用于药物发现的单分子平台用于包括抗癌和抗病毒剂的发现的药物发现的方法和装置的制作方法

专利名称：用于药物发现的单分子平台用于包括抗癌和抗病毒剂的发现的药物发现的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及耙向包括DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶的酶的药物候 选物的筛选和验证。
背景技术：
在临床使用中，大约百分之三十的药物抑制疾病相关酶促过程(瑞.艾.科 普兰(Copeland，R.A.),药物发现中的酶抑制剂的评估药物化学家和药理学 家指南(Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery: a guide for medicinal chemists and pharmacologists).(威立国际-牛学公司 (^Wiley-Interscience )， 2005))。因此，新颖酶抑制剂的发现是生物化学和药理学中的重要研究领域。
聚合酶抑制剂在临床和研究设定中具有价值。这些抑制剂有助于阐明转录 和DNA复制的机理方面，有助于绘制结构-功能关系，且有助于表征蛋白质活 性。聚合酶抑制剂还是最吸引人的药物靶之一。关于这些抑制剂、其结构和其 机制的知识使得能够设计将有效抵抗新病原体和已知病原体的抗生素抗性突 变体的新药物，诸如抗癌剂、抗病毒剂和抗生素。因为已报道这些抑制剂中的 一些诱导和/或抑制细胞凋亡，所以其也提供用于研究细胞凋亡的有价值工具。 同样，因为这些药剂中的一些阻断DNA转录的特定步骤，所以聚合酶抑制剂 可有助于阐明在各种健康和疾病状态下转录控制在调控靶基因表达中的作用。
靶向特定疾病路径所涉及的聚合酶蛋白质的药物为本领域所熟知。举例来 说，逆转录酶抑制剂(reverse transcriptase inhibitors, RTI)是一种通过抑制逆 转录酶的活性而耙向病毒DNA的构建的抗逆转录酶病毒药物。存在两种具有 不同作用机制的RTI亚型核苷和核苷酸类似物RTI被并入病毒DNA中，从
4而导致链终止，而非核苷类似物RTI则充当逆转录酶的竟争性抑制剂。当前通 过抑制fflV逆转录酶而起作用的AIDS治疗剂在本领域中有所描述(参见例如， 宾(Bean)等人，应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672
(2005 ))，且包括依发韦仑(Efavirenz)(商标名称SUSTIVA⑧和STOCRIN ) 和奈韦拉平(Nevirapine)(也以商品名称VIRAMUNE辦肖售)。耙向聚合酶蛋 白质(例如利福平(rifampin))的抗生素和耙向聚合酶蛋白质(例如顺柏
(cisplatin ))的癌症药物也为本领域中所已知。
已发现许多药物有效治疗癌症。这些药物包括不同化合物，诸如抗代谢物
(例如，曱氨蝶呤(methotrexate)和氟尿嘧吱(fluorouracil))、 DNA损伤剂
(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide )、顺铂和阿霉素(doxorubicin))、有丝 分裂抑制剂(例如，长春新碱(vincristine ))、核苷酸类似物(例如，6-巯基噪 呤)、DNA修复所涉及的拓朴异构酶的抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide))、 DNA聚合酶的抑制剂(例如，博莱霉素(bleomycin))和嵌入剂(intercalating agent, ^口米4乇'蒽酉昆(mitoxantrone))。
目前，正在研究数种靶向哺乳动物DNA复制的酶的药物来作为用于癌症 化学疗法的有前途候选物或作为用于了解特定酶在DNA复制和修复中的作用 的探针。这些潜在药物候选物包括补骨脂曱素(corylifolin)、补骨脂酚
(bakuchiol)、白藜声醇(resveratrol )、新补骨脂异黄酮(Neobavaisoflavone) 和黄豆苦元(daidzein)(参见孙(Sun)等人，天然产物化学杂志(J. Nat. Prod.) 61,362-366 ( 1998))。
DNA和RNA聚合酶抑制剂的其它实例包括放线菌素D( Actinomycin D )、 链霉菌属的种(浙e/7tom戸s sp.); a-鶴膏毒肽(a-Amanitin )、我鸟膏属(爿應w'to sp.);阿非迪霉素(Aphidicolin)、 HSV复制抑制剂、BP5; a-鹅膏毒肽油酸曱 酯；新生霉素(Novobiocin).钠盐；利福平；RNA聚合酶III抑制剂；和7-氨基-放线菌素D。目前在II期试验中用于抵抗丙型肝炎病毒的三种聚合酶抑 制剂是艾德尼克斯公司/诺华公司(Idenix/Novartis )的瓦洛他滨(valopicitabine )
(NM283 );维诺公司(ViroPharma)的HCV-796;和罗氏公司(Roche)的 R1626。罗氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作为HBV治疗初 始成功后的II期HCV试验中研究伐托他滨(valtorcitabine， val-LdC )，第一链病毒DNA合成抑制剂。
