专利名称：白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱及其建立方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种指纹图谱，特别涉及一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱及其建立方法和应用。
背景技术：
中药是多种成分针对多个靶点叠加起作用，而目前的质控标准是以某种特定成分为指标，随着中药研究的现代化，中药的质量研究逐渐从单一有效成分或指标成分的定性定量分析转向有效成分群分析。目前对白芷的质量控制仅限于对白芷中欧前胡素和异欧前胡素进行含量测定。因此，白芷药材的质量控制，除要建立有效成分欧前胡素、异欧前胡素的含量测定方法，制定含量测定限度外，建立有效成分群的指纹图谱分析方法，更有利于全面掌握药材的质量。中药指纹图谱技术对增加中药质控含量，提高中药工业整体水平，实现中药走向世界，具有非常重要的现实意义。
指纹图谱的作用主要是反应复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。以指纹图谱技术应用为中心，促进中药质量标准的现代化。国家药监局已从中药注射剂开始，要求企业逐步建立指纹图谱质量标准，并将逐步扩大指纹图谱技术的应用范围。结合《中华人民共和国药典》(2005年版)，将进一步修改和完善中药国家标准，增加中药饮片质量标准，体现中药标准的现代化。
目前，白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱还未见报道。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱，对白芷药材质量进行控制。
本发明的另一目的在于提供上述醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法。
本发明的再一目的在于提供上述醇提液有效成分群指纹图谱的应用。
本发明所用的白芷药材为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shanet Yuan的干燥根，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓等功效，是临床常用的解表中药之一。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，包括如下步骤(1)白芷药材的提取精密称取20g白芷药材，加入160ml95％乙醇，回流提取1～2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250ul用甲醇稀释至7.5ml，过0.45um微孔滤膜，滤液供HPLC(高效液相色谱方法)分析。
(2)白芷药材指纹图谱的建立精密吸取滤液20ul，采用高效液相色谱方法进行测定，色谱条件Lichrospher5-C18(250mm×4.6mm)色谱柱；以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20ul，波长254nm，将指纹图谱分为I、II、III区，得到白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱。
为了更好地实现本发明，所述甲醇-水流动相系统0～5min，5％～20％甲醇；5～15mn，20％甲醇；20～30mn，20％～70％甲醇；20～30mn，70％甲醇；30～40mn，70％～90％甲醇，上述甲醇为体积百分比。
一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱通过上述方法得到。
所述白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱是由13个共有指纹峰构成的；其中11号峰为欧前胡素，13号峰为异欧前胡素。
由于11号峰与相邻色谱峰分离较好，峰位较为居中，各样品中所共有且已鉴定出其物质名称(欧前胡素)，因此选取供试品色谱峰中的11号欧前胡素峰为参照峰，其色谱峰相对保留时间和相对峰面积为1。
以11号峰为参照，所述白芷药材指纹图谱的13个共有指纹峰(特征峰)各相对保留时间分别为1号峰0.031～0.034；2号峰0.086～0.088；3号峰0.607～0.649；4号峰0.658～0.665；5号峰0.704～0.708；6号峰0.730～0.739；7号峰0.749～0.755；8号峰0.810～0.816；9号峰0.842～0.847；10号峰0.856～0.861；11号峰1； 12号峰1.085～1.087；13号峰1.181～1.186。
各共有指纹峰相对峰面积范围分别为
1号峰0.005～0.061；2号峰0.016～0.132；3号峰0.050～0.366；4号峰0.010～0.135；5号峰0.03～0.148； 6号峰0.006～0.153；7号峰0.086～0.328；8号峰0.047～0.105；9号峰0.018～0.059；10号峰0.030～0.113；11号峰1； 12号峰0.251～0.492；13号峰0.304～0.845。
通过白芷不同提取部位与指纹图谱相关的药理实验将白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱分为I、II、III区。所述I区包括1号峰、2号峰；所述II区包括3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰；所述III区包括11号峰、12号峰、13号峰。所述白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的有效成分群为II区和III区；其中II区主要与解热、抗炎、抗内毒素血症作用相关，III区的色谱峰主要与镇痛、镇静作用相关。
上述白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱在白芷药材质量控制中的应用。可用于对白芷进行整体的质量控制，也可作为测定白芷中化学组分的方法和白芷药材的鉴别以及对白芷醇提液有效成分群进行新药开发。
