专利名称：全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及全封闭靶核酸扩增物的检测装置，更具体地说，涉及利用核酸薄膜层析(试纸条)技术在全封闭的检测装置中快速检测靶核酸序列扩增物的方法，本发明还涉及了在全封闭的快速检测装置中应用快速检测靶核酸扩增物的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。
现有技术聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是1985年由美国Cetus公司发明的一种利用DNA变性与复性原理在体外DNA聚合酶存在的条件下进行特定DNA片段高效的体外扩增技术。PCR自问世以来，便在国际上引起了极大的反响，以惊人的速度广泛应用于生命科学的众多领域，并在疾病诊断和检验中得到广泛的应用，其发明者Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。
近几年来PCR技术迅速发展，其广泛应用于医学、分子生物学、遗传工程、肿瘤学、法医学等各个领域。在体外特定的条件下，PCR在数小时内可将单一拷贝的DNA片断扩增至数百亿个拷贝，从而大大提高了特异基因检测的敏感性。正是由于其具有特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好等优点，PCR被广泛应用于临床医学及生命科学中特定的基因扩增和检测，如各种病原体的PCR检测已成为传染性疾病诊断的重要手段之一。但由于强大的扩增效率和PCR产物的检测方法(琼脂糖凝胶电泳)，极易造成实验室扩增物的污染，而导致假阳性检测结果，造成PCR检验结果十分混乱，特别在性病基因检测方面，甚至还带来一系列道德伦理、家庭纠纷以及社会和法律问题。PCR技术临床应用所出现的一系列问题引起卫生部管理层高度重视，因此，对PCR的临床应用制定了一系列条款和规定，而如何消除PCR假阳性结果则成了科研工作者们要解决的一大难题。
为了防止实验室扩增物污染所造成的假阳性，国家卫生部规定PCR临床诊断必须将样品处理、扩增和检测在分隔的房间内进行，而且物流是从样品处理，扩增和检测一个方向进行，否则扩增后的试管不能进行开放检测。目前用来防实验室扩增物污染最为普遍的方法是采用UNG-dUTP系统。该系统是利用UNG(尿苷葡萄糖基酶)能水解含有dUTP的DNA片断中的尿苷这一特点，将DNA片断中的U水解，被水解的DNA受热后从被水解的地方断裂，失去做模板的功能，从而达到防污染的目的。但使用该系统防污染的先决条件，是整个PCR系统必须从一开始就全部采用dUTP代替dTTP，而且UNG-dUTP系统防污染试剂的价格也使该试剂的使用受到了限制。
荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术。荧光定量PCR技术既巧妙的利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染，不能定量，探针杂交灵敏度不高，分离洗脱条件不易控制等不足，在疾病的基因临床诊断中得到了广泛的应用。而其最显著的特点就是全封闭式反应，实时检测PCR扩增过程，而无需对PCR扩增产物进行后处理，从而彻底克服了传统PCR技术易污染的缺点，因而成为检测领域上越来越重要的一种检测手段，在病原体的临床检测中得到了极广泛的应用。但由于昂贵的仪器及试剂和对操作人员的技术要求较高，此项技术并不适合广大基层医院。
如上所述，由于PCR扩增物污染，使PCR的诊断受到了很大的限制。为了避免实验室污染而造成的假阳性，本申请人结合核酸试纸条快速检测技术(参见本发明人的另一项专利申请，申请号200610003429.1)，开发出全封闭快速检测靶核酸扩增物的装置，称为全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置。本方法简单、快速，而且不会造成污染，可以广泛地应用于生命科学领域，如分子生物学实验室核酸扩增检测、临床诊断、植物和动物疾病的检测、海关检疫、法医学鉴定等核酸扩增物的检测。
简而言之，本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置提供了两个方面的用途第一，提供了一种快速检测靶核酸扩增物的方法；第二，提供了一种防止核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的方法。
发明内容
概述本发明提供一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法。
本发明提供一种将PCR、恒温扩增或其它方法扩增的产物应用核酸检测试纸条的全封闭快速检测装置。
具体地说，一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括