DNA损伤剂提供一些用于癌症的最成功治疗。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP)可有助于修复由用于治疗癌症的DNA损伤剂引起的DNA损伤。 因为PARP活性常常在癌细胞中增加，所以其提供这些细胞的存活机制。举例 来说，ABT-888 (雅培肿瘤学公司(Abott Oncology ))是由雅培公司(Abbott) 开发用于防止癌细胞中的DNA修复且增加常见癌症疗法(诸如放射和烷基化 剂)的有效性的口服PARP抑制剂。此外，临床前数据表明ABT-888改善放 射和许多类型的化学疗法在动物癌症模型中的有效性。
这些选自最近5年的公开出版物说明关于聚合酶抑制剂的活性、机制和生 物化学的当前技术水平
杰 艾 布朗(Brown JA),威 瓦.杜姆(DuymWW),杰 德 福勒 (Fowler JD )，佐.索(Suo， Z.) . (2007)"在由人类DNA聚合酶X和卩催化 的缝隙填补合成期间8-氧代-7，8-二氢-2'-脱氧乌苷的诱变潜力的单转换动力学 分才斤 (Single-turnover Kinetic Analysis of the Mutagenic Potential of 8國Oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine during Gap-filling Synthesis Catalyzed by Human DNA Polymerases lambda and beta)."分子生物学杂志(J Mol Biol.)[电 子出版先于印刷]。
佐.索(Suo，Z.),玛 艾 阿卜杜拉(AbdullahMA) . (2007)"丙型肝 炎病毒NS2-3蛋白酶的独特复合活性位点抗病毒药物设计的新时机(Unique Composite Active Site of the Hepatitis C Virus NS2- 3 Protease: a New Opportunity for Antiviral Drug Design).，，化学与医药化学(ChemMedChem.) 2(3), 283-284。
玛.普.勒特格(RoettgerMP),卡.玛 费埃拉(FialaKA),斯.桑帕 理(Sompalli S )，伊.东(Dong Y)，佐 索(Suo Z) . (2004)"人类DNA 聚合酶mu的保真度的稳态前动力学研究(Pre-steady-state kinetic studies of the fidelity of human DNA polymerase mu)"，生物化学(Biochemistry) 43(43)， 13827-38。
卡.玛.费埃拉(FialaKA)，威.阿布戴尔-加瓦德(Abdel-Gawad W), 佐.索(SuoZ) . (2004)"由截短人类DNA聚合酶人催化的聚合的保真度和
6机制的稳态前动力学研究(Pre隱steady-state kinetic studies of the fidelity and mechanism of polymerization catalyzed by truncated human DNA polymerase lambda).，，，生物化学(Biochemistry) 43(21), 6751-62。
卡.玛 费埃拉(Fiala,K. A)和佐 索(SuoZ) .* (2004)疏磺矿疏化 叶菌P2 DNA聚合酶IV的保真度的稳态前动力学研究(Pre-Steady State Kinetic
学(Biochemistry) 43,2106-2115。
卡 玛.费埃拉(Fiala，K.A)和佐 索(Suo Z ) .* (2004)由碌u^矿硫 化叶菌P2 DNA聚合酶IV催化的DNA聚合的4几制(Mechanism of DNA
物化学(Biochemistry ) 43,2116-2125。
卡.玛.费埃拉(Fiala,K.A),威.阿布戴尔-加瓦德(Abdel-Gawad, W.) 和佐.索(Suo Z) * ( 2004 )由截短人类DNA聚合酶X催化的聚合的保真度 和机制的稳态前动力学研究(Pre-Steady國State Kinetic Studies of the Fidelity and Mechanism of Polymerization Catalyzed by Truncated Human DNA Polymerase Lambda).生物化学(Biochemistry),已接收和付印。
阿 杰 艾力森(Allison, A. J.)，艾'雷(Ray,A.)，佐 索(SuoZ..), 杰.玛.哥拉仙奴(Colacino, J. M.)，卡.斯.安德森(Andeson, K. S.)，卡'艾'约 翰逊(Johnson, KA.) (2001 )"抗病毒核苷类似物和人类线粒体聚合酶的毒性 (Toxicity of Antiviral Nucleoside Analogs and the Human Mitochondrial DNA Polymerase)",生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 276,40847-40857。
新药物是长期且复杂的药物开发工艺的产物，其中第一步是发现具备有前 途活性的化合物。新颖酶抑制剂可通过筛选抵抗靶酶的药物候选化合物的文库 来发现。常规药物筛选和验证方法利用微米级到毫米级生物化学或细胞测定来 检测酶促干扰的下游生物化学或细胞特征。鉴于常规药物筛选方法的局限性， 本领域中仍需要用于^r测有前途的药物候选物的方法和装置。

