、5、8、11)和三蛋白质溶液(泳道3、6、9)。图19a为在室温下5分钟的样品的凝胶，图19b为在95℃下5分钟的样品的凝胶，而图19c为在上述装置上在95℃下5分钟的样品的凝胶。
如图19a、19b和19c中的图像示出的那样，采用本发明的装置和加热技术来使蛋白质样品变性是可行的。标准试验方案以及采用本发明装置的淀粉葡萄糖苷酶峰值的相对强度是相当的，并明显比室温条件下的峰值大。
图20示出了来自本装置以及标准试验方案的变性的淀粉葡萄糖苷酶的相对浓度。从本装置恢复的蛋白质量与标准试验方案相当。这一试验证实了本装置制备用于通过毛细管电泳进行大小分离的蛋白质样品的可行性。
采用与以上相同的条件来确定蛋白质完全变性所需的时间。将四个单独的蛋白质样品加载到装置的变性腔室中，并在95℃加热1、3、5和10分钟。在图21中可见到四个样品的电泳谱图(荧光对迁移)。如在图中能见到的那样，蛋白质在5分钟后完全变性，而且对样品加热更多的时间并不增加变性的蛋白质的量。
实例3使用本发明的装置用于IEF分离和脱离装置的毛细管电泳以及MS分析
制作根据本发明的装置，该装置构造成进行IEF，并构造成与脱离装置的毛细管电泳接口。
基片由聚丙烯制作成，而且在第一主表面上通过压敏粘合剂用由聚烯烃制成的覆盖膜将基片密封。
装置放置在基部上，该基部构造成如在以上的实例1中讨论的那样用于旋转速度的pc控制和用于冷却的控制。
使5蛋白质样品(细胞色素C、肌红蛋白、泛素、人血清白蛋白、以及藻青蛋白)溶解在3％的Bio-Rad两性电解质(目录#163-1113)以及20mM辛基吡喃葡萄糖苷溶液中(以使每种蛋白质的最终浓度为4毫克/毫升)。向150微升的蛋白质储备溶液中加入50微升的12％Biolyte 3-10两性电解质、以及聚环氧乙烷(PEO，2％wt)，以得到最终的蛋白质试验溶液。PEO也用来使蛋白质的非特异性结合最小，并用来通过与微通道表面缔合而控制电渗流。由于后者，电极处电解产生的气泡逸流进入IEF通道的可能性最小化。阳极电解液和阴极电解液分别为0.02M的H3PO4和0.04M的NaOH。
在装置最里面的圆形锯齿通道内进行蛋白质样品的IEF。两性电解质分子是侧基为不同pKa值的丙烯酰胺低聚物，它们在溶液中形成阳极电解液与阴极电解液之间的pH梯度。仔细地将蛋白质-两性电解质样品溶液充入通道，确保不形成气泡。阳极样品孔(第一样品孔)充有高pH阴极电解液溶液。然后将Pt电极放置在样品孔内，从而确保与溶液的接触。
然后施加电压，并对焦耳加热产生的电流和温度进行监测。在图19中能见到温度和电流迹线。采用的电场强度约为100V/cm。电流在蛋白质样品等电聚焦过程中减小，这是由于溶液中携带电荷的带电粒种的数量减小了。观察到电流在蛋白质IEF完成时达到稳态值。IEF试验达到稳态所花的时间取决于这些蛋白质的电泳淌度，蛋白质的电泳淌度又取决于溶液粘度和电场强度。在这一实例中，向溶液施加电场30分钟。
在蛋白质等电聚焦后，通过离心传输而将单独容器内的蛋白质样品传输到收集腔室中。分离装置放置在对盘的位置和旋转速度进行控制的基部上。装置以5000转/分的转速旋转10秒，加速度为100rad.s-2，从而将样品从IEF通道容器传输到收集腔室。离心力确保均匀的压头，并从而确保来自IEF容器的在相同半径处的均匀的流动传送。通过不通气通道的锯齿状设计，使得相邻pH容器之间的扩散最小。
采用Agilent 2100生物分析仪对蛋白质样品进行分子量分离。在盘的离心作用后，收集十个蛋白质级份，并准备按照Agilent提供的标准试验方案进行分析。将十个级份放置在生物分析仪Labchip的相应样品孔内，然后这些级份被加载到分析单元中。
对每个蛋白质级份收集电泳谱图，而且在图22中以二维实际凝胶示出这些电泳谱图。第一泳道代表用于校准随后电泳谱图的标准蛋白梯，而随后的泳道代表pH增加的蛋白质级份。在以下表4中给出用于分派蛋白质的理论的蛋白质pI和Mw。
表4
