专利名称：抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，尤其是一种抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体及应用。
背景技术：
目前，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。据卫生部2001资料显示我国城市地区的恶性肿瘤死亡率为135.59/10万，居各种疾病的死亡率之首。随着社会经济的发展，工业化、城市化的加速，城市和农村的肺癌、肝癌、胃癌、肠癌等肿瘤的发病率均呈上升趋势，所以针对各种肿瘤的预防、发病机制、诊断、治疗和预后的相关研究成为迫切亟待解决的问题。而恶性肿瘤细胞的过度无限增殖、分化障碍及凋亡受阻是其发病的主要病理生理学基础。已经发现，不少肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病等。因此，以肿瘤细胞凋亡相关基因或其蛋白产物为靶点的关于各种肿瘤的发病机制、诊断、治疗和预后的基础及临床研究成为目前临床与基础研究的热点课题。
随着细胞凋亡相关研究的逐渐深入，细胞凋亡相关基因及其表达产物的检测在各种类型的肿瘤诊断、治疗及预后观察中已得到了广泛应用。如p53、Bcl-2等。ASPP家族蛋白是新近发现的p53细胞凋亡途径相关的蛋白家族，该家族蛋白包括ASPP1、ASPP2和iASPP，这几种蛋白均具有SH3结构域、大量的锚蛋白重复结构域和丰富的谷氨基结构域。ASPP1和ASPP2通过与p53结合形成ASPP-p53复合物作用于促凋亡基因启动子，ASPP表达水平的变化可引起p53结合DNA的能力发生改变，从而影响p53诱导凋亡的能力。iASPP是新近发现的高度保守的ASPP家族成员，其蛋白产物定位于细胞浆或细胞核内，具有结合NF-κB p65亚基和p53功能，进而抑制NF-κB的转录调节和p53对凋亡的调节功能。它不仅可以通过结合NF-κB p65亚基抑制NF-κB转录活性，而且可以与ASPP1和ASPP2竞争性结合p53，影响ASPP-p53复合物与DNA结合的能力，从而抑制p53的促凋亡功能。通过RNA干扰使iASPP基因沉默后，可以显著促进肿瘤细胞系的凋亡。而iASPP表达水平升高可以增强细胞对由紫外线照射和顺铂引起的细胞凋亡的抗性。目前研究发现iASPP不仅在乳腺癌中高表达，而且急性白血病患者骨髓单个核细胞和一些白血病细胞系细胞中其mRNA水平表达也高于正常人骨髓单个核细胞。
但是，有关iASPP的进一步深入研究，如在各种实体瘤和血液系统肿瘤中，实体瘤癌变组织和血液系统肿瘤的骨髓细胞及外周血细胞中iASPP在蛋白水平是否有所改变等，皆因没有相应的抗体而无法进行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是制备一种能与人iASPP蛋白的抗原决定簇特异性结合的小鼠单克隆抗体，检测正常细胞和各种类型的肿瘤患者的细胞中iASPP蛋白在不同细胞内定位及蛋白表达水平。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是应用RT-PCR方法克隆iASPP全长cDNA，利用合适的酶切位点构建人iASPP真核表达重组质粒，其核苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，然后将此重组质粒注射入小鼠脾脏内免疫，免疫后获得的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后产生针对iASPP蛋白的特异性单克隆抗体。
上述单克隆抗体可以通过多种方法制备，来自用重组人iASPP真核表达质粒通过脾脏内注射免疫或者重组人iASPP蛋白通过腹腔免疫后的小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。
上述单克隆抗体筛选抗原是由克隆入SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的cDNA序列后的原核表达载体所表达的蛋白。由于iASPP蛋白的C末端与同家族蛋白ASPP1和ASPP2的同源性高达50％，所以不仅表达了iASPP全长蛋白PIAF而且表达了其N末端的一段短肽序列PIAS。在筛选杂交瘤细胞所产生单克隆抗体时，同时使用两种抗原筛选排除了所筛选抗体中针对同源序列的非特异性抗体，确保了所筛选到的阳性克隆产生的单克隆抗体为针对iASPP蛋白单克隆抗体的特异性。
上述抗人iASPP蛋白的单克隆抗体的免疫球蛋白亚型为IgG或者IgM型。
上述单克隆抗体可以识别细胞内分子量分别为44KD和89KD的两种iASPP异构体蛋白。
上述单克隆抗体可以通过各种标记或不通过标记用于检测正常细胞和各种类型肿瘤患者细胞中iASPP细胞内定位及蛋白表达水平。
上述单克隆抗体可以应用于组建检测正常细胞和各种类型的肿瘤细胞内iASPP蛋白的表达及细胞内定位的免疫组织化学试剂盒。
本发明有利于进一步研究和阐述各种肿瘤的发病机制和进一步促进各种肿瘤的早期和鉴别诊断新方法的发现。
图1是RT-PCR产物的电泳图，其中，1DNA marker(DL2000)；2iASPP RT-PCR产物。