发明内容
本申请揭示了用于单分子药物筛选、发现和验证的方法和装置。这些方法 和装置允许使用者使用单分子的观察结果快速检测药物候选物是否和如何干扰特定疾病路径所涉及的靶酶。本文所述的方法和装置利用单分子操纵和检测 技术(例如，光4聂或磁4聂)来直接检测靶酶-底物相互作用的特征动力学或"机
械特征(mechinal signature )"是否实质上由药物候选物改变或调节。此外，所 述方法和装置适用于分析机械特征的调节以便鉴别药物候选物的潜在干扰机制。
本发明的一方面中，本文所揭示的方法和装置涉及监测在抑制或者调节聚 合过程的药物候选物存在下个别聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶 和逆转录酶)沿多核苦酸底物的实时动力学机械特征。所述药物候选物的鉴别 和分析对于抗病毒、抗癌和抗生素药物的发展至关重要。


图1说明本发明的用于筛选多种靶向特定酶的药物候选物的方法方面的 示例性流程图。
图2说明在各种药物候选物(诸如聚合酶抑制剂)存在下DNA聚合酶的 示例性机械特征。图2的A板(panel)展示预期来自不存在聚合酶抑制剂的 对照样品的代表信号。在这种情况下，聚合酶结合单链(ss) DNA且将这个 模板转化为双链(ds)DNA，从而稳定地随时间缩短总模板长度。B板展示预 期来自将指示药物候选物已减慢复制过程的光镊装置的示例性机械特征。应注 意，对应于聚合速度的模板长度图(plot)的总斜率已变小。C板展示来自指 示药物候选物已诱导失败转录/提前终止的光镊装置的示例性机械特征，其中 所述药物候选物在其正常完成点前突然中止或停止复制过程。D板展示来自指 示DNA复制起始由药物候选物抑制的光镊装置的示例性机械特征。E板展示 来自指示药物候选物诱导聚合酶以核外溶解(exonucleolysis )模式操作的光镊 装置的示例性机械特征，其中其切去碱基而不是使碱基对聚合。这个特征将仅 可能出现于具有活性核外溶解或"校对"位点的聚合酶中。
图3说明本发明的用于筛选多种靶向特定聚合酶的药物候选物(包括DNA 和RNA聚合酶抑制剂以及逆转录酶抑制剂)的方法方面的示例性流程图。
图4a说明用于通过基于光镊的单分子测量系统获得对聚合酶沿核酸模板 的位置的测量的示例性实验几何形状。此时，DNA分子保持固定且当聚合酶 沿DNA模板移动时，所迷分子在两个塑料胶乳珠粒之间延伸。在DNA复制
8的情况下，两个珠粒之间的距离在特定力下减小，因为模板DNA从单链转化 为双链DNA。将核酸附着于珠粒的方法可通过抗生蛋白链菌素-生物素或地高 辛(dig) -抗-dig或其它共价键进行。
图4b说明用于通过基于光镊的单分子测量系统获得在由聚合酶加工核酸 时核酸的长度的另外示例性实验几何形状。此时，DNA分子保持固定且在塑 料胶乳珠粒与抗生蛋白链菌素包被的(三角形)玻璃表面之间延伸。当在DNA 复制中聚合酶沿DNA模板移动时，DNA范围的长度在特定力下减小，因为固 定的模板DNA从单链转化为双链DNA。
图4c说明本发明的一个实施方式，其中核酸模板附着于通过左侧所示的 第二固定光阱(optical trap)固持的电介质珠粒，所述光阱发挥比聚合酶对核 酸模板所施加的力大得多的强捕获力。此时，通过相关亲和力化学使聚合酶附 着于另一珠粒。图4-d证明核酸如何可通过核酸模板与刚性表面的互补功能化 作用而固定于诸如盖玻片或微孔板的刚性表面上，同时再次使聚合酶附着于第 二个珠粒。
图5a示意地说明单分子检测系统，其包括包含捕获、力检测、波束控制 (beam steering)和等张力能力的代表性光镊装置和维持所捕获的珠粒上的恒 力(甚至当珠粒由于聚合酶的酶促活性而经受其它力时)的力反馈光学捕获子 系统。
图5b说明单分子跟踪系统中的检测系统,通过所述系统利用四象限光电 二极管来检测电介质球距离光阱中心的位移。将珠粒相对于光阱的位置记录在 这个四象限光检测器上。 -使用从这个光井(optical well)中心产生的偏移来量 化作用于珠粒的皮牛顿(picoNewton)大小的力。
图6a和图6b说明证明用光镊装置观察DNA聚合酶马达在沿DNA模板 向前(聚合，图6a)和向后(核酸外切酶活性，图6b)移动时的动力学的能 力的数据。约0.5微米/分钟的速度对应于约25个聚合的碱基对/秒。在所述图 中，聚合酶沿DNA的位置是以时间函数展示。斜率给出在特定力下DNA模 板在复制时的长度的变化速率。这正是聚合酶马达的单分子速度。
图7说明探测DNA聚合的更精细结构动力学的能力。为达到这个分辨率 程度，优选利用声光偏转器系统来达到在聚合期间沿DNA链的等张力条件。在所述图中，展示DNA的延长(pm)与时间(min)的关系。在左图中，黑线展示完整数据集，包括在收缩(右侧方框区域)开始前由流动引起的松弛(左方框区域)。在右图中，展示收缩区域的延长与时间的关系。原始数据线展示原始长度-时间数据，而平滑线展示这个数据的100-pt邻近平均值。直线表示这个收缩区域中的平均斜率，约300个碱基对/秒。图8说明药物筛选和发现的常规方法的关键特点。图9说明本文所述的新颖药物筛选和发现技术的关键特点。图10说明本文所述的新颖药物筛选和发现技术与药物筛选和发现的常规方法相比的一些优点。
具体实施例方式