分离的蛋白质级份经受基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分析。在图23a至23d中可看到光谱。图23a示出F1(级份1)中藻青蛋白和HAS的峰值，图23b示出了F4中的泛素，图23c示出了F6中的肌红蛋白，而图23d为F10中的细胞色素C。为了进一步确定这些蛋白质的特征，用胰蛋白酶进行蛋白酶解。图24示出了图23中的IEF级份的MALDI肽指纹谱(m/z 700-4,000)。蛋白质数据库检索结果(Protein Prospector，UCSF Mass Spec Facility，http//prospector.ucsf.edu)确认F1含有HSA、F6肌红蛋白和F10细胞色素。然而这些检索结果没有在F1消化中探测到藻青蛋白肽，而F4的结果没有为泛素提供确凿的匹配。
实例4根据本发明的装置以及使用该装置用于IEF、变性、标记和脱离装置的毛细管电泳
基片将由聚丙烯制作成，而且同时在第一主表面和第二主表面上通过压敏粘合剂用由聚烯烃制成的覆盖膜将基片密封。将铝环放置在装置上变性容器之下。聚丙烯将是加碳的，以起到阀系统的功能。该装置将由显微机械加工而制作成。
用于IEF的不通气通道的圆弧长度将约为100毫米，并具有95个连接的隔室。这些连接的隔室的前缘角度和后缘角度约为60°。这些连接的隔室的容积约为0.75微升。将采用附加的隔室以储存还可能在盘上被毛细管电泳分离的蛋白梯。蛋白梯溶液可以含有变性化学物。
将使蛋白质样品溶解在具有约3％的Bio-Rad两性电解质(目录#163-1113)的10-50％的甘油/H2O溶液中。最终的蛋白质浓度应该约为5毫克/毫升。阳极电解液溶液为pH2的H3PO4溶液，而阴极电解液溶液为pH11的NaOH。
不通气通道将充有100微升的蛋白质-两性电解质溶液。将以使泡沫形成最小的方式对通道进行充注。第一样品孔将充有低pH阳极电解液溶液，而第二样品孔将充有高pH阴极电解液溶液。
然后将铂电极放置到第一样品孔和第二样品孔中，以确保与溶液接触。将施加约100V/cm的电压。将对焦耳加热产生的电流和温度进行全程监测。在蛋白质样品的聚焦过程中，电流将可能减小，而且将被观察到达到稳态值，这表明聚焦完成了。
装置将被放置在对装置的位置和旋转速度进行控制的旋转平台上。装置将以5000转/分的转速旋转10秒，加速度为100rad.s-2。然后将通过激光打开隔室连接结构内的阀。然后连接的隔室中的已聚焦的蛋白质样品将被旋转输出到腔室中。
这一装置中的腔室将预先充有用于使蛋白质变性的试剂。腔室含有β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，用于使蛋白质间硫键断裂；含水SDS溶液，用于使蛋白质变性和溶解；以及荧光染料，该荧光染料使蛋白质衍化或与SDS微团(NanoOrange，Molecular probes，Eugene；或Abs/Em470/570nm)缔合。腔室还将含有能用来按比例确定作为结果而产生的电泳谱图的下标志和上标志蛋白质，从而使得直接样品比较成为可能。
一旦打开隔室连接结构内的阀，将采用WO 02/100347中描述的光环技术将溶液加热到95℃约5分钟，以确保蛋白质样品的完全变性。在加热过程中，在容积方面，腔室内样品的容积将减小，这将起到增加蛋白质浓度的作用，从而增强对低浓度蛋白质的探测。腔室244还包括测量溶液pH的电极。
然后将用红外线(IR)激光打开腔室连接结构内的阀。然后装置将以5000转/分的转速旋转10秒，加速度约为100rad.s-2，以确保腔室和毛细管电泳通道之间的流体互连。
电泳毛细管将预先充有聚(环氧乙烷)-聚醚F-127缓冲液溶液。聚(环氧乙烷)起到分离基质和表面涂层的作用，从而减小蛋白质非特异性结合到毛细管壁上的可能性，并减小电渗流。聚醚表面活性剂增强了表面亲水性，并为聚(环氧乙烷)提供具有吸引力的表面使聚(环氧乙烷)动态地涂布在该表面上。运行缓冲液为pH为8.6的TrisHCL-SDS。
毛细管电泳毛细管阵列然后将与装置接口。
通过电动注入将样品加载到毛细管中，从而输送非常细的圆柱状样品。通过使装置旋转而使单独的毛细管通道与激光诱导荧光激励探测系统对准，从而采用激光诱导荧光(LIF)作为探测机构。
实例5根据本发明的装置以及使用该装置用于IEF、变性、标记和装置上的毛细管电泳
制作根据本发明的装置，该装置构造成进行IEF、样品制备以及毛细管电泳。