图2是PIAS和PIAF重组表达载体构建示意图。
图3是CIAF质粒表达载体构建示意图。
图4是SDS-PAGE分析PIAS和PIAF融合蛋白的表达电泳图，其中，1.低分子质量蛋白Marker；2.未用IPTG诱导的PIAS-Rosetta(DE3)菌体总蛋白；3.IPTG诱导的PIAS-Rosetta(DE3)菌体总蛋白；4.未用IPTG诱导的PIAF-Rosetta(DE3)菌体总蛋白；5.用IPTG诱导的PIAF-Rosetta(DE3)菌体总蛋白。
图5是SDS-PAGE分析纯化后PIAS和PIAF融合蛋白电泳图，其中，1.50mmol/L咪唑洗脱的PIAS蛋白；2.100mmol/L咪唑洗脱的PIAS蛋白；3.250mmol/L咪唑洗脱的PIAS蛋白；4.500mmol/L咪唑洗脱的PIAS蛋白；5.低分子量Marker；6.50mmol/L咪唑洗脱的PIAF蛋白；7.100mmol/L咪唑洗脱的PIAF蛋白；8.250mmol/L咪唑洗脱的PIAF蛋白；9.500mmol/L咪唑洗脱的PIAF蛋白。
图6A是纯化前PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鉴定，其中，1低分子质量蛋白Marker；2用IPTG诱导的PIAF-Rosetta(DE3)菌表达的总蛋白；3用IPTG诱导的PIAS-Rosetta(DE3)菌表达的总蛋白。
图6B是纯化后PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鉴定，其中，1低分子质量蛋白Marker；2纯化后的PIAF融合蛋白；3纯化后的PIAF融合蛋白。
图7A是单克隆抗体的免疫组织化学鉴定——阴性对照(400×)。
图7B是单克隆抗体的免疫组织化学鉴定——U-937细胞(400×)。
图7C是单克隆抗体的免疫组织化学鉴定——U-937细胞(1000×)。
图8A是单克隆抗体的Western Blot鉴定，其中，Mark低分子质量蛋白Marker；PF纯化后的PIAF融合蛋白。
图8B是单克隆抗体的Western Blot鉴定，其中，1低分子质量蛋白Marker；2293T细胞的细胞浆提取物；3.293T细胞的细胞核提取物。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不仅限于下述实施实例。
实施例1人iASPP基因的克隆及真核和原核表达载体的构建1.1人iASPP基因的克隆离心收集对数生长期的U-937细胞约(1-5)×106，TRIzol提取总RNA，用分光光度计测定A260/A280，计算RNA含量，并经12g/L琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。20μl逆转录反应体系含2μg总RNA，4μl RT缓冲液，50pmol/L oligo(dT)16，1μmol/L dNTPs，0.1μmol/L DTT，15U RNA酶抑制剂(Takara)，200U MLV(Invitrogen)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃ 15min终止反应，所得cDNA-20℃保存备用。根据iASPP CDS序列(NM_006663)利用gene runner软件设计引物，分别于正义链5′端加EcoR I反义链5′端加Xho I酶切位点，iASPP正义链引物5’-GGAATTCCATGTGCTGGTTGTATGCC-3’；反义链引物5’-CTCGAGGTCAGCCTCAGAAACCTC-3’，预计片段长度1269bp。iASPP的PCR反应条件95℃预变性5min，94℃45s，54-57℃45s，72℃90s，32个循环，72℃10min，结果见图1。回收纯化后的PCR产物克隆入pMD 18-T载体中，命名为TIAF。
1.2原核表达载体的构建克隆入T载体的iASPP经测序鉴定正确，以其为模板，用上游引物5’-GCGCGAATTCATGTGCTGGTTGTATGC-3’和下游引物5’-GCGCCTCGAGGACTTTACTCCTTTGAGG-3’以及上游引物5’-GCGCGAATTCTGCTGGTTGTATGCCCTG-3’和下游引物5’-GCGCCCTCGAGTGGAATGGGAGCTGGTGG-3’分别以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，两种PCR产物均分别于上下游引入EcoR I和Xho I酶切位点。第一对引物所扩增的片段长度为1241bp，其中iASPP基因读码框长度为1221bp。第二对引物扩增的片段长度为521bp，其中iASPP基因读码框长度为501bp。第一对引物的PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃ 30s，52-55℃ 30s，72°C 3min，25个循环后72℃延伸20min；第二对引物的PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃ 30s，50-54℃ 30s，72℃ 1.5min，25个循环后72℃延伸20min。