a)扩增反应完成后，不打开反应管的管盖，以免靶核酸扩增产物外泄而造成污染；b)将未开盖的反应管放入封闭性装置，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上；c)以肉眼可视的形式予以检测，并判读结果；和d)检测后不打开所述封闭性装置，将其整体废弃于安全处。
本发明提供一种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括内芯1和外盒15；内芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相应的孔用于放置清洗液泡3和含有扩增物7的反应管11；底座部分5包括带有液泡穿刺针4的清洗液容纳单元21、带有刀片9的扩增物容纳单元22、封闭隔6、玻璃纤维纸8；和带有试纸条13和透明视窗12的试纸条密封部分14；和外盒15包括手柄盖16、固定盒推压部分17、清洗液泡挤压部分18和透明视窗20。
本发明将利用全封闭式检测装置并结合本申请人的核酸快速检测试纸条检测技术，检测扩增产物。这一方法操作简单、快速、无污染，是对扩增物检测一个根本性革新。本发明与本申请人的其它技术相结合(切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒，参见本发明人的另一项专利申请，申请号200610057262.7)，可以发展出一种新的核酸快速检测技术平台。利用该技术平台可以对核酸进行定性和半定量检测，且不会对实验室和周围环境产生污染，从而可以更广泛地应用于临床疾病的诊断和检测及其它生命科学领域。
发明内容
详述本发明将PCR、恒温扩增或其它方法扩增的产物在全封闭的装置中应用核酸快速检测试纸条进行检测。这种方法除操作简单、快速外，最重要的是可以避免扩增物对实验室的污染而造成的假阳性，大大增加了体外诊断试剂的可靠性，是一种全新的检测方法。这对于病源微生物的检测具有非常重要的意义，而且也符合国家卫生部门有关的规定。
具体地说，本发明提供一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括a)扩增反应完成后，不打开反应管的管盖，以免靶核酸扩增产物外泄而造成污染；
b)将未开盖的反应管放入封闭性装置，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上；c)以肉眼可视的形式予以检测，并判读结果；和d)检测后不打开所述封闭性装置，将其整体废弃于安全处。
根据本发明的优选实施方案，在上述方法中，所述的封闭性装置一旦扣死，则不能再打开，从而防止装置内可能污染的物品因意外而外泄。
根据本发明的更优选实施方案，在上述方法中，在步骤b)中将反应管和清洗液管在物理性封闭的环境中打开，靶核酸扩增产物由清洗液带动转移至检测试纸条上。
本发明提供一种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括内芯1和外盒15；内芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相应的孔用于放置清洗液泡3和含有扩增物7的反应管11；底座部分5包括带有液泡穿刺针4的清洗液容纳单元21、带有刀片9的扩增物容纳单元22、封闭隔6、玻璃纤维纸8；和带有试纸条13和透明视窗12的试纸条密封部分14；和外盒15包括手柄盖16、固定盒推压部分17、清洗液泡挤压部分18和透明视窗20。
更具体地说，本发明提供一种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括内芯1和外盒15；内芯1包括固定盒部分2和底座部分5；固定盒部分2有相应的孔用于放置清洗液泡3和含有扩增物7的反应管11；底座部分5包括带有相应于清洗液泡3的液泡穿刺针4的清洗液容纳单元21、带有相应于反应管11的刀片9的扩增物容纳单元22、在单元21和22之间的封闭隔6、放置在容纳单元21和22中并相连于试纸条13底部的玻璃纤维纸8；和带有试纸条13和相应于试纸条13的透明视窗12的试纸条密封部分14；外盒15包括手柄盖16、固定盒推压部分17、清洗液泡挤压部分18和相应于透明视窗12的透明视窗20。
附
图1说明了本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置的结构。
在本发明的优选实施方案中，全封闭检测装置还包括位于相应于反应管11的孔与底座5之间的密封圈10，以确保相应于反应管11的孔与底座5的接触是吻合的、密封的，从而确保扩增物不会倒流回固定盒部分2。
在本发明的另一个优选实施方案中，全封闭检测装置还包括采用三层上下交替的封闭隔6以确保扩增物不会倒流，而与单向流动的清洗液混合后被试纸条13所吸收。
在本发明的另一个优选实施方案中，全封闭检测装置还包括其中外盒15构成一个全封闭的环境，并且在实验过程中，一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内可能污染的物品因意外而外泄。