本发明建立了白芷药材醇提液的指纹图谱，并在此基础上对其主要的药效——镇痛、镇静、抗炎、抗内毒素血症作用进行研究，明确了白芷共有指纹峰与药效学的对应关系，建立了能体现白芷药效的有效成分群指纹图谱，使白芷药材质量评价更具科学性。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1、通过对13批不同产地白芷药材进行测定，制定了白芷指纹图谱相应的技术参数，以欧前胡素色谱峰(11峰)作为参照物，计算了其相对保留时间，相对峰面积值，并总结出了每个共有指纹峰相对保留时间范围，相对峰面积范围，可作为白芷指纹图谱分析法的参考数据。
2、从药材整体色谱图入手，选取特征峰，并大致判断其峰位和比例关系，构成白芷药材特有的色谱指纹图谱全貌，使白芷药材的质量控制指标从原有的某几个成份含量的测定，上升为对整个药品内在品质的检测，避免了单一的化学成分检测的缺陷。
3、谱效学的研究使指纹图谱与药效结果相对应起来，白芷镇痛、镇静作用主要与醇提液指纹图谱III区的色谱峰相关，解热、抗炎、抗内毒素血症作用主要是醇提液指纹图谱II区白芷成分的特征峰的作用。
4、本发明所建立的体现白芷药效的有效成分群指纹图谱，为全面评价白芷药材提供了有力的根据。
图1为13个不同产地白芷药材醇提液指纹图谱。
图2为欧前胡素标准品图。
图3为异欧前胡素标准品图。
图4为白芷不同提取部位对热致痛小鼠痛阈的影响图。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。但本发明的实施方式不限于此。
实施例1(1)供试品的制备方法精密称取20g白芷药材，加入160ml95％乙醇，回流提取2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250ul用甲醇稀释至7.5ml，过0.45um微孔滤膜，滤液作为供试品溶液供HPLC分析。分别制得13个不同产地(见表10)的白芷药材的供试品溶液。
(2)白芷药材指纹图谱的建立精密吸取供试品溶液20ul，采用高效液相色谱进行测定，以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20ul，波长254nm，0～5min，5％～20％甲醇，5～15min，20％甲醇20～30min 20％～70％甲醇，20～30min 70％甲醇，30～40min 70％～90％甲醇，流速1ml/min，Lchrospher5-C18(250mm×4.6mm)色谱柱，记录时间40min为最佳色谱条件，建立了13个不同产地白芷醇提液的指纹图谱，确立了13个共有指纹峰。如图1所示。
表1流动相梯度
以11号峰为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间，相对峰面积，见表2、表3、表4表2各共有指纹峰相对峰面积值
表3各共有指纹峰相对保留时间值
表4指纹图谱中共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积范围
实施例2 谱效学的研究白芷不同部位的提取 取5号四川遂宁(未硫熏原药材)白芷干燥根1kg(5号白芷是道地药材，且未被硫熏，做药效比较有代表性)分别以环己烷、乙酸乙酯、丙酮、95％乙醇、甲醇、水2L依次回流提取3小时，每次回流提取后过滤，挥去溶剂，分别得到六个部位，分别是环己烷部位、乙酸乙酯部位、丙酮部位、95％乙醇部位、甲醇部位、水提部位。超临界CO2萃取部位单独经超临界CO2萃取。95％乙醇、甲醇、水物质峰均较少且峰位较低。环己烷部位主要包括醇提液II区色谱峰，乙酸乙酯部位主要包括醇提液III区色谱峰。
镇痛实验研究热板实验即白芷不同提取部位对热致痛小鼠痛阈的影响(图4)、对醋酸致小鼠扭体反应的影响实验(表5)。
镇静实验研究对小鼠自发活动的影响实验(表6)。
抗炎、抗内毒素血症实验研究小鼠腹腔毛细血管通透性实验(表7)、小鼠中暑内毒素血症实验即对小鼠热暴露生存时间和肛温上升速率的影响实验(表8)、对小鼠注射性内毒素模型的影响即对注射LPS产生内毒素血症小鼠存活时间的影响实验(表9)。
如图4所示与吐温-80对照组比较，白芷各提取部位对热刺激所致小鼠疼痛均有一定的抑制作用。给药后15min，环己烷部位就能使小鼠平均痛阈值延长(P＜0.05)，随着时间的推移，作用增强，1个小时直到2个小时后与吐温-80对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)；超临界CO2萃取部位作用及乙酸乙酯部位作用趋势与环己烷部位相似，但比环己烷部位稍弱。丙酮部位起效较慢，在90min后与吐温-80组相比才有显著性差异(P＜0.01)。
表5白芷不同提取部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响
注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01如表5所示各不同提取部位给药组均能对抗醋酸刺激所致的疼痛反应，使小鼠扭体次数明显减少。其中以环己烷部位和超临界CO2萃取部位作用最强，与吐温-80组相比P＜0.01，其次为乙酸乙酯部位和丙酮部位(P＜0.05)。
表6白芷不同提取部位对小鼠自发活动的影响
注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01如表6所示各提取部位均有镇静作用，能显著抑制小鼠的自发活动，其中环己烷部位和丙酮部位作用最强，与对照组相比P＜0.01，其次为超临界CO2提取部位组和乙酸乙酯提取部位组。
表7白芷不同提取部位对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01如表7所示腹腔染料渗出法实验是研究药物抗炎作用的常用实验方法，急性炎症水肿，醋酸能导致小鼠腹腔组织毛细血管通透性的增加。实验结果显示，乙酸乙酯提取部位、丙酮提取、环己烷部位对醋酸致腹膜炎症的伊文思蓝渗出均有显著抑制作用，其中以乙酸乙酯提取部位作用最强，与对照组比较P＜0.01。超临界CO2提取部位没有抑制醋酸致腹膜炎症的伊文思蓝渗出作用。
表8白芷不同提取部位对小鼠热暴露生存时间和肛温上升速率的影响
注与高温对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与吐温-80对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