均于循环完毕72℃延伸5min后，加入1U Taq DNA聚合酶继续延伸15min。将用第一对引物和第二对引物所扩增的PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后，连接入Simple T载体中，分别命名为TPIAF和TPIAS。转化E.coli DH5菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取TPIAF和TPIAS阳性克隆，提取质粒用EcoR I和Xho I双酶切，分别回收1233bp(其中包含具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.4)和513bp(其中包含具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.6)的目的片段。与经EcoR I和Xho I双酶切原核表达载体pET28a连接后，转化E.coli DH5菌株，通过酶切鉴定得到含目的片段的重组克隆，并命名为PIAF和PIAS，见图2。
1.3真核表达载体的构建克隆入T载体的iASPP经测序鉴定正确，以其为模板，用上游引物5’-GAATTCACCATGGGCTGGTTGTATGCC-3’和下游引物5’-CTCGAGGTCAGCCTCAGAA-3’以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物分别于上下游引入EcoR I和Xho I酶切位点并于上游引物中加入kozak序列。PCR产物所扩增的片段长度为1268bp，其中iASPP基因读码框长度为1224bp(其核苷酸和所编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃ 30s，52-56℃ 30s，72℃ 3min，25个循环后72℃延伸20min。于循环完毕72℃延伸5min后，加入1U Taq DNA聚合酶继续延伸15min。将所扩增的PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后，连接入Simple T载体中，命名为TCIAF。转化E.coli DH5菌株，在LB平皿中进行蓝白斑筛选，挑取TCIAF阳性克隆，提取质粒用EcoR I和Xho I双酶切，回收1268bp的目的片段。与经EcoR I和Xho I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后，转化E.coli DH5菌株，通过酶切鉴定得到含目的片段的重组克隆，并命名为CIAF，见图3。
实施例2筛选抗原的表达及纯化2.1将实施例1.2中获得的PIAF和PIAS质粒分别转化Rosetta(DE3)原核表达菌株，在卡那霉素和氯霉素双抗性LB培养基琼脂平板上筛选阳性克隆。挑取单个克隆接种于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8。以1∶100比例接种于含有相同浓度抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达。4小时后，4℃离心收集菌体。重悬于适量的1×SDS上样缓冲液中，置沸水浴3～5min，取50μl进行SDS-PAGE电泳分析。目的片段PIAS和PIAF蛋白的分子量分别为23KD、49KD，见图4。
2.2PIAS和PIAF融合蛋白的纯化将适量活化的PIAS-Rosetta(DE3)和PIAF-Rosetta(DE3)菌液接种到LB培养基中进行大规模培养。在37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，4小时后离心收集菌体。重悬并超声裂解菌体，离心获得包涵体，并用含6mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液于4℃融解过夜。次日用Ni2+鳌合层析柱纯化目的蛋白，分别用50、100、250和500mmol/L咪唑盐溶液(6mol/L尿素，50mmol/LTris-HCl)洗脱，见图5。
2.3PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鉴定纯化前后的PIAS和PIAF融合蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。剪下转移膜Marker条带部分，用氨基黑染色。目的蛋白条带以封闭液(含5％脱脂奶的PBS)4℃封闭过夜，弃去封闭液加入鼠抗His-tag抗体(1∶1000)，室温孵育2h后，弃去一抗，用PBS(含0.05％ Tween-20)洗膜三次，加入HRP标记羊抗鼠IgG室温孵育1h。用PBS(含0.05％ Tween-20)洗硝酸纤维素膜三次，加入DAB显色，见图6A、6B。
实施例3单克隆抗体的制备3.1动物免疫应用大提质粒试剂盒提取实施例1.3中获得的CIAF质粒，将该质粒用PBS稀释其浓度至100μg/100μl注射入小鼠脾脏内，每只小鼠注射100μl。
