专利名称：十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种液相色谱微柱，尤其是涉及一种十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法。
背景技术：
微柱高效液相色谱(Micro-column HPLC)，简称为微柱液相色谱(μ-LC)，是近年来发展起来的一种色谱微分离技术，由于采用了新型的固定相和微型精密加工制造技术，使色谱柱的分离能力大为提高，加之其具有流动相、固定相、样品消耗低和易于与质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)联用或与其它高效液相色谱柱(SEC、IC)组成二维HPLC等优点，使其成为现代色谱界的一大研究热点。它在医药、食品、环境、生物大分子(蛋白质、多肽)分析、神经科学等领域将具有广泛的应用前景(于世林，高效液相色谱方法及应用，北京化学工业出版社，2005.226)。
传统的液相色谱微柱多采用紧密填充法，固定相为微米级的球形填料，流速增大时柱压急剧增大，这对色谱柱和仪器的使用寿命都大有影响。同时制备微尺寸的填充色谱柱，需要很高的装柱技巧；而对于毛细管色谱柱，两端过滤筛板的制备比较困难，成功率低，影响了微柱液相色谱的发展应用。
近年来，高效液相色谱整体柱作为一种新型色谱柱迅速发展起来，整体柱(monolithiccolumn)又称整体固定相(monolithic stationary phase)、连续床(continuous bed)、棒柱(rod)，是在柱管内原位聚合或固定化了的具有连续整体多孔结构材料，可以通过控制反应物配比和聚合条件来得到具有理想孔径分布的整体柱(鲍笑玲，许旭，分析化学，2005，33(11)1653～1658)。其具有制备简单、通透性好、分析速度快、空间利用率高、毋需在柱两端制备筛板等优点。故整体式液相色谱微柱是解决μ-LC发展瓶颈的一个理想方法。
目前，整体式色谱柱主要应用在常规高效液相色谱(采用2.0～4.6mm内径的不锈钢管为柱材)和毛细管电色谱(采用25～250μm内径的熔融石英毛细管为柱材)(E.C.Peters，M.Petro，F.Svec，J.M.J.Fréchet Anal.Chem.1997，693646～3649)以及毛细管液相色谱(采用200～320μm内径的熔融石英毛细管为柱材)(Grafnetter.J，Coufal.P， E，Suchánková J，BosákováZ， J J.of Chromatogr.A，2004，104943-49)，整体式液相色谱微柱报道还较少(Huang X.J.，Wang Q.Q.，Yan H.，Huang Y.，Huang B.L.，J.of Chromatogr.A，2005，1062183～188)。
发明内容
本发明旨在针对现有的液相色谱微柱制备方法存在的影响色谱柱和相应仪器的使用寿命，需要很高的装柱技术，尤其是对于毛细管色谱柱两端过滤筛板的制备比较困难，成功率低等问题，提供一种操作简单、便捷，所得整体式液相色谱微柱通透性好、柱压低、机械强度高、分析速度快，不需在整体柱表面键合其它功能基团即可直接进行μ-LC分离操作，同时可根据需要方便控制整体柱长度的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法。
本发明所采用的技术方案是以甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物为连续整体式柱体骨架，正丙醇和1，4-丁二醇二元混合物为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，反应后用乙腈将致孔剂和交联度低的的聚合物冲洗出制备整体式液相色谱微柱的方法。所得整体柱不需键合其它功能基团即可直接在μ-LC下进行分离应用。
本发明的反应过程如下1)毛细管内壁活化 2)毛细管内壁预聚合 3)交联聚合 其交联体系结构示意如下
本发明的步骤如下1)毛细管内壁活化依次用丙酮、盐酸、二次水、NaOH溶液、二次水清洗活化毛细管内壁，氮吹干燥，使毛细管内壁获得丰富的游离型硅羟基；2)毛细管内壁的预聚合在毛细管内壁键合一层带烯基的硅烷化试剂γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)；3)制备甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱反应混合物包括反应单体混合物、引发剂和致孔剂，按质量百分比(下同)反应单体混合物占整个反应混合物的40％～70％，反应单体混合物中的甲基丙烯酸十八烷基酯(OMA)与乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)的含量比例为OMA为69.5％～39.5％，EDMA为29.5％～59.5％，引发剂偶氮二异丁腈为反应单体混合物的0.5％～3％；其余为致孔剂，致孔剂为由正丙醇和1，4-丁二醇构成的二元混合物，按比例称取OMA、EDMA、致孔剂和引发剂，混合氮吹超声震荡脱气后注入已预键合的毛细管中，一端封口，超声震荡后封住另一端，水浴中反应，用高压泵驱动乙腈冲洗后即得到多孔结构的连续整体式液相色谱微柱，可在μ-LC模式下对其进行色谱评价。