在本发明的更优选实施方案中，全封闭检测装置还包括位于相应于反应管11的孔与底座5之间的密封圈10，以确保相应于反应管11的孔与底座5的接触是吻合的、密封的，从而确保扩增物不会倒流回固定盒部分2；采用三层上下交替的封闭隔6以确保扩增物不会倒流，而与单向流动的清洗液混合后被试纸条13所吸收；和其中外盒15构成一个全封闭的环境，并且在实验过程中，一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内可能污染的物品因意外而外泄。
附图2说明了本发明的优选全封闭靶核酸扩增物快速检测装置的结构。
由于整个操作过程是在全封闭的状态下进行，以物理隔绝的方式防止扩增物对实验室的污染，所以可以提高体外诊断试剂的准确性。
本发明全封闭检测装置的具体操作步骤和检测机理如下(1)将扩增后未打开的反应管11放置在固定盒部分2的反应管孔中(清洗液泡3已预先放置在清洗液泡管孔中)；(2)将固定盒部分2放入外盒15中，密封圈10保证反应管孔处与底座5的接触是吻合的、密封的；(3)合上检测装置的手柄盖16；(4)推压检测装置的盖子16，直至盖子盖紧并扣死，此时在固定盒推压部分17的挤压下，底座的刀片9将含有扩增物7的反应管11割破；而在清洗液泡挤压部分18的作用下，底座的清洗液泡穿刺针4将塑料清洗液泡在底部穿破；(5)通过玻璃纤维纸8的毛细管现象，扩增产物7和清洗液被吸附到试纸条13的样品垫中；(6)液体在样品垫中移动、混合并缓慢地移向核酸检测试纸条底部；(7)混合后的液体通过毛细管现象从试纸条底部缓慢向核酸检测试纸条顶部移动，检测反应液与核酸检测试纸条上的检测线发生抗原抗体特异反应而完成检测过程；
(8)静置10分钟观察检测结果；(9)记录检测结果，整体废弃封闭的检测装置于安全处。
附图3说明了本发明的检测装置的操作步骤。
在本发明的优选实施方案中，所述的反应管是PCR反应管。
本发明还提供一种快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括使用上述的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测核酸序列扩增物。
本发明还提供一种防止核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的方法，其包括使用上述的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测核酸序列扩增物。
在最优选的实施方案中，本发明提供了一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括a)扩增反应完成后，不打开反应管的管盖，以免靶核酸扩增产物外泄而造成污染；b)将未开盖的反应管放入封闭性装置，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上；c)以肉眼可视的形式予以检测，并判读结果；和d)检测后不打开所述封闭性装置，将其整体废弃于安全处；其中所述的封闭性装置为上述的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，并且在实验过程中，全封闭装置一旦扣死，则不能再打开，从而防止装置内可能污染的物品因意外而外泄。
本申请人的另一项专利(申请号200610003429.1)描述了核酸试纸条检测的原理和方法。该发明将以免疫反应为基础的蛋白质试纸条检测技术改造成核酸诊断试剂，其要点在于将待检的靶核酸扩增物转变为具备免疫原性的分子或分子复合物。如此，以免疫反应为基础的蛋白质试纸条检测技术基本方法均可应用与核酸试纸条检测。
将待检的靶核酸扩增物转变为具备免疫原性的分子或分子复合物的基本方法是用抗原或半抗原(以下简称抗原)标记探针，使标记的特异性探针与待检的靶核酸扩增物杂交，从而形成具备免疫原性的分子复合物，该复合物即可用与蛋白质试纸条检测相类似的方法被检测。
附图4说明了单探针法核酸试纸条检测的基本原理。
附图5说明了核酸扩增物检测试纸条的基本结构。
该发明提供了用于核酸扩增物检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫27上按顺序有样品垫31、有色颗粒结合物垫32、纤维膜23和吸水滤纸垫24，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线25和质控线26，其中有色颗粒结合物垫32上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线25上有抗B抗体包被，质控线26上有抗A抗体。有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，纤维膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