3.2饲养细胞的制备本发明中采用的饲养细胞是小鼠腹腔巨噬细胞。饲养细胞于融合前一天制备，制备过程如下选用与所免疫小鼠相同品系Balb/c小鼠，6～8周龄→将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精中，消毒3～5分钟→将小鼠固定于解剖板上，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜→用无菌注射器向腹腔中注射6～8ml培养液→用注射器反复冲洗腹腔，吸出冲洗液→放入10ml离心管中，1000转/分，离心5～6分钟→用含20％胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞浓度为(1-2)×105/ml→
加入96孔板中，100l/孔→将96孔培养板置37℃、5％CO2孵箱培养3.3骨髓瘤细胞的准备本发明中选用的骨髓瘤细胞系是NS1细胞系。
于融合前1-2周复苏细胞系，用含20％FCS的1640培养液培养。每2天传代一次，保证细胞生长状态良好，活细胞计数高于95％。
3.4细胞的融合3.4.1脾细胞悬液的制备在无菌条件下取出应用实施实例3.1中CIAF质粒免疫3天后的两只小鼠脾脏，用不完全培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，共1.3×108。
3.4.2取对数生长的NS1骨髓瘤细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，根据所获取的脾脏单个核细胞数取NS1骨髓瘤细胞2.6×107，用不完全培养液洗涤2次。
3.4.3同时将免疫好小鼠脾细胞悬液用不完全培养液离心洗涤2次。
3.4.4将上述的骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5的比例混合于50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心1000rpm，8分钟。
3.4.5弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
3.4.6轻轻弹击离心管底，使沉淀的细胞略加松动。
3.4.7骨髓瘤细胞和脾脏细胞的融合①30秒内加入于37℃温育好的含5％DMSO 45％PEG(Merek，分子量4000)1ml，边加入边轻轻摇动离心管(离心管置于37℃水浴中)。
②作用90秒钟。
③加入于37℃温育好的不完全培养液，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml，终止PEG作用。
3.4.8离心，800rpm，6分钟。
3.4.9弃上清，先用6ml 20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬。
3.4.10共接种8块96孔培养板，补加完全培养液74ml，一块96孔板含约1.5×107脾细胞。
3.4.11将融合后细胞悬液加入于前一天制备好的含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，置于37℃5％CO2孵箱培养。
3.4.12于24小时后，加入HAT选择培养基进行选择培养。待杂交瘤细胞克隆长至铺满孔底约1/10面积时开始筛选(约2周左右)，在此期间每3天半量更换HAT选择培养液，至少于选择前更换2-3次。
3.5单克隆抗体的筛选将实施实例2中纯化好的PIAS和PIAF蛋白包被96孔酶标板，0.5μg/孔，4℃过夜。次日，将酶标板用含5％胎牛血清的PBS于37℃孵育1小时封闭后，取杂交瘤细胞的培养上清用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3.6阳性克隆杂交瘤细胞株的亚克隆和冻存3.6.1阳性克隆杂交瘤细胞株的亚克隆阳性克隆杂交瘤细胞株的亚克隆培养采用极限稀释法，利用这种方法按照每孔1或0.5个细胞接种于预先铺好饲养细胞的96培养板中，置于37℃ 5％CO2孵箱培养。待杂交瘤细胞克隆长至铺满孔底约1/10面积时开始筛选(约2周左右)，筛选方法如实施例3中步骤5所述。
3.6.2阳性克隆杂交瘤细胞株的冻存将亚克隆后的阳性克隆细胞株扩大培养后，按照常规方法冻存，每支冻存管中含1×106细胞。
实施例4单克隆抗体亚型的鉴定选用商业公司的Monoclonal antibody isotyping Kit抗体亚型检测试剂盒对所获得的阳性杂交瘤细胞的培养液上清进行检测，结果发现所获得的单克隆抗体分别是IgG2a/κ链型和IgM/κ链型实施例5单克隆抗体的免疫组织化学鉴定实验方法5.1标本制备标本包括实体瘤组织病理切片、外周血和/或骨髓细胞和肿瘤细胞系涂片。
外周血和/或骨髓细胞涂片的制备过程5.1.1外周血和/或骨髓单个核细胞分离、细胞涂片外周血和/或骨髓(外周血和骨髓细胞取自正常人或各种血液系统肿瘤患者)2-3ml，肝素(25u/ml)抗凝，用PBS做1∶2-3稀释后，用吸管取3-4ml稀释血样沿管壁缓慢加入到含有2-3ml淋巴细胞分离液(密度1.077)的离心管上层，使两种液体间保持清晰的界面。离心(1500rpm)15-20分钟，取出离心管，轻轻吸出富含单个核细胞的细胞层，加入另一离心管中。加入PBS离心洗2-3次。加入少量PBS，反复吹打沉淀细胞使其分散为单个细胞。涂片方法取分离好的单个核细胞50μl于离心涂片机上离心涂片。室温放置4-12小时后进行下面实验步骤，或保存，保存方法见5.1.2。