在步骤1)中，所述的毛细管内壁依次用丙酮清洗15～30min，1mol L-1NaOH冲洗0.5～3h，二次水冲洗0.5h，0.1mol L-1HCl在50～70℃下冲洗2h，二次水冲洗0.5h，然后置于气相色谱柱温箱中，120～300℃，最好160℃缓慢氮吹过夜，尔后两端封口并置于干燥器中保存，使毛细管内壁获得丰富的游离型硅羟基。
在步骤2)中，所述的毛细管内壁的预聚合是按体积百分比(V/V)用加入0.25％～0.5％的有机酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)注入经过活化干燥的毛细管内，两端封口，室温过夜，然后用氮气吹扫30min，重复一次，最后用氮气吹扫0.5～3h。有机酸为乙酸或甲酸。
在加入0.25％～0.5％有机酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)注入毛细管前，通氮同时超声震荡脱气除氧。
在步骤3)中，致孔剂中的正丙醇和1，4-丁二醇的含量按百分比为正丙醇∶1，4-丁二醇＝70％∶30％；混合液注入已预键合的毛细管中，一端封口后超声震荡脱气的时间为15～30min，然后封住另一端，水浴中反应，水浴温度为50～70℃，水浴中反应时间为15～24h，然后截成适当长度，用高压泵驱动乙腈冲洗5～10h后即可得到多孔结构的连续整体式液相色谱微柱。
本发明以甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯为柱体骨架，以正丙醇和1，4-丁二醇的二元混合物为致孔剂，在熔融硅毛细管中原位合成了整体式液相色谱微柱。当清洗活化毛细管内壁后，在一定温度下缓慢氮吹干燥过夜，使毛细管内壁获得丰富的游离型硅羟基。然后注入带烯基的硅烷化试剂γ-MAPS，并加入干燥的有机酸(甲酸或乙酸)为催化剂，使得γ-MAPS与内壁的硅羟基有较大的键合度，因此可有更多的双键作为锚位和随后加入的单体混合物共聚，使得柱体和毛细管紧密相连，两端无需使用过滤筛板。所得柱材料具有提供流动相快速传递的通孔和提供分离场所的微孔的双孔结构，可通过控制反应物配比和聚合条件来获得理想的孔径分布。本发明操作简单便捷，所得整体式液相色谱微柱通透性好、柱压低、机械强度高、分析速度快，不需在整体柱表面键合其它功能基团即可直接进行μ-LC分离操作，同时可根据需要方便控制整体柱的长度。
图1为实施例1整体柱的扫描电镜图。
图2为柱体和管壁连接处的扫描电镜图。
图3为实施例2反应单体混合物/致孔剂不同比例所得整体柱的扫描电镜图。
图4为实施例3反应单体/交联剂不同比例所得整体柱的扫描电镜图。
图5为实施例4对苯的同系物的分离液相色谱图。在图5中，横坐标为时间Time(min)，纵坐标为Absorbance(mAU)。
图6为实施例5对六种物质的混标的快速分离液相色谱图。在图6中，横坐标为时间Time(min)，纵坐标为Absorbance(mAU)。
图7为实施例4和实施例5的流速与柱压关系图。在图7中，横坐标为流速Flowrate(μLmin-1)，纵坐标为柱压Back pressure(MPa)。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例11)毛细管内壁的清洁活化处理取内径530μm，长3m的熔融硅毛细管，先用丙酮清洗30min，用1mol L-1NaOH冲洗30min后二次水冲洗至中性，然后用0.1mol L-1HCl在温度70℃下冲洗2h，二次水冲洗至中性后置于气相色谱柱温箱中，160℃缓慢氮吹过夜，尔后两端封口置于干燥器中保存。
2)毛细管内壁的预聚合取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入10μL的干燥乙酸，通氮并超声震荡10min，然后将其注入到预处理过的毛细管内，两端封口，置于烘箱中60℃反应20h后，用丙酮将剩余反应液冲出，然后缓慢氮吹2h。该步骤在操作最好无水无氧，重复该步骤可获得更大的键合度。使用时可根据需要切成不同长度。