如表8所示可以看到白芷的三个不同提取部位相对于高温对照组和吐温-80溶剂对照组在减缓肛温上升速率和延长小鼠的生存时间上均表现出很好的效果，其中以乙酸乙酯和丙酮作用最强(P＜0.01)，其次为环己烷提取部位(P＜0.05)。
表9白芷不同提取部位对注射LPS产生内毒素血症小鼠存活时间的影响
注与内毒素对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与吐温-80对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
如表9所示可以看到白芷的环己烷、乙醇、甲醇提取部位在延长动物生存时间上，相对于模型组和吐温-80组均无显著性意义。而水部位、乙酸乙酯和丙酮提取部位相对于内毒素对照组和吐温-80溶剂对照组在延长小鼠的生存时间上均有显著性差异，以水部位、乙酸乙酯效果最好(P＜0.01)，其次为丙酮提取部位(P＜0.05)。而超临界CO2提取部位没有延长注射LPS产生内毒素血症小鼠存活时间的作用。
镇痛、镇静作用以环己烷部位最强，解热抗炎抗内毒素血症作用以乙酸乙酯部位最强。与其对应HPLC图谱(图1)联系分析，可得出白芷镇痛、镇静作用主要与醇提液指纹图谱III区的色谱峰相关，共三个峰包括欧前胡素和异欧前胡素。而解热、抗炎、抗内毒素血症作用主要是醇提液指纹图谱II区之间的白芷成分的特征峰的作用。
白芷指纹图谱II、III区为白芷主要有效成分群，是白芷药材质量控制的重点区域。
表10实验用样品来源及品系
如上所述，可较好地实现本发明。
权利要求
1.一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，包括如下步骤(1)白芷药材的提取精密称取20g白芷药材，加入160ml 95％乙醇，回流提取1～2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250ul用甲醇稀释至7.5ml，过0.45um微孔滤膜，得到滤液；(2)白芷药材指纹图谱的建立精密吸取滤液20ul，采用高效液相色谱方法进行测定，色谱条件以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20ul，波长254nm，Lichrospher5-C18(250mm×4.6mm)色谱柱，将指纹图谱分为I、II、III区，即得到白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述甲醇-水流动相系统0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；20～30min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇，上述甲醇是否为体积百分比。
3.一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱通过权利要求1或2任一项所述的建立方法得到。
4.根据权利要求1所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述白芷药材指纹图谱是由13个共有指纹峰构成的，其中11号峰为欧前胡素，13号峰为异欧前胡素。
5.根据权利要求1所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述白芷药材指纹图谱的13个共有指纹峰的各共有指纹峰相对保留时间分别为1号峰0.031～0.034； 2号峰0.086～0.088；3号峰0.607～0.649；4号峰0.658～0.665； 5号峰0.704～0.708；6号峰0.730～0.739；7号峰0.749～0.755； 8号峰0.810～0.816；9号峰0.842～0.847；10号峰0.856～0.861；11号峰1； 12号峰1.085～1.087；13号峰1.181～1.186；各共有指纹峰相对峰面积范围分别为1号峰0.005～0.061； 2号峰0.016～0.132； 3号峰0.050～0.366；4号峰0.010～0.135； 5号峰0.03～0.148； 6号峰0.006～0.153；7号峰0.086～0.328； 8号峰0.047～0.105；9号峰0.018～0.059；10号峰0.030～0.113；11号峰1； 12号峰0.251～0.492；13号峰0.304～0.845。
6.根据权利要求1所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述I区包括1号峰、2号峰；所述II区包括3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰；III区包括11号峰、12号峰、13号峰。
7.根据权利要求1所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱的有效成分群为II区和III区；所述II区的色谱峰与解热、抗炎、抗内毒素血症作用相关，III区的色谱峰与镇痛、镇静作用相关。
8.权利要求3所述的白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱在白芷药材质量控制中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱及其建立方法和应用，该方法包括白芷药材的提取和醇提液有效成分群指纹图谱的建立，得到白芷药材醇提液有效成分群指纹图谱，将指纹图谱分为三区，II区、III区为主要有效成分群。其中II区主要与解热、抗炎、抗内毒素血症作用相关，III区的色谱峰主要与镇痛、镇静作用相关。本发明建立的指纹图谱重复性高，稳定性好，与药效联系密切，既可作为测定白芷中化学组分的方法，也可作为白芷药材的鉴别和质量控制方法，还可以对白芷醇提液中的有效成分群进行新药开发。
文档编号G01N30/06GK1904606SQ20061003694
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月4日 优先权日2006年8月4日
发明者聂红, 张慧 申请人:暨南大学