5.1.2外周血和/或骨髓细胞涂片室温干燥4-12小时，直接进行下面步骤或用洁净的白纸成对包好(两张涂片的血膜面向外)，放在装有干燥剂(如变色硅胶颗粒)的塑料小袋中，封好袋口做好标记，置-20℃保存。
5.2将细胞涂片置于冰上滴加通透液至涂片上覆盖所有细胞透膜5-10分钟，用PBS洗3次，每次5min；5.3滴加稀释好的腹水型或纯化的单克隆抗体至涂片上覆盖所有细胞，置于湿盒中4℃过夜或室温孵育2小时，用PBS洗3次，每次5min；以滴加PBS的涂片为阴性对照；5.4滴加含10％马血清的PBS至涂片上覆盖所有细胞，置于湿盒中室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；5.5将细胞涂片置于甲醇溶液中(10ml甲醇中加入0.2ml H2O2)，室温孵育10min，去除内源性过氧化物酶，PBS洗3次，每次5min；5.6滴加稀释好生物素标记的马抗鼠免疫球蛋白至覆盖涂片上的所有细胞，置于湿盒中室温孵育1小时，用PBS洗3次，每次5min；5.7滴加亲和素辣根过氧化物酶复合物至涂片上覆盖所有细胞，置于湿盒中室温孵育30min，用PBS洗3次，每次5min，擦去多余液体；5.8DAB避光显色10min，充分洗涂片；5.9苏木素复染1min，用PBS洗3次，每次5min，擦去多余液体；5.10将涂片依次置于80％、90％、100％、100％乙醇中进行脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片，室温自然干燥；5.11将涂片置于显微镜下观察，阳性反应为棕黄色。见图7A、7B、7C。
溶液配制(1)PBS液(ABC免疫酶标)A液Na2PO4·12H2O 23.88克，溶解于1000ml蒸馏水中B液KH2PO49.08克，溶解于1000ml蒸馏水中取A液86ml加B液14ml，调pH至7.6然后加入0.85克NaCl。
(2)FAB固定液Na2PO4·12H2O 20mg；KH2PO4100mg；40％甲醛25ml；丙酮45ml；蒸馏水30ml；混合好后调节pH至6.6-6.8(3)通透液含0.2％TritonX-100的PBS缓冲液。
(4)显色液0.05％(w/v)DAB溶解于PBS中，含有0.1％(v/v)H2O2实施例6单克隆抗体的Western Blot鉴定实验纯化后PIAF融合蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。剪下转移膜Marker条带部分，用氨基黑染色。目的蛋白条带以封闭液(含5％脱脂奶的PBS)4℃封闭过夜，弃去封闭液加入所制备的单克隆抗体，室温孵育2h后，弃去一抗，用PBS(含0.05％Tween-20)洗膜三次，加入HRP标记羊抗鼠免疫球蛋白室温孵育1h。用PBS(含0.05％Tween-20)洗硝酸纤维素膜三次，加入DAB显色。
取1×106个对数生长期的U937细胞置于离心机中离心，用PBS反复重悬离心洗3次后，用细胞裂解液裂解细胞。经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。剪下转移膜Marker条带部分，用氨基黑染色。目的蛋白条带以封闭液(含5％脱脂奶的PBS)4℃封闭过夜，弃去封闭液加入所制备的单克隆抗体，室温孵育2h后，弃去一抗，用PBS(含0.05％Tween-20)洗膜三次，加入HRP标记羊抗鼠免疫球蛋白室温孵育1h。用PBS(含0.05％Tween-20)洗硝酸纤维素膜三次，加入DAB显色。见图8。
实施例7ABC免疫组织化学检测试剂盒的组建7.1试剂盒中提供的试剂包括7.1.1 iASPP单克隆抗体1支(100μl)使用时用缓冲液做100倍稀释7.1.2生物素标记的羊(或马)抗鼠免疫球蛋白(或IgG或IgM)1支(100μl)使用时用缓冲液做100倍稀释；7.1.3生物素-卵白素-HRP复合物1支(100μl)使用时用缓冲液做100倍稀释；7.1.4封闭用羊(或马)血清1支(1ml)7.1.5自备试剂和材料(1)0.1M phoshpate buffer，0.15M NaCl，pH7.4(PBS)；(2)洗涤液0.1M PBS pH7.4，含0.05％Tween-20；(3)稀释液0.1M PBS pH7.4，0.5％BSA；(4)DAB；(5)酶标仪等。
7.2试剂盒储存(1)短期使用，储存于2-8℃；(2)长期放置，请将一抗储存于-20(℃或者-80℃冰箱中，请勿反复冻融。
7.3标本均为取自正常人或各种血液系统肿瘤患者的外周血和/或骨髓的单个核细胞，其制备方法参照实施例5中的步骤1。
7.4注意事项(1)标本应新鲜取制或干燥后于-20℃干燥保存；(2)试剂盒应储存于4℃，不可冻融，防止污染。