DNA和RNA聚合酶和逆转录酶(RT)抑制剂在临床和研究设定中具有价值。这些抑制剂有助于阐明转录和DNA复制的机理方面，有助于绘制结构-功能关系，且有助于表征蛋白质活性。这些聚合酶和RT抑制剂还是最吸引人的药物靶之一。关于这些抑制剂、其结构和其机制的知识使得能够设计将有效抵抗新病原体和已知病原体的抗生素抗性突变体的新药物，诸如抗癌剂和抗生素。因为已报道这些抑制剂中的一些诱导和/或抑制细胞凋亡，所以其也提供用于研究细胞凋亡的有价值工具。同样，因为这些药剂中的一些阻断DNA转录的特定步骤，所以聚合酶抑制剂可有助于阐明在各种健康和疾病状态下转录控制在调控把基因表达中的作用。
靶向特定疾病路径所涉及的聚合酶蛋白质的药物为本领域所熟知。举例来说，逆转录酶抑制剂(RTI)是一种通过抑制逆转录酶的活性而靶向病毒DNA的构建的抗逆转录酶病毒药物。存在两种具有不同作用机制的RTI亚型核苷和核苷酸类似物RTI被并入病毒DNA中，从而导致链终止，而非核苷类似物RTI则充当逆转录酶的竟争性抑制剂。当前通过抑制HIV逆转录酶而起作用的AIDS治疗剂在本领域中有所描述(参见例如，宾(Bean)等人，应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672 (2005 )),且包括依发韦仑(商标名称SUSTIVA⑧和STOCRIN )和奈韦拉平(也以商品名称VIRAMUNE⑧销售)。
已发现许多药物有效治疗癌症。这些药物包括不同化合物，诸如抗代谢物
10(例如，曱氨蝶呤和氟尿嘧啶)、DNA损伤剂(例如，环磷酰胺、顺铂和阿霉 素)、有丝分裂抑制剂(例如，长春新碱)、核苷酸类似物(例如，6-巯基噪呤)、 DNA修复所涉及的拓朴异构酶的抑制剂(例如，依托泊芬)、DNA聚合酶的 抑制剂(例如，博莱霉素)或嵌入剂(如米托蒽醌)。
目前，正在研究数种靶向哺乳动物DNA复制的酶的药物来作为用于癌症 化学疗法的有前途候选物或作为用于了解特定酶在DNA复制和修复中的作用 的探针。这些潜在药物候选物包括但不限于补骨脂曱素、补骨脂酚、白藜,醇、 新补骨脂异黄酮和黄豆苷元。(引用孙(Sun)等人)
DNA和RNA聚合酶抑制剂的其它实例包括放线菌素D,链霉菌属；a-鹅膏毒肽，鹅膏属；阿非迪霉素;HSV复制抑制剂，BP5; a-鹅膏毒肽油酸曱 酯；新生霉素，钠盐；利福平；RNA聚合酶III抑制剂；7-氨基-放线菌素D。 目前在II期试验中用于抵抗丙型肝炎病毒的三种聚合酶抑制剂是艾德尼克斯 公司/诺华公司(Idenix/Novartis)的瓦洛他滨(NM283 );维诺公司(ViroPharma) 的HCV-796;和罗氏公司(Roche )的Rl626。
罗氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作为HBV治疗初始成 功后的II期HCV试验中研究伐托他滨(val-LdC ),第一链病毒DNA合成抑 制剂。
DNA损伤剂提供一些用于癌症的最成功治疗。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP )可有助于修复由用于治疗癌症的DNA损伤剂所引起的DNA损伤。 因为PARP活性常常在癌细胞中增加，所以其提供这些细胞的存活机制。举例 来说，ABT-888是由雅培肿瘤学公司(Abott Oncology )开发用于防止癌细胞 中的DNA修复且增加常见癌症疗法(诸如放射和烷基化剂)的有效性的口服 PARP抑制剂。此外，临床前数据表明ABT-888改善放射和许多类型的化学疗 法在动物癌症模型中的有效性。
新药物是长期且复杂的药物开发工艺的产物，其中第 一步是发现具备有前 途活性的化合物。新颖酶抑制剂可通过筛选抵抗靶酶的药物候选化合物的文库 来发现。药物候选物包括自然界中所见的化合物，通过組合化学方法合成的化 合物，以及通过合理的药物设计形成的化合物。常规药物篩选和验证方法利用 微米级到毫米级生物化学或细胞测定来检测酶促干扰的下游生物化学或细胞特征。举例来说，测定可通过放射性标记来测量通过靶酶催化合成的反应产物的量的任何变化。
单分子技术提供相对于用于药物筛选的常规试管内测定方法的数种关键益处，因为其使用较少试剂且提供较多关于药物作用于靶的机制的斧清。举例来说，单分子技术使得能够观察到瞬时状态，从而使分离这些步骤的化合物的选择性筛选成为可能。因此，单分子方法使得能够鉴别、检验和验证靶向生物化学过程中的关键阶段(例如，转录或复制起始)的聚合酶或酶抑制剂。许多生物化学过程由多个瞬时步骤组成，诸如转录中的启动子结合、起始、延伸和终止。因为潜在药物靶的总数可能极高，所以单分子方法提供通过在早期仅致力于药物筛选和发现工艺中受药物候选物影响最大的那些步骤来加速所述工艺的关键优点。
通过阐明DNA/RNA复制、修复所涉及的酶的动力学机制，可基于合理的
药物设计来鉴别抗病毒和抗癌药物候选物。动力学研究使用各种稳态前动力学
方法，包括快速化学中止流动(quench-flow)和停流(stopped-flow)技术。
这些方法允许反应中止几毫秒，iU是供比传统稳态动力学方法更多的动力学信息。单分子技术阐明在酶的活性位点处进行的反应的基本步骤且可显著增强合
理的药物设计。
每个人体细胞中的DNA每天自发地受损10,000次以上。DNA修复对维持细胞中的基因组完整性起主要作用。
对于生物恐怖分子有可能释放天花的担心已导致密集地努力寻找有效抑制尚不存在的病毒感染的分子。因为天花病毒(smallpox virus/variola virus )和天花疫苗(牛痘病毒)高度同源，所以后者已用作极好的代替模型。举例来说，牛痘病毒DNA聚合酶与天花病毒中的聚合酶约99%—致。
