Trpc通道治疗心血管疾病的用途的制作方法

专利名称：：Trpc通道治疗心血管疾病的用途的制作方法TRPC通道治疗心血管疾病的用途本发明涉及TRPC通道、其失活突变体，或编码该TRPC通道或失活突变体的核苷酸序列用于制备治疗心血管疾病的药物的用途，以及筛选TRPC通道或其失活突变体调节剂的方法。动脉粥样硬化是西方世界心血管疾病的主要原因之一。在2001年这些疾病在美国引起约一百万人死亡。此外，由于JSUI中国家生活方式的改变，动脉粥样硬化和相关的心血管疾病成为全世界的流行病.WHO报道到2010年心血管疾病将成为发展中国家的主要死亡原因。因此，对预防和治疗动脉粥样硬化的新药物有巨大的医学需要。动脉粥样硬化的产生和jObl—个复杂并且没有完全理解的过程，其依赖于大量外遗传因子(例如生活方式、营养、锻炼)和遗传因子，大量临床观察显示动脉粥样硬化和动脉粥样化发生的病理生理学中涉及排列在血管内壁的内皮细胞的功能障碍(Ross,R.N.(1999)，Engl.J.Med.340:115-126)。因此，涉及内皮功能调节的蛋白质可能是抗动脉粥样硬化疗法的主要耙标。由于重要的内皮功能如氣化氮(NO)的产生受胞内Ca"水平的控制，因此Ca"调节蛋白看来特别具有意义.TRPC通道(一类新的铁通道蛋白)是表达于心血管和其他系统的Caz+透过性非选择性阳离子通道。基于序列同源性，TRPC3、TRPC6和TRPC7组成了独特的TRPC亚家族。在表达系统中，这些通道通过G蛋白偶联受体或胞内Ca"存储的消耗而激活(Clapham等人(2001)，Nat.Rev.Neurosci.2:387-396)。在培养的内皮细胞中TRPC3还促进氧化胁迫激活的阳离子流(Balzer等人(1999)Cardiovasc.Res.42:543-549)。为了研究TRPC1在平滑肌细胞中的功能性作用，在WO02/059155中使用了针对TRPC1特异性表位的抗体。然而，该表位并未在其他TRPC通道中发现。WO05/049084公开了在分离的大鼠心室肌细胞中使用化合物2-氨基乙氧基硼酸二苯酯(2-APB)进行的功能研究。然而，已知该化合物尤其对TRPC3显示非特异性和可疑的效应(vanRossum等人(2000)，J.Biol.Chem.，275，28562-28568)。根据本发明，我们使用遗传方法在动脉粥样硬化兔的内皮细胞中体内抑制了TPRC3、TRPC6和TRPC7的活性。4^人吃惊地，我们在显性负TRPC3基因处理的血管中发现了血管功能的显著改善和动脉粥样硬化组织学标志的减少，这意味着抑制TRPC通道(特别是上述通道)的活性显示了抗动脉粥样硬化效应。这些发现在TRPC通道和心血管疾病如动脉粥样硬化之间建立了新的联系。因此，本发明的一个主题涉及TRPC通道、其失活突变体，或者编码该TRPC通道或失活突变体的核苷酸序列用于制备治疗心血管疾病特别是动脉粥样硬化的药物的用途。优选的TRPC通道为TRPC3通道、TRPC6通道或TRPC7通道，尤其是TRPC3通道或TRPC6通道，特别是TRPC3通道。相应的氨基酸序列为SEQIDNO:1(TRPC3)、，SEQIDNO:5(TRPC6)和SEQIDNO:9(TRPC7)，特别是编码TRPC3通道的^J^紗列SEQIDNO:1。相应的核苷酸序列为SEQIDNO:2(TRPC3)、SEQIDNO:6(TRPC6)和SEQIDNO:10(TRPC7)，特别是编码TRPC3通道的核苷酸序列SEQIDNO:2。本发明的术语"失活突变体"指作为阳离子通道功能性失活，但能抑制同源的天然存在TRPC通道的通道活性的突变体。可以这样实现抑制替换天然多聚通道集群中的TRPC通道亚基，以达到使细胞膜中所有天然存在的TRPC通逸基本上都含有突变通道亚基，或者完全被突变通道替换。使通道亚基失活的突变可以优选位于的TRPC3的孔隙区内(SEQIDNO:1中的樣酸603-645)、TRPC6的孔隙区内(SEQIDNO:5中的#^酸660-705)和TRPC7的孔隙区内(SEQIDNO:9中的#^酸610-650)。具体实例为具有氨基酸序列SEQIDNO:3的突变TRPC3通道(TRPC3DN)、具有氨基酸序列SEQIDNO:7的突变TRPC6通道(TRPC6DN)和具有M酸序列SEQIDNO:11的突变TRPC7通道(TRPC7DN)。编码TRPC3DN的核苷紗列为核苷紗列SEQEDNO:4，编码TRPC6DN的核苷酸序列为核苷酸序列SEQIDNO:8，编码TRPC7DN的核苷酸序列为核苷酸序列SEQIDNO:12。特别优选的实例为具有M^f列SEQIDNO:3的显性负突变体TRPC3DN。编码TRPC3DN的核苷酸序列为核苷酸序列SEQIDNO:4。此外，"失活突变体"可以由TRPC3、TRPC6或TRPC7的任何部分组成，所述部分保留了在蛋白质合成或转运至质膜的任何步骤中与天然存在TRPC通勤目互作用的能力，从而抑制天然存在TRPC通道的功能。