有关核酸试纸条快速检测技术和核酸试纸条结构的详细说明，参见本申请人的另一项专利，申请号200610003429.1)发明效果核酸扩增反应的最大特点是具有较大的扩增能力与极高的灵敏性，但严重的问题是扩增产物极易造成实验室的污染。极其微量的扩增物污染即可造成假阳性。由于扩增后的产物拷贝量大(一般约为1011拷贝/微升)，加上扩增物是一种小分子的物质，很容易漂浮在空气中或散落在实验台上以及各种实验用品的表面。当操作稍有不慎(有时是不可避免)，即造成假阳性。而常规PCR扩增反应结束后，必须打开PCR反应管的管盖，吸出全部或部分扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳或其它方法检测。这种开放式的检测很容易造成实验室环境的污染。因此如何避免污染或在封闭条件下实现扩增产物的检测就成为科研工作者们研究的重点。目前除荧光定量PCR外，尚无其它的方法可在全封闭的条件下完成对核酸的检测过程。
本发明的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置与常规PCR检测技术相比，主要有以下优点(1)全封闭检测。检测装置从内到外都是封闭的，达到双重密封的效果(A)内芯封闭。无需打开扩增反应后的反应管的管盖，从物理学角度防止了扩增物的外泄，将扩增物污染机会降至最低，从而防止检测中的假阳性的发生；固定盒的密封孔圈确保扩增物不会倒流回固定盒，从而保证了固定盒的无污染；底座的三重封闭隔同样保证扩增物不会通过玻璃纤维纸倒流回清洗液泡管底部；(B)外盒封闭。由外壳、手柄盖、透明视窗组成的外盒构成一个全封闭的环境；并且在实验过程中一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内的物品的外泄；(2)特异性强由于在扩增反应中不但加入了两个特异的引物，而且加入了1-2个特异的探针(核酸试纸条快速检测技术，参见本发明人的另一项专利，申请号200610003429.1，其检测基本原理见附图4)，使检测反应更加特异；(3)保持了扩增后靶核酸扩增物检测的高灵敏度；(4)操作简单、快速整个检测过程只需十到十五分钟左右的时间，而传统的琼脂糖凝胶电泳则至少需要1-2小时；(5)扩增后检测不需任何仪器设备。
由于该装置使得核酸扩增产物的检测和分析均在封闭状态完成，最大限度地降低常规扩增后核酸检测法中交叉污染的危险。此方法操作简单、时间短，同时也降低了检测成本，使得检测结果更加快速、可靠。本封闭式靶核酸扩增物快速检测装置在临床检验的使用，可以大大增加传染性疾病诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可使医疗保健系统总体成本降低。这一装置由于操作简单、快速、低廉的成本和防止核酸扩增物对实验室的污染，对于工作在生命科学领域中需要检测靶核酸扩增产物的科技人员来说，也将有很大帮助。
作为一个封闭式核酸扩增物检测的通用技术平台，本发明的方法及其装置可以广泛用于传染病病原体临床检测，突发性公共卫生事件的战略性技术储备，农牧业和食品工业，海关检验检疫，环境检测，生物武器检测，人类遗传病检测，婚前、产前检查及优生优育和法医鉴定和血缘鉴定等领域。
常见的病原体包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫等。
封闭式核酸扩增物检测装置不仅可以鉴别这些病原体，而且可以鉴别它们的亚型、有毒菌株、突变株和抗药性等。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可作为突发性公卫事件的战略性技术储备。国家已投入巨资建立全国性的传染病预防和控制系统，诊断烈性传染病的快速诊断试剂将作为这些中心的常规储备，以便在突发性公卫事件发生时可迅速鉴别病原体，有效控制。这方面的检测对象包括例如禽流感、SARS、霍乱、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血热等。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于食品工业，食物中毒常有发生，因此对牛奶、饮料、肉类制品等的出厂前检验很有必要。如霉菌，大肠杆菌，沙门氏菌，肉毒杆菌等。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于农业，对主要农作物的有害微生物的鉴别诊断，将产生巨大的经济和社会效益。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于牧业，在牲畜、鱼类和家禽的疾病诊断方面有广阔的市场。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于海关进出口检疫。这也是一个稳定而可靠的市场。例如外贸进口，为防止境外有害微生物、病虫卵、转基因产品传入我国。