丙型肝炎病毒已感染至少2-3°/。的人口 。已集中研究病毒基因組复制。RNA依赖性RNA聚合酶NS5B是病毒复制的核心，且是主要抗病毒药物靶。尽管存在对这个聚合酶的广泛生物化学和稳态动力学研究，但由NS5B催化的核苷酸合并的基本步骤仍然不明确。这些研究调查使核苷抑制剂的合理设计成为可能。 -
在最近十年中，已开发出新工具(例如光镊、原子力显微术和小玻璃纤维)
12来操纵小物体以及研究所研究的系统所涉及的力(参见例如，史密斯(Smith)等人，科学(Science )271:795 ( 1996 )和克鲁泽尔(Cluzel )等人，科学(Science)271,795 ( 1996))。尤其，光或磁"镊"或"阱"用通过光强梯度所产生的力捕获粒子，且可用于在单分子水平上操纵和研究显微镜可见的分子。强到足以形成三维阱的用光学方法所产生的力可通过用高数值孔径透镜使具有适当成形波阵面的激光束达到紧密焦点来获得。光学捕获的原理为本领域所熟知且总结于(例如)诺埃曼(Neuman)和布洛克(Block),科学仪器研究(Rev. Sci.Instr.) 75:2787-2809 ( 2004)中。
在生物科学中，已使用光镊来测量在尺寸范围为lOnm到超过lOOmm的分子的nm范围内的位移。为大多数光镊生物物理学实验所通用的是电介质珠粒附着于生物分子(例如底物和/或酶)，以致所述生物分子可由光阱操纵且可进行机械测量。各种生物化学和分子生物学方法为用于将核酸、其它底物、酶和其它生物大分子附着于功能化表面和珠粒的技术所已知。举例来说，DNA可用将结合市售的包被抗生蛋白链菌素、微米涂层的电介质球(例如，来自邦斯实验室(Bangs'Laboratories))的生物素部分进行标记。
如DNA和RNA聚合酶的分子马达的研究(参见例如，达文波特(Davenport)等人，科学(Science) 287:2497-2500 (2000);马耶尔(Maier)等人，PNAS97:12002-12007 ( 2000 );王(Wang)等人，科学(Science ) 283:902-907 ( 1998 );怀特(White)等人，自然(Nature) 404:103-106 (2000);和殷(Yin)等人，科学(Science) 270:1653-1656- ( 1995 ))。举例来说，研究人员已能够测量"拉开"双链DNA所必需的力的序列依赖性(沃尔伽拉基斯(Voulgarakis)等人，纳米通讯(Nano Letters) 6,1483-1486 (2006))。另外，使用光镊来阐明运动蛋白沿微管移动的机制(郭(Kuo)和希兹(Sheetz),科学(Science) 260, 232(1993)和布洛克(Block)等人，自然(Nature) 348， 348-352 ( 1990))。最近，研究人员以单碱基对分辨率检测RNA聚合酶沿DNA分子的步进动作(阿邦丹谢里(Abbondanzieri)等人，自然(Nature) 438,460-465 (2005))。在纳米生物公司(Nanobiosym)，已利用高分辨率光镊在实验上证明各种环境因素对聚合酶的动力学的作用(高尔(God)等人，自然(Nature),已付印的纳
13米技术综述文章(Nanotechnology review article in press ))。
在所有所述研究中，都利用光^l聂直接测量底物-酶相互作用的机械动力学。 在这些研究中，所采用的实验设置和测量的详情取决于所涉及的酶和/或底物 的生物功能。举例来说，所关注的机械测量可包括底物聚合物的弹性，包括 拉伸和松弛动力学；酶(诸如结合核酸的聚合酶)"加工"线性底物的时间依 赖性速度；由酶促结合引起的底物的变形；和/或底物结合和加工的效率或准 确度。通过将位置和/或力感应子系统整合到光镊装置中，使所有所述测量成 为可能。
本文揭示用于单分子药物筛选、发现和验证的新颖方法和装置。这些方法 和装置允许使用者在单分子水平上快速^f企测药物候选物是否和如何千扰特定 疾病路径所涉及的酶-底物相互作用。尤其是，可观察到候选物药物与单靶酶 分子之间的相互作用。本文所述的方法和装置利用单分子操纵技术(例如光或 磁镊或阱)在单分子水平上直接检测药物候选物是否可用机械方法或用化学方 法改变酶-底物相互作用。
在一优选实施例中，可利用本发明的方法和装置来快速筛选、检验和验证 修饰、抑制或者干扰诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA逆转录酶等聚合 酶的新药物候选物且较好地阐明抑制聚合酶/底物相互作用的机制。
对底物的正常酶促活性产生动力学"机械特征(mechanical signature )，，。 如本文所使用，术语"机械特征"指的是酶的单分子在与其底物相互作用时的 生物机械痕迹。所述生物机械痕迹可使用可检测nm范围内的位移的仪器(诸 如光镊)来测量。如上文所述，这个动力学机械特征可通过进行"机械测量"， 例如通过测量以下变化来确定底物聚合物的弹性，包括拉伸和松弛动力学； 酶(诸如结合核酸的聚合酶)"加工，，线性底物的时间依赖性速度；由酶促结 合引起的底物的变形；和/或底物结合和加工的效率或准确度。
如本文所使用，术语"机械测量"意指对底物-酶相互作用的机械动力学 的测量，其中所述机械测量检测靶酶的单分子和/或所述靶酶的底物的单分子 的机械特征。"进行机械测量"包括(例如)测量以下变化底物聚合物的弹 性，包括拉伸和松弛动力学；酶(诸如结合核酸的聚合酶)"加工，'线性底物 的时间依赖性速度；由酶促结合引起的底物的变形；和/或底物结合和加工的效率或准确度。