这些部分可以是例如TRPC3(SEQIDNO:1)的氨基酸0-302(参阅Balzer等人(1999)Cardiovasc.Res.42:543-549)。可以使用如实施例中示例性描述的完整细胞膜片钳方法检测和/或分析失活突变体。本发明的另一主题涉及TRPC通道、其失活突变体，或者编码该TRPC通道或失活突变体的核苷酸序列用于发现TRPC通道调节剂特别是抑制剂的用途，所述TRPC通道调节剂作为治疗心血管疾病特别是动脉粥样硬化的药物。优选的TRPC通道为TRPC3通道、TRPC6通道或TRPC7通道，尤其是TRPC3通道或TRPC6通道，特别是如上文详细描述的TRPC3通道，一般地，使TRPC通道或其失活突变体，或者编码该TRPC通道或失活突变体的核苷酸序列接触测试化合物，并测量或检测该测试化合物对TRPC通道或其失活突变体，或者编码该TRPC通道或失活突变体的核普酸序列对测试化合物的影响。本发明的术语"TRPC通道调节剂"指TRPC通道的调节分子("调节剂")，尤其是抑制或激活分子("抑制剂"或"激活剂")，特别是可按照本发明测定法鉴定的TRPC通道抑制剂。抑制剂一般是例如结合以部分或完全阻断其活性、降低、阻止、延迟激活、失活、脱敏或减量调节至少一种如上文详细描述的TRPC通道中的至少一种的活性或表达的化合物，激活剂一般是例如提高、打开、激活、促进、增强其活性、使其敏感、激动或增量调节如上文详细描述的TRPC通道中的至少一种活性或表达的化合物。这些调节剂包括遗传修饰形式的TRPC通道，优选TRPC通道的失活突变体如TRPC3DM以及天然存在或合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、核酶、小有机分子等。测量TRPC通道活性的实例为包含以下步骤的测定法(a)接触表达TRPC通道的萸光细胞，(b)在使荧光细胞接触调节剂或测试化合物之前、同时或之后通过通道激活剂刺激Ca"内向通量，以及(c)测量或检测荧光的改变。在下文和实施例中描述了该测定的其他细节以及备选或优选实施方案。因此，本发明的另一主题涉及TRPC或其失活突变体，或者编码该TRPC或失活突变体的核苷酸序列的调节剂的筛选方法，其中该方法包含以下步骤(a)接触表达TRPC通道或其失活突变体的细胞，(b)在使该细胞接触测试化合物之前、同时或之后通过通道激活剂刺激Ca"内向通量，以及(c)测量或检测TRPC通道活性的改变。在优选的实施方案中，该方法还包含以下步骤(d)通过比较不存在测试化合物时TRPC通道活性的改变来选择具有心血管疾病活性的测试化合物。在另一优选的实施方案中，通过诱导型启动子(特别是选自四环素诱导型启动子的启动子)控制细胞中TRPC通道或其失活突变体的表达。在特别优选的实施方案中，细胞为如下文进一步描述的焚光细胞。本发明优选的细胞或细胞系为MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3或CHO细胞，特别是HEK293细胞系。可以通过测量或检测离子通量(特别是Ca"通量)的改变来测量或检测TRPC通道活性，例如通过膜片钳技术、全细胞电流、放射性标记离子通量或特别是荧光，如使用电压敏感性染料或离子敏感性染料(Vestergarrd-Bogind等人(1988)，J.MembraneBiol"88:67-75;Daniel等人(1991)J.Pharmacol.Meth.25:185-193;Hoevinsky等人(1994)J.MembraneBiol"137:59-70;Ackerman等人(1997)，NewEngl.J.Med.，336:1575-1595;Hamil等人(1981)，Pflugers.Archiv"391:185)。这些染料的实例为Di-4-ANEPPS(吡啶4-(2(6-(二丁基氨)-2-萘基)乙烯基)-l-(3-磺丙基)氢氧化物)、CC-2-DMPE(1，2-双十四酰-sn-甘油基-3^酸乙醇胺三乙基铵)、DiSBAC2(二-(1，2-二巴比妥酸)-三甲基化氧杂菁)、0188厶€3((二-(1，3画二巴比妥酸)-三甲基化氧杂華)、SBFI-AM(1，3-&羧酸，4，4，-1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基二(5-甲氧基-6，12-苯并呋喃二基)I二-(四-(乙酖基氧)甲基l酯))、fluo3am(l-[2-狄-5-(2，7-二氯_6_羟基_3_氧_9-咕吨基)苯氧基-2-(2，-氨基-5，-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)、fluo4am(1-2-#^-5-(2，7-二氯-6-羟基-4-氧-9-站化基)苯氧基-:2-P，-氨基-S，-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)或furahm(1-2-(5，-羧基唑-2'-基)-6-氨基苯并呋喃-5-氧卜2-(2'-氨基-5'-甲基-苯氧基)-乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)。