(3)各种抗体操作过程中的孵育步骤必须在湿盒内进行，各种抗体加样量10-30μl，切忌干涸和分布不匀；(4)取用试剂盒试剂时，请分别用新的加样器吸头吸取，避免交叉使用；(5)叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)具有灭活作用，在本试剂盒系统中应避免使用；(6)底物液应避光保存；(7)所有试剂在使用前应回复至室温。
7.5该试剂盒使用时操作步骤参照实施实例5序列表
<110>中国医学科学院血液学研究所<120>抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体及应用<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1224<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1224)<400>1atg tgc tgg ttg tat gcc ctg gaa gtt gtg gag agg gag tgt tgg gtg 48Met Cys Trp Leu Tyr Ala Leu Glu Val Val Glu Arg Glu Cys Trp Val1 5 10 15tct cct ggg gac ctg tcc tct gat ggg ctc ttg ttc cgg cta gga ccc 96Ser Pro Gly Asp Leu Ser Ser Asp Gly Leu Leu Phe Arg Leu Gly Pro20 25 30ccc aaa ccc ccc acc gag ctg gag cct gag ccg gag ata gag ggg ctg 144Pro Lys Pro Pro Thr Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu Ile Glu Gly Leu35 40 45ctg aca cca gtg ctg gag gct ggc gat gtg gat gaa ggc cct gta gca 192Leu Thr Pro Val Leu Glu Ala Gly Asp Val Asp Glu Gly Pro Val Ala50 55 60
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1.一种抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体，其特征在于，用于制备单克隆抗体的免疫原是插入人iASPP cDNA的真核表达质粒，免疫原的核苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于筛选单克隆抗体的蛋白为插入iASPP cDNA片段的原核表达载体所表达的融合或者非融合蛋白，所述cDNA片段的核苷酸分别为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5，其所编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体来源于用插入人iASPP cDNA的真核表达质粒进行脾脏内免疫后获得的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的免疫球蛋白亚型为IgG或者IgM中之一。
4.根据权利要求2所述的抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体，其特征在于，筛选产生单克隆抗体的杂交瘤细胞是酶联免疫吸附实验方法(ELISA)得到。
5.权利要求1所述的单克隆抗体，在识别细胞浆和细胞核内或者体外重组表达分子量分别为44KD和/或89KD的两种iASPP异构体蛋白中的应用。
6.权利要求1所述的单克隆抗体，用于检测正常和肿瘤组织标本，其检测的靶抗原物质为定位于所述细胞的细胞浆和细胞核内的人类癌蛋白iASPP。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所应用的单克隆抗体是应用荧光素、酶、铁蛋白或胶体金或者放射性同位素标记或者未标记任何标记物的抗体。
8.权利要求1所述的单克隆抗体在组建检测正常细胞和各种类型的肿瘤细胞内iASPP蛋白的表达及细胞内定位的免疫组织化学试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗人癌蛋白iASPP的单克隆抗体及应用，制备能与癌蛋白iASPP的两种异构体在细胞内和细胞外特异性结合的小鼠的单克隆抗体。提供了针对筛选iASPP单克隆抗体时所用抗原的载体构建、蛋白表达和纯化的方法，以及iASPP单克隆抗体筛选方法及其用于诊断和治疗人类各种类型肿瘤的用途。本发明采用分子生物学、细胞生物学等方法成功的制备了人癌蛋白iASPP的单克隆抗体，为进一步阐述各种肿瘤的发病机制、临床诊断及靶向治疗方面奠定了的基础。
文档编号G01N33/577GK1854156SQ20051001335
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者王建祥, 王敏, 刁世勇, 饶青, 张新伟, 廖晓龙 申请人:中国医学科学院血液学研究所