专利名称：：肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒结合了生物素一亲和素免疫放大技术、免疫磁微粒技术和化学发光免疫分析技术。
背景技术：
：癌症自从诞生之日起就对人类的生存健康构成了严重威胁。目前肺瘤治疗的关键在于早期发现、早期治疗，这已是人们的共识。但是目前医院诊断早期肿瘤，主要是靠影像学和细胞病理学诊断技术，一般都是在具有明显的g位性病变和临床症状后才得以确诊，但这已不是癌变的最早期。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，以血液为代表的体液蛋白质成为肿瘤标志研究领域中的热点。越来越多肿瘤标志物的发现对建立发展快速、高灵敏、高特异肿瘤标志物新型检测技术提出了更高的要求。胂瘤相关抗原125(carbonhydrateantigen125,CA125)作为肿瘤相关抗原的一种，是一种高分子糖蛋白，主要含半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖链。血浆和体液中的CA125分别与分子量约为500kD和300kD的糖蛋白结合，而具有CA125免疫活性的最小亚基为50kD。CA125存于胚胎发育中的体腔上皮细胞中，于出生后消失，但在卵巢癌细胞中又重新出现。所以CA125主要用于恶性浆液性卯巢癌的诊断，也是卯巢癌手术和化疗后疗效观察的重要指标。目前用于检测CA125的免疫方法主要有酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)、it射免疫测定(radioimmunoassay,RIA)、免疫荧光测定(fluoroimmunoassay,FIA)、it射免疫显影(radioimmunoimaging,RII)、抗体芯片(antibodymicroarrays)技术以及化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)。这些超孩i量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为化学发光免疫分析、荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有一定污染性，并存在仪器成本贵，灵敏度不高，操作复杂，测定结果不稳定，试剂保存时间短等缺点。酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10—18摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，又因为酶标记物稳定，可长期使用，因而得到了越来越多的关注。在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的背景中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单、不需要昂贵的仪器设备；不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积，从而增加抗原或抗体的吸附量，既加快了反应速度，也使清洗和分离更简便。作为用于化学发光免疫分析检测技术的一种通用固相分离方法，磁微粒可大大提高有效包被量从而节省原料，同时可拓宽检测的线性范围，从而有效避免弯钩效应的发生。将免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性，它以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性基团与蛋白质氨基共价结合，采用抗体进行"搭桥"成免疫磁微粒，可进行抗原、抗体反应。该技术的新颖之处有(l)利用顺磁铁微粒为固相载体，外包被单克隆抗体，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用；(2)在液相反应中，使用发光增强剂，.将水分子从发光底物的发光位点排开，同时还可缩短发光的达峰时间；(3)使用单克隆抗体，提高了反应的特异性。生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem,BAS)具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。生物素-亲和素免疫放大技术可以直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进4于;险测，这种方法称为标记亲和素-生物素法。待测反应体系可以利用生物素化抗体，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联，放大终反应先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。化学发光免疫分析结合生物素-亲和素系统和免疫磁微粒固相分离体系是一种检测肿瘤相关抗原125的先进而有效的方法，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
发明内容本发明同时解决了上述问题，即将生物素一亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析技术，检测肿瘤相关抗原125，提供了一种能够筒便、快速、灵敏、稳定地检测肿瘤相关抗原125的测定试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。本发明的目的是提供一种生物素一亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析测定肿瘤相关抗原125的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂合JULo本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包括l)紳瘤相关抗原125校准品；2)肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被的^兹孩i:粒和生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合液；3)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；4)上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；以及5)反应管。根据本发明的试剂盒，其中，所述肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒与生物素标记的肺瘤相关抗原125单克隆抗体的混合比例为1:1。根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液是在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1MpH值为8.5的Tris-HCl緩冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对石典苯酚；B液是在双蒸水中加入一宁檬酸三钠和种檬酸，配制成O.lMpH值为4.6的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。