优选"机械测量"是对逆转录酶、DNA聚合酶或RNA聚合酶沿多核苷酸 (例如DNA或RNA )底物的移动的测量。因此，在下文更详细i仑述的所述方 法的特定实施例中，通过光学捕获技术来监测在药物候选物存在和不存在下聚 合酶沿核S吏序列的实时单分子动力学。本文未明确描述、但也可通过单分子枱r 测技术(例如光镊)测量的聚合酶/底物相互作用的其它机械测量也是有可能 的。
机械测量可在药物候选物存在或不存在下进行。"基线机械特征"是通过 在药物候选物不存在下进行的机械测量确定的机械特征。
如本文所使用，术语"耙"或"药物耙"指的是疾病路径所涉及的生物分 子。抑制或者千扰所述靶的活性可有益于治疗和/或预防所述疾病。如本文所 使用，术语"靶酶"指的是疾病路径所涉及的酶。通常，靶酶是对疾病状况或
所涉及的关键酶。"耙酶的活性"意指所述耙酶与靶酶的底物的相互作用。
适合于本发明的靶酶包括结合DNA和/或RNA且与DNA和/或RNA相互 作用的酶。实例包括聚合酶，诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶；拓 朴异构酶；促旋酶；核酸外切酶；和解旋酶。靶酶可为人类酶，举例来说，诸 如癌症的疾病路径所涉及的人类酶。在另一实施方式中，靶酶可为病毒或细菌 酶，诸如病毒和/或细菌介导的疾病所涉及的病毒或细菌酶。也涵盖其它4效生 物酶作为适合于本发明的輩巴酶。
优选把酶为聚合酶，诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。癌症路
径所涉及的聚合酶，特别是人类癌症路径所涉及的人类DNA聚合酶尤其优选。 病毒介导的疾病路径所涉及的聚合酶，特别是人类的病毒介导的疾病路径所涉
及的病毒逆转录酶(例如嗜肝DNA病毒(hepadnaviral)逆转录酶，诸如乙型 肝炎逆转录酶，和逆转录酶病毒逆转录酶，诸如HIV-1逆转录酶)也尤其优选。
本发明也适合于筛选可与疾病路径所涉及的非酶靶相互作用的药物候选 物。非酶靶的代表性实例为微管和核糖酶(诸如核糖体)。尤其是，核糖体使 用RNA作为模板来构造多肽链，且因此可被视为巨酶。
如本文所使用，术语"靶酶的底物"(或"酶底物"或"底物")指的是靶酶产生作用的分子。酶催化涉及一种或一种以上底物的化学反应。酶底物为本 领域所熟知。
优选底物包括聚合酶底物，诸如多核香酸(例如DNA和RNA )。多核苷 酸底物在本文中又称为多核苷酸或核酸"模板"。多核苦酸底物可为双链或单 链DNA或RNA序列。
如本文所使用，术语"药物候选物"或"候选物"指的是可抑制或者干扰 靶(尤其是靶酶)的活性的化合物。药物候选物包括自然界中所见的化合物， 通过组合化学方法合成的化合物，以及通过合理的药物设计形成的化合物。药 物候选物的实例包括与多核苷酸(例如DNA和/或RNA)相互作用或可与其 相互作用的化合物，和/或干扰或可干扰与多核苦酸相互作用的酶的活性的化 合物。所述化合物可为已知或潜在DNA改性剂，包括DNA损伤剂(例如干 扰核酸结构的嵌入剂)；DNA弯曲剂；错配结合蛋白；和/或烷基化剂。
在另一实施例中，药物候选物可为与疾病路径所涉及的非酶耙相互作用或 可与其相互作用的化合物。实例包括与微管和/或核糖体相互作用或可与其相 互作用的化合物。
接着描述可通过本发明方法探测的药物候选物的一些示例性种类。第一， 数种抗生素药物适合于由本发明方法进行询问，包括抑制或者干扰细菌聚合酶
(诸如细菌DNA聚合酶、细菌RNA聚合酶(例如利福平)和/或细菌逆转录 酶)的活性的药物。第二，本发明方法也可用于快速筛选、4企验和-验证抑制或 以某种方式干扰病毒聚合酶(特别是病毒逆转录酶)的新颖抗病毒药物候选物
(例如依发韦仑和奈韦拉平)，且较好地阐明抑制RNA-逆转录酶相互作用的 机制。第三，数种抗癌药物也适合于由我们的方法进行询问。这些药物包括抑 制或者干扰DNA聚合酶、RNA聚合酶、拓朴异构酶、核糖体和/或微管的活 性的药物(例如微管拮抗剂，诸如长春新碱和紫杉醇(taxol))。另外，也可通 过本文所述的我们的方法来发现和阐明迄今未知的完全新颖的药物机制。
如本文所使用，术语"单分子检测装置"(或"单分子检测设备")指的是 可用于在单分子水平上进行酶-底物相互作用的机械测量的装置。适合于本发 明的单分子检测装置包括用于磁性或光学捕获(例如光镊)、高分辨率荧光成 像联合量子点标记和原子力显微术的装置。可容易设想其它装置和本文所揭示
16的装置的变型。
优选单分子检测装置为包含光阱或光镊的装置。
本文所述的方法，双NANO-VALIDTM通过直接的单分子观察结果来确定 药物候选物是否改变靶酶的正常"机械特征"，从而代替用于酶促干扰的下游 效应的筛选。此外，本文所述的方法使得能够分析和确定影响酶促动力学的机 制。所述方法利用单分子操纵、检测和分析装置来确定药物候选物是否和如何 以指示酶促抑制的方式调节这个"机械特征"。
NANO-VALIDTM筛选工艺中的第一步是选择捕捉把酶的功能且可在单分 子水平上可靠地测量的机械特征。下文中，我们更详细论述适合于可用单分子 检测和操纵技术提取的特定种类的酶的示例性特征。NANO-VALIDtm方法中 的第二步是用实验方法确定在任何抑制剂(包括药物候选物)不存在下靶酶的 正常基线机械特征。如上文所讨论，通过使用单分子检测装置进行机械测量来 确定所述基线机械特征。由于所述方法的单分子性质，这可涉及采用数个实验 的总平均值。下文中，我们论述使得能够单分子机械测量数种酶的动力学的示 例性技术和装置。