通道激活剂的实例为二酰基甘油，特别是l-油基-2乙酰基-sn-甘油(OAG)、Gq偶联的受体激动剂如去甲肾上腺素，特别是胰蛋白酶、刺激受体酪氨酸激酶的激动剂如表皮生长因子(EGF)或产生二酰基甘油的酶如磷脂酶或其激活剂'通道激活剂特别是OAG可用于直接刺激TRPC通道，这是本发明测定与间接的受体介导通道激活相比的额外优势，因为例如在本发明的测定中显著降低了假阳性结果率。一般而言提供这样的细胞其在诱导型启动子(如上文所述)下表达TRPC通道或其失活突变体。可以使用本领域技术人员已知并如实施例中所述的遗传方法产生这些细胞，诱导TRPC通道或其失活突变体表达之后，一般将细胞接种在如微量滴定板中并培养。通常细胞生长并固定在多孔板的底部。其后通常洗涤细胞并在适当的上样緩沖液中加入染料，优选荧光染料如fluo4am。去除加样緩冲液之后，将细胞与测试化合物或调节剂一起孵育，特别是与上述生物化学或化学测试化合物(例如化合物文库的形式)一起孵育。4吏用如荧光成像读板仪(FLIPR)进行Ca2+测量。为了刺激通过TRPC通道的Ca"内向流量，一般应该使用通道激活剂如OAG。作为TRPC通道活化的备选模式，可以使用胰蛋白酶作为Gq偶联的受体激动剂。抑制剂的预期效应将是如荧光增加的降低。激活剂将会引起例如激活剂引发荧光的进一步增加或诱导如非激活剂依赖性的荧光增加。其后，可以分析和/或分离适当的调节剂，特别是抑制剂。为了筛选化合物文库，优选使用高通量测定法，这是本领域技术人员已知并市售的。本发明的术语"化合物文库"指组合自任何多种来源的多种化合物，包括化学合成的分子和天然产物或组合化学文库。有利地在阵列上和/或机器人系统中进行本发明方法，例如包括机器人点板和机器人液体转移系统，如使用微流控技术即孔道结构的机器人系统。在本发明的另一实施方案中，以高通量筛选系统的形式进行该方法。在这样的系统中，筛选方法有利地是自动化和小型化的，特别是使用小型化孔和机器y^控制的微流控技术。在特别优选的实施方案中，在细胞系中进行本发明的测^/方法，所述细胞系含有如上文详细描述的诱导型启动子控制下的TRPC通道基因，其中通道激活剂是溶解了的。例如优选在血清白蛋白如牛血清白蛋白或钚酸存在下溶解激活剂OAG.本发明的另一主题涉及制备用于治疗动脉粥样硬化的药物的方法，其中该方法包含以下步骤(a)进行如上文所述的方法，(b)分离检测到的适于治疗心血管疾病特别是动脉粥样硬化的测试化合物，以及(C)配制检测到的测试化合物与一种或多种可药用载体或辅助物质。可药用栽体或辅助物质为例如生理緩冲溶液如氯化钠溶液、去矿质水、稳定剂如蛋白酶或核酸酶抑制剂，或者掩蔽剂如EDTA。以下的图表、序列和实施例将解释本发明而不限制本发明的范围。附图简述图1A和1B显示TRPC3DN不搬运功能性离子流。图2A和B显示TRPC3DN对TRPC3和TRPC6的显性负效应。图3显示TRPC3DN对动脉粥样硬化兔颈动脉中乙酰M诱导的血管反应性的效应。图4显示表达TRPC3DN的颈动脉区段中流动诱导的血管反应性的超声波评估'图5显示表达TRPC3^的颈动脉区段中动脉粥样硬化斑的大小。图6显示TRPC3Dw表M动脉粥样硬化颈动脉中平均巨噬细胞密度的影响。图7A和7B显示使用FLIPR技术在可诱导TRPC3和TRPC6的细胞系中检测OAG激活的Ca"信号。图8A和8B展示FLIPR测定的SKF96365在强力霉素诱导的细胞系中TRPC3和TRPC6抑制的IC50。序列表描述SEQIDNO:1显示TRPC3的^J^,列；SEQIDNO:2显示编码TRPC3的核苷酸序列；SEQIDNO:3显示显性负TRPC3通道(TRPC3DN)的完整M^列(突变氨基酸为粗体)；SEQIDNO:4显示TRPC3^的完整核苷酸序列(突变核苷酸为粗体);SEQIDNO:5显示TRPC6的^J^^列；SEQIDNO:6显示编码TRPC6的核苷酸序列；SEQIDNO:7显示显性负TRPC6通道(TRPC6DN)的完整M^列(突变絲酸为粗体)；SEQIDNO:8显示TRPC6DN的完整核苷酸序列(突变核苷酸为粗体)；SEQIDNO:9显示TRPC7的^J^^^列；SEQIDNO:10显示编码TRPC7的核苷酸序列；SEQIDNO:11显示显性负TRPC7通道(TRPC7DN)的完整氨基酸序列(突变氛基酸为粗体)；SEQIDNO:12显示TRPC7DN的完整核苷酸序列(突变核苷酸为粗体)。