需要有一套完整、灵敏、可靠的快速诊断系统。例如外贸出口，向进口国提供一套完整的检疫资料，将大大地促进我国农牧业、林业、食品工业等产品的外贸出口，减少贸易纠纷。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于对土壤、水源、空气等环境有害微生物的检测及鉴别。一套简便、灵敏、快速的现场检验方法对环境检测具有重要意义。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于检测生物武器。各国都在发展检测生物武器的技术，我国也应及早准备。常见的生物武器病原体有霍乱、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血热以及人工改造过的细菌和病毒等。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于检测基因突变。现代分子遗传学已经证明人类的绝大多数疾病在不同程度上都与基因有关。根据单核苷酸多态性(SNP)的研究，每个人的基因组型都不一样。因此对各种疾病的易感性和对药物的敏感性也不一样。由此提出了“个性化医学”。如重要疾病易感性预测。根据每个人的基因型决定他对药物的敏感性和耐受性，精确给药等。常见的基因突变引起的疾病有上百种，包括基因缺失，基因易位等基因突变。本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于开发人类遗传病系列诊断产品，以满足这个巨大的市场需求。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于婚前检查，产前检查，优生优育等。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于犯罪现场血液、精液、毛发及其它样品的DNA鉴定，以及犯罪嫌疑人DNA的鉴定。
另一方面，本发明的封闭式核酸扩增物检测装置可用于血缘鉴定，基因身份证，人群基因数据库等方面。
如下实施例进一步补充说明本发明的技术方案，但并不构成对本发明的保护范围的限制。
实施例实施例1淋球菌为例的靶核酸PCR扩增物检测1.PCR扩增
KCl(500毫摩)2微升Tris-HCl(pH 8.3，100毫摩) 2微升MgCl2(20毫摩) 2微升dNTP(2毫摩) 2微升Forward Primer(Biotin标记，2微摩) 2微升Reverse Primer(2微摩) 2微升Reverse FITC标记探针(2微摩) 2微升淋球菌 4000个Taq DNA Polymerase 0.5单位总量20微升95℃5秒60℃15秒72℃15秒共60循环2.检测●将含有扩增物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已预先放置在清洗液泡管孔中)；●将固定盒扣紧，放入检测装置中；●合上检测装置的手柄盖；●推压检测装置的手柄盖直到盖紧并扣死；●10分钟后判读结果；●记录检测结果，整体废弃封闭的检测装置于安全处。
实施例1检测结果见附图6。附图6显示阳性样品在检测线(T线)呈红色，阴性样品无色。阳性样品和阴性样品在质量控制线(C线)处均显色，表明结果有效。
实施例2以淋球菌克隆DNA为模板恒温扩增(切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒，参见本发明人的另一项专利申请，申请号200610003429.1)靶核酸产物的检测1.反应条件
管1反应缓冲液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mMMgCl2，10mM dithiothreitol，pH 7.9@25℃) 1微升两对引物P1，2/S1，25微摩/0.5微摩/ 2微升超纯水5微升模板淋球菌质粒(1千拷贝/微升) 2微升共10微升95℃，5分钟变性，然后自然冷却至室温管2反应缓冲液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mMMgCl2，10mM dithiothreitol，pH 7.9@25℃) 1微升dNTP2毫摩 2微升标记的探针2微升牛血清蛋白100纳克/微升2微升切口酶N.BstNB I 10个单位/微升 0.5微升Bst DNA聚合酶 8个单位/微升0.25微升超纯水2.25微升共10微升管1加上相应的管2混匀，在54℃金属浴放置30分钟 95℃，5分钟变性，然后自然冷却至室温后检测。
2.检测●将含有扩增物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已预先放置在清洗液泡管孔中)；●将固定盒扣紧，放入检测装置中；●合上检测装置的手柄盖；●推压检测装置的手柄盖直到盖紧并扣死；●10分钟后判读结果；●记录检测结果，整体废弃封闭的检测装置于安全处。