基片将由聚丙烯制作成，而且同时在第一主表面和第二主表面上通过压敏粘合剂用由聚烯烃制成的覆盖膜将基片密封。将铝环放置在装置上变性容器之下。聚丙烯将是加碳的，以起到阀系统的功能。该装置将由显微机械加工而制作成。在图25中能见到该装置的结构。在图25中，211代表用于绕中心轴线旋转的轴心，210代表构造成用于等电聚焦的不通气通道，212代表第一样品孔，214代表第二样品孔，240代表多个隔室连接结构中的一个隔室连接结构，而242代表特定隔室连接结构内的阀系统，244代表多个腔室中包括电极的一个腔室，246代表多个腔室连接结构中的一个腔室连接结构，而248代表特定腔室连接结构内的阀系统，250代表电极，254代表电泳通道，而且252和256代表与特定电泳通道相关的电极。
用于IEF的不通气通道的圆弧长度将约为100毫米，并具有95个连接的隔室。这些连接的隔室的前缘角度和后缘角度约为60°。这些连接的隔室的容积约为0.75微升。将采用附加的隔室以储存还可能在盘上被毛细管电泳分离的蛋白梯。蛋白梯溶液可以含有变性化学物。
将使蛋白质样品溶解在具有约3％的Bio-Rad两性电解质(目录#163-1113)的10-50％的甘油/H2O溶液中。最终的蛋白质浓度应该约为5毫克/毫升。阳极电解液溶液为pH2的H3PO4溶液，而阴极电解液溶液为pH11的NaOH。
不通气通道将充有100微升的蛋白质-两性电解质溶液。将以使泡沫形成最小的方式对通道进行充注。第一样品孔将充有低pH阳极电解液溶液，而第二样品孔将充有高pH阴极电解液溶液。
然后将铂电极放置到第一样品孔和第二样品孔中，以确保与溶液接触。将施加约100V/cm的电压。将对焦耳加热产生的电流和温度进行全程监测。在蛋白质样品的聚焦过程中，电流将可能减小，而且将被观察到达到稳态值，这表明聚焦完成了。
装置将被放置在对装置的位置和旋转速度进行控制的旋转平台上。装置将以5000转/分的转速旋转10秒，加速度为100rad.s-2。然后将通过激光打开隔室连接结构内的阀。然后连接的隔室中的已聚焦的蛋白质样品将被旋转输出至腔室中。
这一装置中的腔室将预先充有用于使蛋白质变性的试剂。腔室含有β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，用于使蛋白质间硫键断裂；含水SDS溶液，用于使蛋白质变性和溶解；以及荧光染料，该荧光染料使蛋白质衍化或与SDS微团(NanoOrange，Molecular probes，Eugene；或Abs/Em470/570nm)缔合。腔室还将含有能用来按比例确定作为结果而产生的电泳谱图的下标志和上标志蛋白质，从而使得直接样品比较成为可能。
一旦打开隔室连接结构内的阀，将采用WO 02/100347中描述的光环技术将溶液加热到95℃约5分钟，以确保蛋白质样品的完全变性。在加热过程中，在容积方面，腔室内样品的容积将减小，这将起到增加蛋白质浓度的作用，从而增强对低浓度蛋白质的探测。腔室244还包括测量溶液pH的电极。
然后将用红外线(IR)激光打开腔室连接结构内的阀。然后装置将以5000转/分的转速旋转10秒，加速度约为100rad.s-2，以确保腔室和毛细管电泳通道之间的流体互连。
电泳毛细管将预先充有电泳分离缓冲液，例如聚(环氧乙烷)-聚醚F-127缓冲液溶液。聚(环氧乙烷)起到分离基质和表面涂层的作用，从而减小蛋白质非特异性结合到毛细管壁上的可能性，并减小电渗流。聚醚表面活性剂增强了表面亲水性，并为聚(环氧乙烷)提供具有吸引力的表面使聚(环氧乙烷)动态地涂布在该表面上。运行缓冲液为pH为8.6的TrisHCL-SDS。
毛细管电泳通道将约为50微米宽、50微米深和70毫米长。
通过筛选基质，即1％wt的聚环氧乙烷溶液(Mw 100,000)而防止样品进入毛细管电泳通道。然后通过电动交叉注入将样品加载到毛细管通道中，从而输送高度浓缩的但非常细的圆柱状样品。这样确保在较短的分离长度上的高分离度。通过使装置旋转而使单独的毛细管通道与激光诱导荧光激励探测装置对准，从而采用激光诱导荧光(LIF)作为探测机构。
以上的说明书、实例和数据提供对本发明组成的制造和使用的完整说明。因为可以不偏离本发明的精神和范围作出本发明的许多实施例，从而本发明在于这里所附的权利要求。
权利要求
1.一种用于处理样品材料的装置，该装置包括