为筛选各药物候选物，用相同实验技术和装置且在与用于确定基线机械特 征的条件相同的条件下进行耙酶的所选机械测量，但在单分子测定中存在所述 药物候选物。视靶酶的性质而定，可能需要首先将靶、靶的底物或两者与药物 候选物一起培养一段受控时期，随后进行此测量。
接着，进行广泛信号处理以比较候选物特异性机械特征与基线机械特征。 下文中，我们详细论述这种适合于各种酶的分析的示例性变型。如果检测到与 所述特征并无明显偏差，那么排除候选物而不必使其经受进一步筛选。这一特 点彻底地减少与药物候选物筛选、检验和验证相关的时间和成本，因为可在工 艺中更早地，在昂贵临床试验开始前更长时间即将失败的药物候选物从检验中 排除。这导致在更早期选择更多特定药物候选物，以致仅使那些更有可能成功 的候选物进入临床试验。在药物发现工艺早期的这个增加的选择性标准与常规 药物验证和发现方法相比显著减少单分子药物发现工艺的成本和时间。
然而，如果检测到与基线机械特征存在明显偏差，那么进行进一步分析和 加工以鉴别干扰的潜在机制。下文中，我们详细论述这种适合于各种酶的二次
17分析的特定实施例。如果所鉴别的机制不是疾病路径所需的，那么排除候选物 而不必使其经受进一步筛选。否则，认为候选物可用于进一步筛选和验证。
图1中总结了这种NANO-VALIDtm工艺。 用于聚合酶耙的NANO-VALIDTM
这里我们描述NANO-VALID方法的优选实施例，其适合于筛选耙向聚合 酶的药物候选物。图3中总结了所述实施例。在这个方法实施例中，始终在步 骤1中选择聚合酶沿核酸模板的时间依赖性位置以便随后在步骤2和步骤3a 中进行测量。
聚合酶主要以线性方式加工核酸模板。因此，所有聚合酶所通用的机械特 征是聚合酶沿这个底物的线性进程。当所述核酸模板与固定线对准且保持恒定 张力时，接着聚合酶的进程仅与聚合酶沿这个作为时间函数的固定线的位置有 关。
在抑制剂不存在下，聚合酶通常在起始点处结合，以相对恒定速度继续进 行且接着终止聚合。 一些次要的随机行为通常在正常聚合的过程中出现。这些 异常可包括大约几毫秒或更短时间的短暂中止、大约小于100个碱基(20-55 纳米，取决于实验条件)的短暂换向，和大约每秒几百个碱基对的聚合速度变 化。
图6中展示证明用光镊装置观察DNA聚合酶马达在沿DNA模板向前(聚 合)和向后(核酸外切酶活性)移动时的动力学的能力的数据。约0.5微米/ 分钟的速度对应于约25个聚合的碱基对/秒。在不希望受理论束缚的情况下， 推测聚合酶抑制剂通过数种机制中的一种沖击DNA聚合酶(DNAp ),每一机 制在模板长度-时间图和/或聚合速度-时间图中具有不同"机械特征"。可分析 所述图以鉴别所述机制。另外，可能存在到此为止未预见到的其它完全新颖的 机制，其也可能通过本文所述的我们的方法来发现。
图2说明哪种聚合可能看来像存在或不存在药物候选物。应注意对于所示 的图，起始点是y = 200 pm且假定聚合酶在约200分钟内从右侧(y = 200 pm ) 移动到左侧(y = 0 iam)。当药物候选物干扰聚合酶靶时，明显以数种方式中 的一种影响所述聚合酶沿核酸模板的动力学，所述方式可包括调节聚合速率， 使酶不能结合或聚合，改变酶的连续性，改变酶对所述模板的结合亲和力，或改变酶的序列依赖性保真度。这些情况的每一种都产生不同于正常聚合的机械
特征。因此，用于聚合酶靶的NANO-VALIDTM方法的这一优选实施例使用酶 的时间依赖性位置作为步骤2和步骤3a中的机械特征(参见图3， NANO-VALIDTM药物筛选和验证工艺图)。图2b展示将指示药物候选物已减 慢聚合过程的示例性机械特征。应注意，对应于平均聚合速度的图的平均斜率 已变小。 一些DNA聚合酶抑制剂可(例如)仅通过减慢DNA复制的总速度 来起作用。这个痕迹将指示通过这种机制起作用的聚合酶抑制剂药物候选物。 图2c展示指示药物候选物已诱导提前终止的示例性机械特征，其中所述药物 候选物已在其正常完成点之前突然中止或停止聚合过程。 一些DNA聚合酶抑 制剂候选物可通过所述机制来起作用。这个痕迹将指示通过这种机制起作用的 聚合酶抑制剂药物候选物。图2d展示指示聚合酶的起始受药物候选物抑制的 示例性机械特征。这个痕迹将指示通过这种机制起作用的聚合酶抑制剂药物候 选物。图2e展示指示药物候选物诱导聚合酶以核外溶解模式操作的示例性机 械特征，其中其切去碱基而不是使碱基对聚合。这个标记将仅可能出现于具有 活性核外溶解或"校对"位点的聚合酶中。这个痕迹将指示通过这种机制起作 用的聚合酶抑制剂药物候选物。
为避免错误的筛选结果，用于NANO-VALIDTM方法的这一实施例的机械 特征应按照远超过正常聚合的随机事件的尺度的长度和时间尺度。通常，对于 大多数聚合酶来说，应在所选实验条件下在使靶穿越至少5000个碱基或碱基 对的核酸模板的时间窗口上采集机械特征。
在优选实施例中，我们利用软件算法来实施步骤3b,以致我们可在步骤 3c中以高准确度确定是否应排除药物候选物。
正常聚合的随机性质要求我们在步骤2和3a中选取聚合酶动力学的显著 特点，而不是使用或比较原始数据痕迹。靶酶的性质以及所需干扰机制将决定 选取和分析哪些显著特点。这些特点可包括马达暂停的总时间、终点聚合速 度、终止效率、平均速度。通常，对于所有聚合酶来说，截止频率为100-1000 Hz的低通滤波器也将应用于原始信号以滤除酶的动力学中随机波动的效应。
使用模板长度测量的用于DNA聚合酶靶的NANO-VALID
