专利名称：快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于果蔬及原粮类食品中农药残留检测试纸及其检测方法，属胶体金免疫检测领域。
背景技术：
由于蔬菜生长期短且病虫害较为严重，因而，在蔬菜种植过程中常常需要连续多次施药。现代化蔬菜种植中用除草剂除草代替人工除草，提高劳动效率。而不少蔬菜需要多次采收，采收与施药的时间间隔短，造成采收时蔬菜中的农药残留量往往较高，很容易超过国家规定的标准。而蔬菜中农药残留量超标会严重影响人类健康水平，已成为不容忽视的食品污染源。政府和各职能部门对食品的农药残留问题十分关注。但由于农药的毒性和害虫的抗药性形成一个恶性循环，因此全面彻底禁止高剧毒农药的使用将有一个较长的过程，即使是全面使用中、低毒农药，农药恶性中毒事件仍然发生。因此对分析检测的对象、种类、数量、范围、指标等诸多方面都提出了新的要求和更高标准。
甲草胺(α-氯代-2′，6′-二乙基-N-甲氧基甲基乙酰替苯胺)，酰胺类选择性芽前除草剂，主要是通过杂草的芽壳吸收，根部和种子也可有少量吸收。适用于大豆、玉米、花生、棉花、马铃薯、甘蔗、油菜等作物田，防除稗草、马唐、蟋蟀草、狗尾草、秋稗、臂形草、马齿苋、苋、轮生粟米草、藜、蓼等1年生禾本科杂草和阔叶杂草。对菟丝子也有一定防效。能被土壤团粒吸附不易淋失，也不易挥发。
乙草胺(2′-乙基-6′-甲基-N-(乙氧甲基)-2-氯代乙酰替苯胺)，旱地酰胺类除草剂，作用特点与甲草胺相同，具安全、高效、杀草谱广等特点。可用于大豆、花生、玉米、棉花、西瓜等，可防除马唐、看麦娘、画眉草、牛筋草、马齿苋等一系列杂草。
丁草胺(N-(丁氧甲基)-α-氯-α′，6′-二乙基乙酰替苯胺)，酰胺类选择性芽前除草剂，作用特点与甲草胺相同，通过杂草芽鞘吸收进入植物体内。抑制蛋白酶，破坏蛋白质合成，导致杂草死亡。适用于十字花科、伞形花科、菊科等蔬菜田间除草，可有效防除千金子、马唐、蟋蟀草、狗尾草、水莎草等一年生禾本科杂草，对部分阔叶杂草均有良好的杀灭效果。
甲草胺经人体吸收、摄入或皮肤吸收后会中毒，资料报道，对人有致突变作用；乙草胺、丁草胺对人的眼睛和皮肤有刺激性，多次发生中毒情况。鉴于上述情况，甲草胺、乙草胺、丁草胺已被列为农药残留的重要检测对象。
目前，检测农药残留的分析方法主要是依靠、气相色谱法(GC)或气相色谱与质谱(MS)联用法(GC/MS)。“酶抑制率法+分光光度法”已被列为国家推荐标准(GB/T 5009.199-2003)。该法快速、灵敏、操作简便且成本低廉，可实现快速初筛，但受检测范围和精度的限制。而气相色谱法(GC)可实现精度的定量分析但速度较慢，检测成本较高。总之，这些方法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。
因此，利用竞争法原理，在传统免疫检测法的基础上引入了胶体金快速检测技术，研制出甲草胺、乙草胺、丁草胺醇胶体金竞争法检测试纸。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。
发明内容
本发明针对上述存在的一些问题，提供了一种适用于检测农药甲草胺、乙草胺、丁草胺是否超标的胶体金测定试纸。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的在农药残留检测试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1-2毫米范围)，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。关于底板、硝酸纤维素膜、吸水纸、胶体金标垫的组合方法按专利CN 2741052Y执行。
农药甲草胺、乙草胺或丁草胺残留检测试纸的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，试验线检测甲草胺是由甲草胺合成免疫原包被、试验线检测乙草胺是由乙草胺合成免疫原包被、试验线检测丁草胺是由丁草胺合成免疫原包被。把检测甲草胺、乙草胺或丁草胺残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入果汁、蔬菜浸汁中，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至单克隆抗体金标垫时，样品中的甲草胺与甲草胺单克隆抗体金标探针、乙草胺与乙草胺单克隆抗体金标探针、丁草胺与丁草胺单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有甲草胺合成免疫原、乙草胺合成免疫原或丁草胺合成免疫原试验线时，由于甲草胺单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中甲草胺、乙草胺单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中乙草胺、丁草胺单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中丁草胺优先结合成复合物而失去其与甲草胺、乙草胺或丁草胺合成免疫原结合，因此其胶体金不能滞留于试验线上，试验线处没有红色线显示，即只有一条红色控制线为阳性；相反如果样品中没有甲草胺、乙草胺、丁草胺，单克隆抗体金标垫中的抗体移动到试验线上，甲草胺单克隆抗体就会与甲草胺合成免疫原、乙草胺单克隆抗体就会与乙草胺合成免疫原、丁草胺单克隆抗体就会与丁草胺合成免疫原发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条红色线为阴性，这就是免疫竞争法原理。试验线的颜色深浅与样品中甲草胺、乙草胺或丁草胺含量高低成反比。从阳性过渡到阴性，由于所测甲草胺、乙草胺或丁草胺含量不同，试验线的颜色也不同，形成一个红色颜色梯度差，以这种原理检测出OD值，从而推断出试验线所反应实际甲草胺、乙草胺、丁草胺的量。