根据本发明的试剂盒，其中，所述试剂盒使用的反应管材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)以肿瘤相关抗原125纯品配制校准品；2)配制肺瘤相关抗原125单克隆抗体包被磁微粒和生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合液；3)以辣根过氧化物酶标记链亲和素；4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；5)分装上述校准品、抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液、酶标记物、化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺和反应管；以及6)组装为成品。根据本发明的方法，在所述制备抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液的步骤2)中所述的混合液是由胂瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒和生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体以体积比为l;l混合，以2040%的小牛血清配制而成；所述磁微粒为2~3nm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用浓度为510mg/mL;所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法将肿瘤相关抗原125单克隆抗体包净皮于^兹樣i:粒上；以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭夜为含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液；所述生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体游离赖氨酸发生偶联反应而实现的。根据本发明的方法，在所述以辣根过氧化物酶标记链亲和素的步骤3)中，采用改良过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。根据本发明的方法，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液是在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成O.IMpH值为8.5的Tris-HCl緩冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成O.lMpH值为4.6的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。在根据本发明制备上述试剂盒的方法中，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作为反应管材料。具体的上述试剂盒可以包括校准品、抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液、酶标记物、化学发光底物与洗涤緩冲液等。其中，所述校准品的原料为标准级，纯度不低于90%;抗体包被于磁微粒上，与生物素标记的抗体形成混合液；标记链亲和素的酶为辣根过氧化物酶；化学发光底物为鲁米诺；洗涤緩冲液为磷酸盐緩冲液。本发明"肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒"可以非常有效地检测出卵巢癌特别是恶性浆液性卵巢癌患者体内的肺瘤相关抗原125的含量，可以根据肿瘤相关抗原125含量的多少判断治疗效果及其病情的变化。本发明的试剂盒(化学发光法、生物素-亲和素免疫放大技术与免疫磁微粒结合)具有简便、快速、灵敏、稳定等优点，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，肿瘤相关抗原125单抗包被的磁微粒、待测样品中的肿瘤相关抗原125与生物素标记的肿瘤相关抗原125单抗结合，形成"双抗体夹心"复合结构，之后酶标记的链亲和素再与该复合结构结合，形成"磁微粒-抗体-待测抗原-抗体-生物素-亲和素-酶"复合物，最后与化学发光底物作用而产生并放大光信号，在管式发光仪中对肿瘤相关抗原125进行高灵敏、高特异检测。本发明采用"双抗体直接夹心两步法"反应模式，有效地利用了化学发光技术结合磁微粒和生物素-亲和素免疫放大技术原理，定量检测人体血清、血浆样品中肿瘤相关抗原125含量，确保了检测的灵敏度。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明的试剂盒结构简单，使用方便，价格便宜，携带便利，与市场上的酶联免疫试剂盒、板式化学发光试剂盒相比，线性范围宽，有效避免弯钩效应，不需样品稀释，适用于大批量检测样品。图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图(双对数标准曲线)。图2为本发明的试剂盒同国外试剂盒(Monobind公司孩i板式化学发光试剂盒)临床血样测值比对的相关曲线。具体实施方式实施例1制备本发明的肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂合一、肿瘤相关抗原125校准品的制备用马血清将肺瘤相关抗原125纯品稀释成校准品，浓度分别为0U/mL、20U/mL、80U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL，共6瓶。二、肿瘤相关抗原125单克隆抗体包^^兹微粒与生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合液的制备1、肺瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒的制备将粒径为23pm^磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀3小时后，加磁场，静置2025min,倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐緩冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50100mg/mL;每毫升悬浮液中加入肿瘤相关抗原125单克隆抗体40100吗，在4。C下搅拌过夜后，加磁场，静置1015min，倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭34小时；最后用pH值为7.4、含吐温-20和叠氮化钠防腐剂的磷酸盐洗涤緩冲液清洗35次，并用该溶液配制成5~10mg/mL的工作液。磁微粒在4°C保存。2、生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体的制备生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体以生物素琥珀酰亚胺酯在孩"威性条件下与单抗发生偶联反应，对PBS充分透析，生物素标记物以小牛血清稀释，加入proclin300，-20。C以下保存。