基片，该基片包括第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转中心轴线；
不通气通道，该不通气通道具有内半径和外半径，所述通道适于对样品材料进行分级；以及
至少一个隔室连接结构，所述至少一个隔室连接结构与所述不通气通道的所述外半径接触。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述基片包括聚合物。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述基片包括聚烯烃、聚丙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、特氟纶、聚硅氧烷、或它们的组合。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述基片为约0.1毫米至约100毫米厚。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述基片形状为圆形，而且直径为约50毫米至约500毫米。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述不通气通道包括多个连接的隔室。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述多个连接的隔室中的每个隔室具有约100微升的容积。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述不通气通道是弧形的。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述不通气通道具有约180°或更大的弧长。
10.根据权利要求1所述的装置，还包括至少一个集成电极。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述至少一个集成电极与所述不通气通道相连。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述集成电极包括与所述基片相连的第一部件以及可松开地连接到所述第一部件上的第二部件。
13.根据权利要求10所述的装置，其中所述集成电极包括金属膜。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述金属膜包括铂。
15.根据权利要求1所述的装置，还包括至少一个覆盖膜。
16.根据权利要求1所述的装置，还包括与所述不通气通道的所述外半径接触的多个隔室连接结构。
17.根据权利要求16所述的装置，还包括多个腔室，每个腔室形成用于容纳样品材料的容积。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述多个腔室包含试剂。
19.根据权利要求17所述的装置，其中所述多个腔室连接到所述多个隔室连接结构上。
20.根据权利要求19所述的装置，还包括至少一个腔室阀。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述腔室阀通过所述腔室阀的至少一部分的激光烧蚀而起作用。
22.根据权利要求19所述的装置，还包括多个电泳通道，其中所述多个电泳通道相对于基片的旋转轴线而大体沿径向向外延伸。
23.根据权利要求22所述的装置，还包括多个位于至少一个腔室和至少一个电泳通道之间的腔室连接结构、以及至少一个腔室阀。
24.根据权利要求23所述的装置，其中所述基片包括吸收激光能的材料。
25.根据权利要求24所述的装置，其中吸收激光能的所述材料包括加碳聚合物。
26.根据权利要求24所述的装置，其中所述腔室阀通过所述腔室阀的至少一部分的激光烧蚀而起作用。
27.根据权利要求23所述的装置，还包括多个样品制备腔室，每个样品制备腔室形成用于容纳样品材料的容积。
28.根据权利要求27所述的装置，还包括位于所述至少一个电泳通道和至少一个样品制备腔室之间的制备连接结构、以及阀结构。
29.根据权利要求27所述的装置，其中所述多个样品制备腔室包含用于蛋白质消化的试剂。
30.根据权利要求27所述的装置，其中所述多个样品制备腔室构造成被加热。