用竞争法制成试纸其检测农药设定检出量以上，观察窗处出现一条红线为阳性；设定检出量以下出现双红线为阴性；设定检出量时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，从而得出判断。
当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无农药，标记的金标探针都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
由于采用上述技术方案，本发明所提供的一种快速检测农药残留的胶体金试纸具有这样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
图1为本发明一种快速检测农药残留的胶体金试纸的主视结构图。
图2为发明图1的侧视结构图。
图3为检测显示阳性结果图。
图4为检测显示阴性结果图。
图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单克隆抗体金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、MAX线。
具体实施例1.根据甲草胺的分子结构，推断其分子中的抗原决定区，选用甲草胺农药原药经化学反应合成一种与甲草胺分子结构相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白质大分子相连接基团的分子结构(半抗原)。在缩合剂作用下使半抗原小分子与蛋白质大分子相连接制得甲草胺免疫抗原。乙草胺免疫抗原、丁草胺免疫抗原制备方法同甲草胺。
2.农药单克隆抗体的制备(1)将制备的甲草胺免疫抗原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。
(2)提取小鼠腹水纯化筛选，获得能与甲草胺结合的单克隆抗体用于胶体金标记。
乙草胺、丁草胺单克隆抗体制备方法同甲草胺。
3.胶体金的制备及与单克隆抗体的结合(1)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到85～95℃，加入适量柠檬酸三纳继续加热搅拌至沸腾3～10分钟，冷却后避光保存备用。
(2)把甲草胺单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。
乙草胺、丁草胺单克隆抗体结合胶体金方法同甲草胺。
4.制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。
5.试纸条组合见说明书附图，方法同专利CN 2741052Y。
6.使用方法把试纸的样品吸液层端放入果汁、蔬菜浸汁中(液面不得超过MAX线图中8)，1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5分钟时观察结果。
7.结果判断若该试纸的最低检出量设定为0.5mg/kg，则检测甲草胺浓度0.5mg/kg以上，观察窗处出现一条红线为阳性；0.5mg/kg以下出现双红线为阴性；0.5mg/kg时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，此界限值为国家颁布的蔬菜农药残留检测标准0.5mg/kg。从而得出判断。
权利要求1.一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、甲草胺单克隆抗体或乙草胺单克隆抗体或丁草胺单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)、MAX线(8)组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被制成。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于试验线是由甲草胺合成免疫原或乙草胺合成免疫原或丁草胺合成免疫原包被制成。
4.根据权利要求1或3所述的一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于根据调节金标垫和试验线包被物的成分，此试纸可以检测甲草胺、乙草胺、丁草胺原药或混合物。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于金标垫是由单克隆抗体作为胶体金标记。
6.根据权利要求1所述一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，其特征在于试验线的检测值设定为最低检出量为甲草胺0.1～1mg/kg、乙草胺1～5mg/kg、丁草胺0.01～1mg/kg。
专利摘要一种快速检测甲草胺、乙草胺、丁草胺残留的胶体金试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成。底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有甲草胺合成免疫原试验线或乙草胺合成免疫原试验线或丁草胺合成免疫原试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，通过胶体金免疫竞争方法制成试纸，利用免疫胶体金法来检测果蔬中的甲草胺、乙草胺或丁草胺残留量是否超标。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。
文档编号G01N21/77GK2847296SQ20052014262
公开日2006年12月13日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者万积成 申请人:万积成