实施例1.TRPC3DN的构建和功能特性为了在体外和体内研究TRPC通道的功能，我们使用显性负通道突变体来调节天然TRPC通道的活性。之前已经证明了该方法对于TRPC通道的可用性(Hofmann等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，99，7461-7466)。我们通过定位诱变将野生型人TRPC3(NP_003296)的M酸621-623改变为丙氨酸来产生显性负TRPC3通道(TRPC3DN)。使用gateway冲支术(Invitrogen，Karlsruhe,德国)将插入片段克隆进4务饰的pcDNA3栽体骨架上。在该研究中使用表达毒萆碱性Mr受体的HEK293林系(HM1细胞)(Peralta等人(1988)Nature,334，434-437)。在5.5%(:02中，在补充了10%胎牛血清、2mM谷氨跣胺、100U/ml青霉素、100|ig/ml链霉素(Invitrogen,Karlsruhe,德国)的DMEM/F12(1:1)中37匸培养细胞。在生长培养基中加入G418(0.5mg/ml)。使用LipofectAMINE2000(Invitrogen,Karlsruhe,德国)按照生产商的说明转染hTRPC3(U47050)、hTRPC6(AF080394)、TRPC3DN和eGFP(pEGFP誦Nl，BDBiosciences,PaloAlto，CA)或YFP标{己形式的通道蛋白的cDNA。对于电生理实验，在35mm皿中用指定量的cDNA转染细胞并在转染后12-24小时转移到盖玻片上。转移后24-48小时使用细胞。如果没有另行说明，则共转染0.4將eGFP作为膜片钳实验的表达标记物。室温下4吏用HEKAEPC10膜片钳放大器和PULSE软件(HEKA，Lambrecht，德国)记录来自荧光细胞的全细胞电流。由硼硅玻璃拉出在标准细胞外緩冲液中电阻为2-5MQ的膜片移液管。保持电位设置为-70mV，以6.6kHz采集从-100至+60mV的160ms电压斜线上升的电流。在2kHz滤过所有记录。标准外部緩冲液^^有(以mM计)NaCl140、KCI5.4、CaCl22、MgCl2l、葡萄糖IO、HEPESIO,用NaOH将pH调整为7.4。标准移液緩冲液含有(以mM计)CsOH120、葡糖酸120、MgCl22、CaCl23、Cs4-BAPTA5、HEPES10，用葡糖酸将pH调整为7.3。游离[Ca2+使用CaBuf程序(GDroogmans，KULeuven)计算为200nM。通过使用10jiM氨甲酰M在HM1细胞中引发受体激活的电流。所有的统计学数据均表达为均值±SEM。使用SigmaStat(SPSS,Chicago,IL)进行统计学分析。使用Mann-Whitney秩和检验合并结果并分析。显著性水平设置为p<0.05。1.1TRPC3Dw不摘t运功能性离子流。为了确定TRPC3卵发挥负TRPC通道调节剂的作用，通过全细胞膜片钳研究通道突变体的功能特性。图1A和1B显示了来自转染了3ngTRPC3或TRPC3DN的HMl细胞的代表性电流记录。通过乙酰胆碱受体激动剂氨甲酰胆碱(10jiM)引发TRPC电流。在之前(con)和氨甲酰M存在下(carb)记录电流。平均而言，表达TRPC3DN的细胞的电流密度(1.3pA/pF，n=11)与转染作为阴性对照的LacZ的细胞(1.2pA/pF，n=10)没有差异。与图1A和图1B显示的记录一致，转染作为阳性对照的TRPC3的细胞显示明著更高的电流密度(11.2pA/pF，n=11;p<0.001)。因此，TRPC3dn不搬逸明显的离子电流。之前的研究提示TRPC3与其自身以及TRPC6和TRPC7直接相互作用(Hofmann等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，99，7461-7466)。因此，通过与野生型TRPC3和TRPC6通道一起共表达来测试TRPC3DN的调节效应。1.2TRPC3卵对TRPC3和TRPC6的显性负效应根据图2A，用7jigTRPC3-YFP和7吗LacZ(作为对照，空心柱)或7吗TRPC3DN(灰色柱)共转染HM1细胞。根据图2B，如图2A用7吗TRPC6-YFP和LacZ或TRPC3DN共转染HM1细胞。在-70mV测量氨甲跣M诱导的电流，归一化为细胞容量.TRPC3DN显著(*"p<0.001)抑制通过TRPC3和TRPC6的电流。2.TRPC3DN的体内抗动脉粥样硬化效应如图2A和图2B所示，TRPC3^对TRPC3和TRPC6通道赋予显性负影响.基于序列同源性和之前的报道(Hofmann等人(2002)，见上文)，可以推测同源TRPC7通道也被TRPC3DN抑制。为了研究TRPC3DN表达以及因此TRPC3、TRPC6和TRPC7对动脉粥样硬化的抑制，使用病毒基因将TRPC3DN转移至动脉粥样硬化兔的血管。