31.根据权利要求1所述的装置，其中所述不通气通道的表面的可湿性与涂布有改善不通气通道的可湿性的化合物的基片材料块的可湿性不同。
32.根据权利要求1所述的装置，其中所述不通气通道的表面已经被改性以产生固定pH梯度。
33.根据权利要求1所述的装置，其中所述中心轴线和所述外半径之间的距离是波动的。
34.根据权利要求1所述的装置，其中所述中心轴线和所述内半径之间的距离是波动的。
35.一种用于处理样品材料的装置，该装置包括
基片，该基片包括第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转中心轴线；
不通气通道，该不通气通道具有内半径和外半径，所述通道适于对所述样品材料进行分级。
36.一种装置，包括
基片，该基片包括第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转中心轴线；
通道，该通道具有内半径和外半径，所述通道包括多个连接的隔室；以及
多个隔室连接结构，所述多个隔室连接结构与所述通道的所述半径接触。
37.一种对包含分析物的样品进行等电聚焦的方法，所述方法包括步骤
(a.)将样品加载到装置上，该装置包括基片，该基片具有第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转中心轴线；不通气通道，该不通气通道具有内半径和外半径、以及第一和第二样品孔；以及多个隔室连接结构，其中所述隔室连接结构与所述不通气通道的所述外半径接触，其中样品被加载到第一或第二样品孔中；
(b.)使得样品进入装置的不通气通道；
(c.)将阳极电解液溶液添加到装置的第一样品孔中；
(d.)将阴极电解液溶液添加到装置的第二样品孔中；
(e.)使电极与样品孔中的溶液接触；
(f.)向电极施加电压；以及
(g.)使装置旋转，从而使溶液从不通气通道运动到所述多个隔室连接结构。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在装置旋转之前打开所述多个隔室连接结构中的阀。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述溶液通过所述多个隔室连接结构运动到多个腔室。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述腔室包含化学试剂。
41.根据权利要求37所述的方法，其中对包含溶液和试剂的所述腔室进行加热。
42.一种对分析样品进行分级的方法，所述方法包括步骤
将所述样品加载到根据权利要求24所述的装置中，以及
使所述装置旋转，从而使所述样品分级。
43.一种处理包含分析物的溶液的方法，所述方法包括以下步骤
(a.)将溶液加载到装置中，所述装置包括(i)基片，该基片具有第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转中心轴线；以及(ii)在所述基片内的不通气通道；
(b.)使得溶液进入该不通气通道；
(c.)分离溶液的分析物；以及
(d.)向溶液施加离心力，从而对所述溶液进行分级。
44.根据权利要求43所述的方法，其中利用等电聚焦分离所述分析物。
45.一种用于处理样品材料的装置，该装置包括
基片，该基片包括第一主表面和第二主表面、以及至少一个通道；
样品孔，该样品孔用于保持流体，所述孔连接到所述通道上；
集成电极，该集成电极构造成当所述装置中存在所述流体时与所述流体接触；以及
在所述孔外部的接触点，该接触点允许电流输送到所述电极。
全文摘要
一种装置包括基片，该基片具有第一主表面和第二主表面、以及轴心，该轴心形成用于基片的旋转轴线；以及不通气通道，该不通气通道具有多个连接的隔室。还公开了使用本发明装置的方法。
文档编号G01N27/447GK1829569SQ200480021988
公开日2006年9月6日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年7月1日
发明者塞缪尔·J·加伦, 威廉·贝丁加姆, 巴萨舍巴·E·庄康克林, 帕特里克·L·科莱曼, 彼得·D·陆德外斯, 伊西德罗·安盖洛·E·萨拉加 申请人:3M创新有限公司