3、混合液的制备将肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒与生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体以体积比为1:1混合，以20~40%小牛血清配制而成。三、辣根过氧化物酶标记的链亲和素的制备以l束才艮过氧化物酶标记链亲和素采用改良过石舆酸钠法，具体标记过程如下溶解4.4mgHRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(5Ommol/L)室温搅拌20min,经lmmol/L醋酸钠緩冲液，pH4.4透析后加入8mg链亲和素，搅拌2h，最后用200mmol/LNaBH4进行还原，经0.02MPBS緩冲液透析后，加等体积甘油，-20。C以下保存。'四、酶标记物的浓度选定采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1:3000-5000。，五、酶标记物稀释液Tris12.120gBSA5gProclinlmL双蒸水1000mL六、化学发光底物本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法A液在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1MpH值为8.5的Tris-HCl緩冲液。在此緩冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对石典笨酚。B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和杵檬酸，配制成0.1MpH值为4.6的柠檬酸緩冲液，在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。使用方法A、B液双组分试剂，在使用前根据使用量等体积混合。七、洗涤緩冲液洗涤緩冲液是含有0.1~0.5%吐温-20、0.1。/。叠氮化钠防腐剂的磷酸盐緩冲液，pH值为7.4。使用时用蒸馏水稀释20倍。/\、半成品及成品纟且成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。实施例2本发明的试剂盒的使用方法一、样品前处理取人的空腹晨血清样品，3000rpm离心5min,取上层液25pL进行分析。二、4企测方法使用本试剂盒进行实验前，需先取出抗体包被磁微粒与生物素标记抗体的混合液、校准品/待测样品、酶标记的亲和素在室温放置15-30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37°C;再后，准备好合适的^t量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。使用本试剂盒按照实施例2的方法进行实验的具体操作步骤如下将圓底聚苯乙烯试管编号后，向试管中加入25iaL血清样品或系列校准品溶液，校准品每管加0U/mL、20U/mL、80U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL各25faL，再加入抗体包被磁微粒与生物素标记抗体的混合液50|iL，37。C振荡反应30min。用洗涤液清洗三遍后，加入辣才艮过氧化物酶标记的链亲和素50pL，37。C振荡反应15min。之后，将试管架置于磁分离器上分离5min,然后倒转分离器倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500pL,充分混匀，置于磁分离器上分离5min,倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复3次。各管加入化学发光底物200~400pL,充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置10min，而后在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的CA125的浓度，见附图1,其中，I为发光强度，C为CA125浓度(单位为U/mL),相关系数r=0.9991,Y=4.23+0.85X。实施例3本发明的试剂盒的方法学检定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下1、试剂盒精密度测定(1)校准品精密度实验将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，每批抽取10个试剂盒。以实施例1中所抽取的试剂盒测定80U/mL的CA125校准品5次。计算测定浓度的变异系数。实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表1所示，结果表明变异系数在3.0%~8.5%之间。表lCA125校准可重复性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)样本可重复性实验取两份正常人血清，分别添加CA125校准品至80U/mL和200U/mL。取实施例1中三个不同批次的试剂盒各3个，对样品重复测定5次，分别计算变异系数。测定结果如表2、表3所示，表明本发明所制备的CA125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒测定血清样本的变异系数小于2.1%。表280U/mLCA125血清样品可重复性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3200U/mLCA125血清样品可重复性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2、试剂盒准确度测定取两个CA125临床定值血清，浓度分别为37.8U/mL和103.6U/mL,分别向其中加入CA125的校准品溶液20U/mL、80U/mL和200U/mL,按照实施例1的方法对每个浓度做3个平行，计算回收率。结果如表4所示，表明CA125的添加回收率在86.8%~99.6%之间。表4实施例l的试剂盒的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、试剂盒稳定性实验对实施例1的试剂盒进行37。C7天加速实验后，测定试剂盒的最大、最低发光强度、待测物的加标回收率，表明实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内。对实施例1的试剂盒主要组分(抗体包被磁微粒与生物素标记抗体的混合液、辣根过氧化物酶标记的链亲和素溶液、校准品、发光底物液和洗涤緩冲液)进行28°C8个月的跟踪实验，结果表明各项指标完全符合临床要求。考虑到试剂盒冷冻情况的发生，将实施例1的试剂盒放入-2(TC冷冻7天，测定结果也表明试剂盒的各项指标完全正常。从以上结果可以看出试剂盒可以在2~8。C至少可以保存6个月以上。经过大量的实验证明，本发明试剂盒的方法学指标如下氺全测范围0800U/mL;灵敏度最小检出限为0.3U/mL;精密度小于10%(n=30);准确性平均回收率在85.0%~100.0%之间；特异性与CA19-9、CEA、AFP、CA50、CA153等常见的肺瘤标志物的交叉反应率小于0.1%;稳定性各试剂组分置37t:,考察7天后，各组分仍稳定。说明"肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒"的临床检测范围、灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全符合临床要求的。