用带有TRPC3卵或作为对照的eGFP的病毒感染颈动脉。基因转移后8周，通过功能和组织学M评估疾病状态。2.1病毒产生和动物研究大自产生、扩增并纯化编码TRPC3显性负突变体的腺病毒。其后通过DNA测序(Medigenomix,Martinsried，德国)检查序列的正确性并通过Western印迹确认蛋白质的特异性表达，用含有1%胆固醇+5%玉米油的食物喂养20周龄的白色新西兰兔。喂养一周后，通过基于导管的病毒基因转移(见下文)诱导转基因表达，在实验全程中继续胆固醇喂养。每组至少独立研究8只动物。在开始喂养前、刚好在基因转移前和基因转移2、4和8周后评估血清胆固醇水平。在专门进行兽医血清测量的有效实验室(Synlab，Augsburg，德国)中进行测量。还^^用标准技术测定LDL和HDL亚级分。在测量的所有时间点(每组n-8)上对照与接受TRPC3DN的动物相比，血清胆固醇、LDL或HDL胆固醇均未观察到显著差异(p>0.05)。2.2将内皮基因转移至颈动脉为了将基因转移至颈动脉，产生颈部正中切口并暴露左侧总动脉。用两个小无创夹(BIEMER血管夹，FD561R)分离4cm的区段。通过小针(0.4x20)将约0.2mlTRPC3dn或eGFP病毒溶液(效价101。pfu)注射进分离的区段。孵育时间为20分钟。接着去除夹子并恢复血液循环。缝合颈部创口并使动物复元。兔在手术后72小时镇痛(Temgesic,定丙诺啡，每12小时皮下注射0.01mg/kg)。2.3测量内皮血管反应性在实验的最后，基因转移8周后，通过颈动脉的高分辨力超声波测定基础血管;|*和乙酰M诱导的血管反应性。在转导了TRPC3DN(阴影柱)或eGFP(空心柱)的动脉粥样硬化兔(图3)以及使泉(非动脉粥样硬化)兔(实心柱)的颈动脉区段上进行腔管直径的体内测量。在注射给定剂量的乙跣胆碱之后每分钟测量4次乙酖M诱导的血管反应性。与表达eGFP的区段相比，TRPC3卵表达显著提高了乙酰胆碱诱导的血管反应性(***p<0.001)。与健康对照相比，在表达eGFP的区段中观察到血管反应性的降低(#p<0.01)。在第二种实验设置中，测试了应答于施用氯化钠溶液的流动诱导的血管反应性(图4)。在转导了TRPC3DN(阴影柱)或eGFP(空心柱)的动脉粥样多更化兔以及健康(非动脉粥样硬化)兔(实心柱)中测量颈动脉区段的腔管直径，在施用100ml氯化钠的过程中(应用5分钟)测试流动诱导的血管反应性。显示了注入80ml后和应用总体积1-2分钟后进行的测量。与表达eGFP的区段相比，TRPC3DN表达显著提高了流动诱导的血管反应性(**p<0.01)。2.4测定动脉粥样硬化的组织学标记物为了在组织学上评估疾病^A，用肝素注射动物并处死。在会厌远侧从胸骨剪下约lcm的颈动脉。用盐水沖洗血管，小心干燥并急冻。从中央区域剪下一片动脉用于研究GFP表达、HE和vanGieson染色以及免疫组织化学。余下的动脉用于Sudanmacrostaining以检测液体斑。就该目的而言，在用盐水灌洗血管2分钟并在中间纵向切开之后直接诱导苏丹红染色。其后将血管转移至苏丹染色液(溶于乙醇和丙酮的苏丹III)。通过苏丹红染色测定相对斑大小，其后进行转导TRPC3dn或eGFP的颈动脉区段的组织造影分析(图5)。评估(在左侧动脉)接受TRPC3DN的兔的右侧颈动^c作为未处理对照。与eGFP(**p<0.01)和未处理(*p<0.05)对照相比，TRPC3DN降低了斑的大小。作为动脉粥样硬化iL艮的另一标志物，通过免疫细胞化学研究血管内膜的巨噬细胞渗入.对于组织染色，从通过除去脂肪制备的所有血管的中间切下6pm的切片。室温下用丙酮固定切片IO分钟并风干。接着用100%甲醇中0.6%的11202进行透化5分钟，用PBS洗涤三次并与20%兔血清一起孵育。接着在20X:将切片与抗巨噬细胞单克隆抗体(1:100，克隆RAM-ll，DAKO，Hamburg,德国)孵育20-30分钟并用PBS洗涤三次。接着在20匸将其与适当的生物素标记的第二抗体孵育30分钟，再用PBS洗涤三次，其后将切片与ABC试剂孵育30分钟、用PBS洗涤并用二M联苯胺和11202染色IO分钟。其后用Harris/苏木精/伊红进行复染。通过标准化计数程序在高倍放大(一般为600倍)下直接计数每个切片中血管内膜的单个阳性细胞数来进行分析(图6)。通过在表达TRPC3卵或eGFP的颈动脉内膜层的免疫细胞化学来鉴定巨噬细胞，与表达eGFP的血管相比，TRPC3DN引起巨噬细胞渗入的显著降低(*p<0.05)。3.高通量鉴定TRPC3、TRPC6和TRPC7调节剂的测定法为了开发鉴定TRPC通道调节剂的测定法，使用Flp-InT-Rex系统(Invitrogen，Karsruhe，德国)产生在诱导型启动子控制下表达TRPC3(登录号U47050)或TRPC6(登录号AF080394)cDNA的重组HEK293细胞系。