3)整体柱的制备按甲基丙烯酸十八烷基酯(OMA)∶乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)∶偶氮二异丁腈(AIBN)＝40∶60∶(0.5、1、1.5、3)配置反应单体混合物；致孔剂由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇组成，反应单体混合物与致孔剂按40∶60混合；氮吹超声震荡脱气15min后注入已预键合的毛细管中，一端封口超声震荡后封住另一端。70℃水浴中反应24h后，接到液相色谱泵上，用乙腈冲洗5h即可。图1中的1a、1b、1c、1d分别为AIBN的比分别为0.5、1、1.5、3的扫描电镜图。图2为柱体和管壁连接处的扫描电镜图。
实施例2毛细管内壁的清洁活化处理同实施例1，在毛细管内壁预键合中，取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入2μL的干燥甲酸，其它同实施例1，OMA∶EDMA∶AIBN＝49.5∶49.5∶1配置反应单体混合物；致孔剂由70％的正丙醇和30％的1，4丁二醇组成，反应单体混合物与致孔剂按比例分别为45∶55；50∶50；55∶45；70∶30混合后氮吹超声震荡脱气15min注入已预键合的毛细管中，一端封口超声震荡后封住另一端。50℃水浴中反应20h后，接到液相色谱泵上，用乙腈冲洗8h即可。图3中的3a、3b、3c、3d分别为反应单体混合物与致孔剂的比例为45∶55；50∶50；55∶45；70∶30的扫描电镜图。
实施例3毛细管内壁的清洁活化处理同实施例1，在毛细管内壁预键合中，取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入5μL的干燥乙酸其它同实施例1，配制OMA∶EDMA分别为69.5∶29.5，64.5∶34.5，59.5∶39.5，54.5∶44.5，AIBN为1的反应单体混合物；致孔剂由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇组成，反应单体混合物与致孔剂按比例40∶60混合后氮吹超声震荡脱气15min注入已预键合的毛细管中，一端封口超声震荡后封住另一端。60℃水浴中反应20h后，接到液相色谱泵上，用乙腈冲洗5h即可。图4中的4a、4b、4c、4d分别为OMA∶EDMA＝69.5∶29.5；64.5∶34.5；59.5∶39.5；54.5∶44.5的扫描电镜图。
实施例4毛细管内壁的清洁活化处理及内壁预键合同实施例1，配制OMA∶EDMA∶AIBN＝39.5∶59.5∶1的反应单体混合物；致孔剂由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇组成，反应单体混合物与致孔剂的比例为62∶38，60℃水浴中反应18h后接到液相色谱泵上，用乙腈冲洗10h即可。截取制备好的整体柱16.5cm，在μ-LC模式下，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)为流动相，流速为20μL min-1，检测波长为254nm，对苯的同系物进行分离，对应峰分别为1.苯，2.甲苯，3.乙苯，4.异丙苯。其谱图如图5所示。
实施例5毛细管内壁的清洁活化处理及内壁预键合同实施例1，配制OMA∶EDMA∶AIBN＝57.5∶27.5∶1的反应单体混合物；致孔剂由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇组成，反应单体混合物与致孔剂的比例为40∶60，60℃水浴中反应15h后接到液相色谱泵上，用乙腈冲洗10h即可。截取制备好的整体柱19.7cm，在μ-LC模式下，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)为流动相，流速为60μL min-1，检测波长为254nm，对六种物质的混标进行快速分离，对应峰分别为1.硫脲2.苯酚3.苯4.甲苯5.乙苯6.异丙苯。其谱图如图6所示。
实施例6用实施例4和实施例5制备的整体柱，其柱长分别为16.5cm、19.7cm，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)为流动相，发现柱压与流速有很好的线性关系，说明所得整体柱材料机械强度好，内部均匀。其流速—柱压关系如图7中的曲线a、b所示，曲线a、b相应R＝0.9999和R＝0.9985。
权利要求
1.十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于其反应过程如下1)毛细管内壁活化 2)毛细管内壁的预聚合 3)交联聚合 其交联体系结构示意如下