综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性、磁微粒的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和封闭液进行实验，选择出最适合的包被液和封闭液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心两步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测及筛查实验室，可有效地诊断恶性浆液性卵巢癌，并可用于卵巢癌手术和化疗后的疗效观察。实施例4本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对用本发明的试剂盒和Monobind公司的CA125微板式化学发光试剂盒对80份肿瘤病人的临床血清样品同时进行检测，所采用的80份临床血样来自首都医科大学附属天坛医院和首都医科大学附属友谊医院。其检测结果见附图2，以本发明方法测定的血样CA125结果为横坐标，.以Monobind测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为Y=1.010X-1.055,相关系数r=0.9850。经统计学处理结果表明，本发明方法同国外试剂盒临床血样测值相关性良好。权利要求1、一种肿瘤相关抗原125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)肿瘤相关抗原125校准品；2)肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒和生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合液；3)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；4)上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；以及5)反应管。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肝瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒与生物素标记的肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合比例为1:1。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值为8.5的Tris-HCl緩冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；B液是0.1MpH值为4.6的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的反应管材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)以肿瘤相关抗原125纯品配制才交准品；2)配制肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被磁微粒和生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体的混合液；3)以辣才艮过氧化物酶标记链亲和素；4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；5)分装上述校准品、抗体包被^t微粒和生物素标记抗体的混合液、酶标记物、化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺和反应管；以及6)组装为成品。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述配制抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液的步骤2)中所述的混合液是由肿瘤相关抗原125单克隆抗体包被的磁微粒和生物素标记的肺瘤相关抗原125单克隆抗体以体积比为1:1混合，以2040%'的小牛血清配制而成；所述磁微粒为23(im粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为510mg/mL;所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法将胂瘤相关抗原125单克隆抗体包被于磁微粒上；以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭液为含有0.2%1.0%牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液；所述生物素标记肿瘤相关抗原125单克隆抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体游离赖氨酸发生偶联反应而实现的。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基团为氨基或羧基。8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根过氧化物酶标记链亲和素的步骤3)中，采用改良过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值为8.5的Tris-HCl緩冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；B液是0.1MpH值为4.6的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氩溶液。10、如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作为反应管材料。全文摘要本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种CA125磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明试剂盒包括1)CA125校准品；2)CA125单克隆抗体包被磁微粒和生物素标记CA125单克隆抗体的混合液；3)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；4)化学发光底物；以及5)反应管。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法为1)以CA125纯品配制校准品；2)配制抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液；3)用辣根过氧化物酶标记链亲和素；4)配制化学发光底物；5)分装上述校准品、混合液、酶标记物、化学发光底物和反应管；以及6)组装为成品。本发明试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。文档编号G01N33/577GK101398431SQ20071012256公开日2009年4月1日申请日期2007年9月27日优先权日2007年9月27日发明者应希堂,李振甲,林金明,栩王,胡国茂申请人:北京科美东雅生物技术有限公司