通过标准4支术扩增通道cDNA并克隆进pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen，Karlsruhe,德国)。用通道构建体转染Flp-InT-Rex293细胞之后，用潮霉素选择稳定细胞系。按照生产商的说明维持细胞并加入1將/ml强力霉素诱导通il^达20-30小时。在实验前20-30小时以40000-50000个细胞/孔的密度将细胞铺在用多聚d-赖氨酸包被的96孔黑壁透明底微量滴定板(BDBiosciences,Bedford,MA)上。接着在室温下洗涤细胞并在含有lxHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES、0.02%普流尼克F-127(MolecularProbes)和0.05V。牛血清白蛋白(pH=7.4)的緩沖液中加入2nMfluo4am(MolecularProbes,Eugene,OR)30-45分钟。去除加样緩冲液并在室温下将细胞与测试化合物孵育10分钟。使用96孔荧光成像读板仪(FLIPR)(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)进行Ca2+测量。为了刺激通过TRPC3或TRPC6的Ca2+内向通量，我们以30-50的终浓度使用通道激活剂l-油基-2-乙酰基-sn-甘油(OAG)(Hofmann等，1999)。将OAG溶于含有lxHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES、0.02%普流尼克F-127(MolecularProbes)(pH=7.4)的緩沖液中并加入细胞。或者可以将OAG溶于含有lxHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES和0.1%牛血清白蛋白(pH=7.4)的緩冲液中。图7A和7B显示仅在强力霉素处理的细胞中观察到对OAG的应答，而在未诱导细胞中则没有。因此，该结果证明OAG激活的Ca"信号分别通过TRPC3或TRPC6特异性介导，使用FLIPRII测量^^fluo-4的细胞的荧光变化。条带代表应用50HMOAG。显示的是各来自9个孔的平均荧光值±SEM。荧光值对平均基线荧光(FJ进行归一化。为了用上述测定法鉴定TRPC3或TRPC6的调节剂，使用诱导细胞并在应用OAG之前或之后将测试化合物加入孔中。抑制剂的预期效应将是荧光增加的降低。通道激活剂将引起OAG激发的信号的进一步增加或诱导OAG依赖性荧光增加.SKF96365(l-(j5-[3-(4-甲緣苯基)丙Hij國4國曱氧基苯乙基)-lH-咪唑-HCl)已被描述为非选择性阳离子通道(包括TRPC3和TRPC6)的抑制剂(Boulay等人(1997)，J.Biol.Chem.，272，29672-29680;Zhu等人(1998)，J.Biol.Chem.，273，133-142)。如图8A和8B所示，SKF96365在表达TRPC3的细胞中抑制OAG激活的荧光应答，ICS0为1.8±0.12jiM(n=8)，在表达TRPC6的细胞中IQo为5.04±0.17jiM(n=8)。因此，给定的实施例证明了该测定法鉴定TRPC3和TRPC6调节剂的能力。在给定浓度的SKF96365存在下，测量表达TRPC3和TRPC6的细胞中30pMOAG诱导的荧光变化。显示的是平均抑制值士SEM。抑制表示为SKF96365不存在的对照荧光的百分比。将剂量应答曲线与通用剂量应答方程拟合。Spline曲线*与复合数据的最佳拟合。作为TRPC3和TRPC6通道激活的备选模式，使用蛋白酶激活的受体激动剂胰蛋白酶(200nM)诱导Flp-InT-REx-TRPC3和Flp-InT-REx-TRPC6细胞。该处理示例了使用Gq偶联的受体激动剂刺激TRPC3或TRPC6。与未诱导的对照相比，在应用后t-60秒胰蛋白酶在受诱导的Flp-InT-REx-TRPC3和Flp-InT-REx-TRPC6细胞中诱导显著更强的荧光增加(表l)。因此，Gq偶联的受体激动剂如胰蛋白酶也可用于刺激TRPC3和TRPC6应答的测定法。表1:经诱导和未诱导的Flp-InT-REx-TRPC3和Flp画InT-REx-TRPC6细胞中应答于200nM胰蛋白酶的荧光变化(F/Fo)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>数值以平均值土SEM给出。经诱导和未诱导组显著不同(p<0.001，t检验)。