实施例2检测结果见附图7。附图7显示阳性样品在检测线(T线)呈红色，阴性样品无色。阳性样品和阴性样品在质量控制线(C线)处均显色，表明结果有效。
实施例3.Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性的检测与分型Leber’s遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种母性遗传的双眼视神经疾病。1988年W.allace等人首先报告线粒体DNA(mtDNA)第11778核苷酸位点原发性突变(G→A)可引起LHON。迄今发现和本病相关的mtDNA位点突变已有25个，在近年的报告中3460或14484等原发性位点突变的LHON及原发和继发突变并存的LHON患者，其临床表现类似11778位点突变者，临床医生很难根据其临床表现进行鉴别，因此分子生物学基因检查成为鉴别不同病因的Leber’s病的首选方法。鉴于对于线粒体G11778A位点分型对于Leber’s遗传性视神经病的诊断意义，应用本专利新发明的SNP封闭式核酸扩增物检测装置对G11778A位点多态性进行检测。具体实施如下1.取样被检者外周静脉抗凝血(冻存)5μl，应用杭州优思达生物技术有限公司所生产的微量DNA快速提取试剂盒进行核酸提取，用以基因扩增。
2.聚合酶链反应(PCR)为排除基因组中假基因对线粒体基因扩增的干扰，需要进行两次扩增，以第一扩增产物为模板进行二次扩增，然后利用第二次扩增产物进行SBE。
引物 0.2微摩第一次扩增引物Nd4P_out_F5’TCACTCTCACTGCCCAAAA 3’Nd4P_out_R5’GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3’第二次扩增引物Nd4P_in_F5’CTTCACCGGCGCAGTCATTC 3’Nd4P_in_R5’AGGCGAGGTTAGCGAGGCTT 3’dNTP 0.2毫摩缓冲液MgCl23微摩KCl 50微摩Tris-HCl(PH 9.0) 10微摩氚核-100 1.0％
Taq DNA聚合酶0.8单位总体积为20微升PCR反应程序如下第一对引物 第二对引物 产物大小801bp(第一对引物)182bp(第二对引物)3.降解第二次PCR反应中剩余的dNTP模板上述PCR产物 20微升缓冲液Bis Tris-Propane50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩热敏磷酸酶1单位总体积为30微升反应程序37℃，15分钟热敏磷酸酶灭活80℃，20分钟.
4.单碱基延伸(检测G和A)模板上述dNTP降解后的PCR产物30微升延伸引物 0.1微摩
5’FITC-TCAAACTACGAACGCACTCACAGTC 3’(正向)生物素-ddGTP/生物素-ddATP 0.5微摩缓冲液Tris-HCL(pH 9.5) 26毫摩MgCl26.5毫摩热测序酶 0.5单位总体积为40微升SBE反应程序如下95℃→60秒72℃→90秒5.检测●将含有SBE反应物的PCR管放置在固定盒的PCR管孔中(清洗液泡已预先放置在清洗液泡管孔中)；●将固定盒扣紧，放入检测装置中；●合上检测装置的手柄盖；●推压检测装置的手柄盖直到盖紧并扣死；●10分钟后判读结果；●记录检测结果，整体废弃封闭的检测装置于安全处。
封闭式核酸扩增物检测装置检测SNP结果见附图8，由附图8的结果可以看出，在被检者线粒体ND4基因11778位点发生突变，由G转变为A，与测序结果一致。
权利要求
1.一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括a)扩增反应完成后，不打开反应管的管盖，以免靶核酸扩增产物外泄而造成污染；b)将未开盖的反应管放入封闭性装置，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上；c)以肉眼可视的形式予以检测，并判读结果；和d)检测后不打开所述封闭性装置，将其整体废弃于安全处。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的封闭性装置一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内可能污染的物品因意外而外泄。
3.权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中将反应管和清洗液管在物理性封闭的环境中打开，靶核酸扩增产物由清洗液带动转移至检测试纸条上。
4.一种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括内芯(1)和外盒(15)；其中内芯(1)包括固定盒部分(2)和底座部分(5)，其中固定盒部分(2)有相应的孔用于放置清洗液泡(3)和含有扩增物(7)的反应管(11)；底座部分(5)包括带有液泡穿刺针(4)的清洗液容纳单元(21)、带有刀片(9)的扩增物容纳单元(22)、封闭隔(6)、玻璃纤维纸(8)；和带有试纸条(13)和透明视窗(12)的试纸条密封部分(14)；和外盒(15)包括手柄盖(16)、固定盒推压部分(17)、清洗液泡挤压部分(18)和透明视窗(20)。
