专利名称：乙酸测定试剂盒及乙酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓 度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。
技术背景随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋G B 10337—2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合G B 1903—1996 的规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒"食品添加 剂醋酸"，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不 够时加入盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为 这类醋酸不仅含有添加的有毒、有害无机物，还含些很难说清的有害有 机物。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得 以测定乙酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙 酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因4而可以得到切实的推广应用。本发明乙酸浓度测定方法原理如下乙酸+ 二氧化碳+亚铁细胞色素bl 丙酮酸氧化酶丙酮酸+高铁细胞色素bl +水 丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶L-乳酸+辅酶 这种方法应用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ; EC 1.2.2.2)酶(偶) 联乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ; EC 1.1.1.27; EC 1.1.1.28)酶促反应连续监测法/速率比色法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反应产生丙酮 酸，再通过(偶)联合乳酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测 定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm 处吸光度下降的程度/速度，可以测算乙酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙酸测定试剂盒较为理想:缓冲液稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl丙酮酸氧化酶 乳酸脱氢酶廳mmol/L 500 mmol/L 0.25腿ol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 8000 U/L 12000 U/L本发明的乙酸测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素 bl。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶。 还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、丙酮酸氧化酶、乳酸 脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂-试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素 bl。 试剂2缓冲液、稳定剂、乳酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是 干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接 使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙酸浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的乙酸测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 二氧化碳 亚铁细胞色素bl 丙酮酸氧化酶 乳酸脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 8000 U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸 样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙 酸的浓度大小。 实施例二本实施例的乙酸测定试剂为双试剂，包括-试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂丙酮酸氧化酶 乳酸脱氢酶500 mmol/L 8000 U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸 样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降 反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。实施例三本实施例的乙酸测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂还原型辅酶二氧化碳亚铁细胞色素bl100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 乳酸脱氢酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸氧化酶500 mmol/L 12000U/L100 mmol/L500 mmol/L8000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定乙酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应 时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5， 反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间 5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙 酸的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸浓度测定方法，其方法原理如下乙酸+二氧化碳+亚铁细胞色素b1丙酮酸氧化酶丙酮酸+高铁细胞色素b1+水丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶L-乳酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小测定结果。
2. —种乙酸测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 二氧化碳 亚铁细胞色素bl 丙酮酸氧化酶 乳酸脱氢酶20-500 mmol/L-4000 mmol/L0.1-0.35 mmol/L1-50 mmol/L1-50 mmol/L1000--80000 U/L1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。二氧化碳以碳酸氢盐取代，例 如碳酸氢钠或碳酸氢钾。
3.根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳 定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶组成。还原型辅酶、 二氧化碳、亚铁细胞色素bl、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶在试剂l 或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳 定剂、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、乳酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、 丙酮酸氧化酶组成。还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素bl、 丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、二氧化碳、亚铁细胞色素b1、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101324509SQ20071002336
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司