2.如权利要求1所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于其步骤如下1)毛细管内壁活化依次用丙酮、盐酸、二次水、NaOH溶液、二次水清洗活化毛细管内壁，氮吹干燥，使毛细管内壁获得丰富的游离型硅羟基；2)毛细管内壁的预聚合在毛细管内壁键合一层带烯基的硅烷化试剂γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷；3)制备甲基丙烯酸十八烷基酯—乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱反应混合物包括反应单体混合物、引发剂和致孔剂，按质量百分比反应单体混合物占整个反应混合物的40％～70％，反应单体混合物中的甲基丙烯酸十八烷基酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的含量比例为甲基丙烯酸十八烷基酯为69.5％～39.5％，乙二醇二甲基丙烯酸酯为29.5％～59.5％，引发剂偶氮二异丁腈占反应单体混合物的0.5％～3％；其余为致孔剂，致孔剂为由正丙醇和1，4-丁二醇构成的二元混合物，按比例称取甲基丙烯酸十八烷基酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和致孔剂和引发剂，混合氮吹超声震荡脱气后注入已预键合的毛细管中，一端封口，超声震荡后封住另一端，水浴中反应，用高压泵驱动乙腈冲洗后即得到多孔结构的连续整体式液相色谱微柱。
3.如权利要求2所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述的毛细管内壁依次用丙酮清洗15～30min，1mol L-1NaOH冲洗0.5～3h，二次水冲洗0.5h，0.1mol L-1HCl在50～70℃下冲洗2h，二次水冲洗0.5h，然后置于气相色谱柱温箱中，120～300℃氮吹，尔后两端封口并置于干燥器中保存，使毛细管内壁获得丰富的游离型硅羟基。
4.如权利要求3所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述的氮吹其温度为160℃。
5.如权利要求2所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述的毛细管内壁的预聚合是按体积百分比用加入0.25％～0.5％的有机酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷注入经过活化干燥的毛细管内，两端封口，室温过夜，然后用氮气吹扫30min，重复一次，最后用氮气吹扫0.5～3h。
6.如权利要求2或5所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述的有机酸为乙酸或甲酸。
7.如权利要求2所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤2)中，在加入0.25％～0.5％有机酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷注入毛细管前，通氮同时超声震荡脱气除氧。
8.如权利要求2所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤3)中，致孔剂中的正丙醇和1，4-丁二醇的含量按百分比为正丙醇∶1，4-丁二醇＝70％∶30％。
9.如权利要求2所述的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤3)中，混合液注入已预键合的毛细管中，一端封口超声震荡脱气的时间为15～30min，水浴中反应，水浴温度为50～70℃，水浴中反应时间为15～24h，用高压泵驱动乙腈冲洗5～10h后即可得到多孔结构的连续整体式液相色谱微柱。
全文摘要
十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法，涉及一种液相色谱微柱，提供一种操作简单、便捷，所得整体式液相色谱微柱通透性好、柱压低、机械强度高、分析速度快，不需在整体柱表面键合其它功能基团即可直接进行μ－LC分离操作，同时可根据需要方便控制整体柱长度的十八烷基型整体式液相色谱微柱的制备方法。步骤为毛细管内壁活化后进行毛细管内壁的预聚合，再制备甲基丙烯酸十八烷基酯－乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱。以甲基丙烯酸十八烷基酯－乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物为连续整体式柱体骨架，正丙醇和1，4－丁二醇二元混合物为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，反应后用乙腈将致孔剂和交联度低的聚合物冲洗出。
文档编号G01N30/60GK1833772SQ200610054640
公开日2006年9月20日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者徐振东, 王秋泉, 付强 申请人:厦门大学