5.一种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括内芯(1)和外盒(15)，其中内芯(1)包括固定盒部分(2)和底座部分(5)；其中固定盒部分(2)有相应的孔用于放置清洗液泡(3)和含有扩增物(7)的反应管(11)；底座部分(5)包括带有相应于清洗液泡(3)的液泡穿刺针(4)的清洗液容纳单元(21)、带有相应于反应管(11)的刀片(9)的扩增物容纳单元(22)、在单元(21)和(22)之间的封闭隔(6)、放置在容纳单元(21)和(22)中并相连于试纸条(13)底部的玻璃纤维纸(8)；和带有试纸条(13)和相应于试纸条(13)的透明视窗(12)的试纸条密封部分(14)；和外盒(15)包括手柄盖(16)、固定盒推压部分(17)、清洗液泡挤压部分(18)和相应于透明视窗(12)的透明视窗(20)。
6.权利要求4或5的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其还包括位于相应于反应管(11)的孔与底座(5)之间的密封圈(10)，以确保相应于反应管(11)的孔与底座(5)的接触是吻合的、密封的，从而确保扩增物不会倒流回固定盒部分(2)。
7.权利要求4或5的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其还包括采用三层上下交替的封闭隔(6)以确保扩增物不会倒流，而与单向流动的清洗液混合后被试纸条(13)所吸收。
8.权利要求4或5的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其中外盒(15)构成一个全封闭的环境，并且在实验过程中，一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内可能污染的物品因意外而外泄。
9.权利要求4或5的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，还包括位于相应于反应管(11)的孔与底座(5)之间的密封圈(10)，以确保相应于反应管(11)的孔与底座(5)的接触是吻合的、密封的，从而确保扩增物不会倒流回固定盒部分(2)；采用三层上下交替的封闭隔(6)以确保扩增物不会倒流，而与单向流动的清洗液混合后被试纸条(13)所吸收；和其中外盒(15)构成一个全封闭的环境，并且在实验过程中，一旦扣死，则不能再打开，从而防止盒内可能污染的物品因意外而外泄。
10.一种快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括使用权利要求4-9之一的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测核酸序列扩增物。
11.一种防止核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的方法，其包括使用权利要求4-9之一的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测核酸序列扩增物。
12.权利要求1-3之一的方法，其中所述封闭性装置为权利要求4-9之一的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置。
13.权利要求1-3或10-12之一的快速检测靶核酸扩增物的方法或权利要求4-9之一的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置在传染病病原体检测、食品工业、农业、牧业、海关检疫、基因突变检测和DNA单核苷酸多态性(SNP)鉴定方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法，其包括a)扩增反应完成后，不打开反应管的管盖，以免靶核酸扩增产物外泄而造成污染；b)将未开盖的反应管放入封闭性装置，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上；c)以肉眼可视的形式予以检测，并判读结果；和d)检测后不打开所述封闭性装置，将其整体废弃于安全处本发明还涉及全封闭靶核酸扩增物的检测装置本发明还涉及了在全封闭的快速检测装置在传染病病原体检测食品工业农业牧业海关检疫基因突变检测和DNA鉴定方面的应用。
文档编号G01N21/00GK1888902SQ200610109620
公开日2007年1月3日 申请日期2006年8月11日 优先权日2006年8月11日
发明者顾家永, 余庆豪, 尤其敏, 胡林 申请人:杭州优思达生物技术有限公司