SEC2工DNO:1megspslrrmtvmrekgrrqavrgpafmfndrgts;ltaeeerfldaaeygn工pvvrkmleesktlnvncvdymgqnalqlavgnehlevtelllkkenlar工gdallla工skgyvr工vea工lnhpgfaaskrltlspceqelqdddfvaydedgtrfspditpiil^ahcqkyewhmllmkgarierphdyfckcgdcmekqrhdsfshsrsr工naykglaspaylsiissedpvltale;lsnelakl認工ekejkndyrklsmqckdfwgvldlcrdseevea工lngmiesaeplevhrhkaslsrvkla工kyevkkfvahpncqqqklt工wyenlsglreqt工a工kclwlwalglpfla工gyw工apcsriigkilrspfmkfvahaasfiiflgijlvfnasdrfegittijpltitvtdypkqifrvkttqbtwtemlimvwviigmMWSECKELWIjEGPREYIIiQIjWNVLDFGMLSIF工AAFTARFLAFLQATKAQQYVDSYVQESDLSEVTIiPPE工QYFTYARDKWI1PSDPQ工工SEGL1YAIAVVI1SFSRIAYILPANESFGPI1G工SLGRTVKD工FKFMVLFIMVFFAFM工GMF工ljYSYY:LGAKVNAAFTTVEESFKTIjFWS工FdHiSEVTSWLKYDHKFIEN工GYVLYGIYNVTMWVLiLNML!工AM工NSSYQE工EDDSDVEWKFARSKIiWLSYFDDGKT;LPPPFSLVPSPKSFVYF工MR工WFPKCRRRRLQKD工EMGMGNSKSRLNLFTQSNSRVFESHSFNS工LNQPTRYQQ工MKRLIKRYVLKAQVDKENDEVNEGELKEIKQD工SSLRYELLEDKSQATEELAIL工hklseklnpsmlrceSEQ工DNO:2ATGGAGGGAAGCCCATCCCTGAGACGCATGACAGTGATGCGGGAGAAGGGCCGGCGCCAGGCTGTCAGGGGCCCGGCCTTCATGTTCAATGACCGCGGCACCAGCCTCACCGCCGAGGAGGAGCGCTTCCTCGACGCCGCCGAGTACGGCAACATCCCAGTGGTGCGCAAGATGCTGGAGGAGTCCAAGACGCTGAACGTCAACTGCGTGGACTACATGGGCCAGAACGCGCTGCAGCTGGCTGTGGGCAACGAGCACCTGGAGGTGACCGAGCTGCTGCTCAAGAAGGAGAACCTGGCGCGCATTGGCGACGCCCTGCTGCTCGCCATCAGCAAGGGCTACGTGCGCATTGTAGAGGCCATCCTCAACCACCCTGGCTTCGCGGCCAGCAAGCGTCTCACTCTGAGCCCCTGTGAGCAGGAGCTGCAGGACGACGACTTCTACGCTTACGATGAGGACGGCACGCGCTTCTCGCCGGACATCACCCCCATCATCCTGGCGGCGCACTGCCAGAAATACGAAGTGGTGCACATGCTGCTGATGAAGGGTGCCAGGATCGAGCGGCCGCACGACTATTTCTGCAAGTGCGGGGACTGCATGGAGAAGCAGAGGCACGACTCCTTCAGCCACTCACGCTCGAGGATCAATGCCTACAAGGGGCTGGCCAGCCCGGCTTACCTCTCATTGTCCAGCGAGGACCCGGTGCTTACGGCCCTAGAGCTCAGCAACGAGCTGGCCAAGCTGGCCAACATAGAGAAGGAGTTCAAGAATGACTATCGGAAGCTCTCCATGCAATGCAAAGACTTTGTAGTGGGTGTGCTGGATCTCTGCCGAGACTCAGAAGAGGTAGAAGCCATTCTGAATGGAGATCTGGAATCAGCAGAGCCTCTGGAGGTACACAGGCACAAAGCTTCATTAAGTCGTGTCAAACTTGCCATTAAGTATGAAGTCAAAAAGTTTGTGGCTCATCCCAACTGCCAGCAGCAGCTCTTGACGATCTGGTATGAGAACCTCTCAGGCCTAAGGGAGCAGACCATAGCTATCAAGTGTCTCGTTGTGCTGGTCGTGGCCCTGGGCCTTCCATTCCTGGCCATTGGCTACTGGATCGCACCTTGCAGCAGGCTGGGGAAAATTCTGCGAAGCCCTTTTATGAAGTTTGTAGCACATGCAGCTTCTTTCATCATCTTCCTGGGTCTGCTTGTGTTCAATGCCTCAGACAGGTTCGAAGGCATCACCACGCTGCCCAATATCACAGTTACTGACTATCCCAAACAGATCTTCAGGGTGAAAACCACCCAGTTTACATGGACTGAAATGCTAATTATGGTCTGGGTTCTTGGAATGATGTGGTCTGAATGTAAAGAGCTCTGGCTGGAAGGACCTAGGGAATACATTTTGCAGTTGTGGAATGTGCTTGACTTTGGGATGCTGTCCATCTTCATTGCTGCTTTCACAGCCAGATTCCTAGCTTTCCTTCAGGCAACGAAGGCACAACAGTATGTGGACAGTTACGTCCAAQAGAGTGACCTCAGTGAAGTGACACTCCCACCAGAGATACAGTATTTCACTTATGCTAGAGATAAATGGCTCCCTTCTGACCCTCAGATTATATCTGAAGGCCTTTATGCCATAGCTGTTGTGCTCAGCTTCTCTCGGATTGCGTACATCCTCCCTGCAAATGAGAGCTTTGGCCCCCTGCAGATCTCTCTTGGAAGGACTGTAAAGGACATATTCAAGTTCATGGTCCTCTTTATTATGGTGTTTTTTGCCTTTATGATTGGCATGTTCATACTTTATTCTTACTACCTTGGGGCTAAAGTTAATGCTGCTTTTACCACTGTAGAAGAAAGTTTCAAgactttattttggtcaatatttgggttgtctgaagtgacttccgttgtgctcaaatatgatcacaaattcatagaaaatattggatacgttctttatggaat^tacaatgtaactatggtggtcgttttactcaacatgctaattgctatgattaatagctcatat'caagaaattgaggatgacagtgatgtagaatggaagtttgctcgttcaaaactttggttatcctattttgatgatggaaaaacattacctcca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293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3或CHO细胞。21.根据权利要求15-20中任一项的方法，其中通过测量或检测离子通量，特别是Ca"通量来测量或检测TRPC通道活性，其中优选通过膜片钳技术、全细胞电流、放射性标记离子通量或特别是使用电压敏感性染料或离子敏感性染料通过荧光进行所述测量或检测。22.根据权利要求15-21中任一项的方法，其中所述通道激活剂为选自以下的化合物二酰基甘油，特别是l-油基-2乙B5^-sn-甘油(OAG)、Gq偶联的受体激动剂，特别是去氧肾上腺素，尤其;U4蛋白酶、刺激受体酪氨酸激酶的激动剂，特别是表皮生长因子(EGF)或者产生二酰基甘油的酶，特别^1磷脂酶或其激活剂。23.根据权利要求15-22中任一项的方法，其中所述TRPC选自TRPC3、TRPC6、TRPC7或其失活突变体。24.根据权利要求23的方法，其中所述失活突变体为具有M^列SEQIDNO:3的TRPC3dn、具有^J^酸序列SEQIDNO:7的TRPC6DN或具有M酸序列SEQIDNO:11的TRPC7DN。25.根据权利要求15-24中任一项的方法，其中以化合物文库的形式提供所述测试化合物。26.根据权利要求15-25中任一项的方法，其中在阵列上进行所述方法，27.根据权利要求15-26中任一项的方法，其中在机器人系统上进行所述方法。28.根据权利要求15-27中任一项的方法，其中所述方法为所述测试化合物的高通量筛选方法。29.根据权利要求15-28中任一项的方法，其中检测的测试化合物为抑制剂。30.根据权利要求15-29中任一项的方法，其中将所述细胞接种在多孔测试平板的孔中。31.制备用于治疗心血管疾病的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤(a)进行根据权利要求15_30中任一项的方法，(b)分离检测到的适于治疗心血管疾病的测试化合物，以及(c)配制检测到的测试化合物与一种或多种可药用栽体或辅助物质。32.根据权利要求15-31中任一项的方法，其中所述心血管疾病为动脉粥样硬化。全文摘要本发明涉及TRPC通道、其失活突变体，或者编码该TRPC通道或失活突变体的核苷酸序列用于制备治疗心血管疾病的药物的用途，以及筛选TRPC通道或其失活突变体的调节剂的方法。文档编号G01N33/50GK101098709SQ200580046521公开日2008年1月2日申请日期2005年12月23日优先权日2005年1月12日发明者C·斯特鲁冰申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司