这里，我们描述先前所述的适合于作用于单链DNA模板的DNA聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法的变型实施例。单链DNA模板中的每一碱基在标准 环境条件下和约0-1 pN的恒定模板张力下具有约0.7 nm的长度。DNA聚合酶 将模板上的每一未配对的碱基转化为在相同环境和恒定张力条件下具有约 0.34 nm长度的碱基对。因此，在等张力条件下，当DNA聚合酶复制线性模 板，从而使单链DNA转化为双链DNA时，两种状态的弹性的差异引起DNA 链中每一在特定力下聚合的碱基对缩短约0.36nm。因此，在聚合期间在恒定 DNA模板张力下跟踪DNA链的长度类似于跟踪聚合酶沿固定模板的位置。因 此，在这种方法变型的步骤2和步骤3a中，直接通过单分子测量装置所获得 的机械特征是DNA模板随时间的长度。先前对于分析步骤3b和步骤3d中聚 合酶的位置和速度所述的信号处理方法可再次用于这种变型方法中。
用于执行药物候选物的NANO-VALIDTM筛选的装置
这里，我们描述本发明的用于执行NANO-VALIDtm方法的装置方面，所 述装置方面包含通过快速端口 (例如USB端口 )与个人计算机连接的单分子 测量系统，所述个人计算机允许接近实时数据采集和控制所述单分子装置系 统。参见图9a和步骤9b。通过软件驱动器，控制这个装置且通过具有图形使 用者界面(graphical user interface, GUI)的常规软件程序来询问。在这一实 施例中，单分子测量系统将具有用于在单个板(例如96孔微板)上装载和处 理数个个别样品的容器。所述测量系统将整合温度控制以确保可靠和可再现的 环境条件。测量系统可包含下列中的一个或一个以上原子力显微镜、扫描电 子显微镜等。
为利用所述装置，使用者将所述板装入单分子测量中。通过GUI,其将初 始化单分子测量系统，包括任何必需校准。接着，使用者将选择机械特征，和 任何关于所述特征的控制参数(例如，测量特征的时间长度)。接着，通过GUl, 其将指导单分子测量系统询问对照样品以获得靶酶的基线机械特征。这种测量 的精确执行可能需要一些人工控制和人类使用者通过键盘、操纵杆或其它计算 机输入设备来输入。接着，常规软件程序将获得这个特征，且通过信号处理惯 例，选取和存储所述信号的显著特点。GUI将显示显著特点，或许包括原始机 械特征痕迹。
接着，GUI将允许使用者穿越板的其余部分，以获得来自各候选物的机械信号；这可能需要数次个别测量。如前所述，这个特征采集步骤可能需要使用
者直接输入。在每一步骤中，将获得原始机械特征，将通过信号处理选取机械 特征的显著特点，将其存储于计算机存储器中且向使用者显示，并与参照基线 信号作比较。
用于执行靶向聚合酶的药物候选物的NANO-VALIDTM筛选的装置 为执行用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法，有必要使单分子测量装置 准确地捕捉聚合酶沿核酸模板的实时动力学。数种技术可用于完成这种功能。 举例来说，可利用聚合酶的高分辨率荧光成像联合量子点标记。或者，可利用 原子力显微术来测量这些聚合酶动力学(这是真的)。磁或光"镊"或"阱" 也可用于在皮牛顿下控制模板张力和测量聚合酶沿DNA模板的纳米级位移。 可容易设想其它变型。
用于执行靶向聚合酶的药物候选物的NANO-VALIDTM筛选的基于光镊的
装置
在优选实施例中，用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm装置将利用基于光镊 的单分子测量子系统。光镊用通过光强梯度所产生的力捕获粒子。强到足以形 成三维阱的用光学方法所产生的力可通过用高数值孔径透镜使具有适当成形
波阵面的激光束达到紧密焦点来获得。光镊技术已广泛地用于DNA的聚合物 特性的单分子研究和生物分子马达(包括聚合酶)的力依赖性动力学。由于这 些广泛的生物物理学研究，使用光镊沿等张力核酸模板跟踪聚合酶的实验方案 已相当成熟且为本领域所熟知(布洛克(Block )等人，自然(Nature )348, 348-352 (1990))。
为沿模板跟踪聚合酶，有效固定核酸模板的一端，同时将聚合酶分子附着 于可电子操纵光镊装置中所捕获的珠粒上。当聚合进行时，设计光阱使其自动 移动以维持聚合酶珠粒上的恒力。接着，阱在这些等张力条件下的动力学位置 与在聚合期间聚合酶沿模板的动力学相关。这种"力反馈光学捕获子系统"的 优选实施例在下文中广泛地详细描述。可容易设想数种其它变型。
图4展示这一实施例的实验变型；其在其核酸固定方法方面有变化。在图 4-C中，使核酸模板附着于通过左侧所示的第二固定光阱固持的电介质珠粒， 所述光阱发挥比聚合酶对核酸模板所施加的力大得多的强捕获力。图4-D证明
21核酸如何可通过核酸模板与刚性表面的互补功能化作用而固定于诸如盖玻片 或微孔板的刚性表面上。
用于使核酸和聚合酶附着于珠粒或其它表面的方法为本领域所熟知；下文 给出的一些实例说明完成这种任务的示例性方法。一种所述方法通过标准方法 生物素标记核酸或聚合酶，以致其可附着于包被抗生蛋白链菌素的微珠(例如， 邦斯实验室(Bang's Laboratories))或包被抗生蛋白链菌素的盖玻片(例如， 塞诺泊公司(Xenopore Corporation))上。
用于通过核酸模板长度的单分子测量执行NANO-VALIDTM筛选的基于光 镊的装置
先前所述的优选装置实施例可用于执行用于DNA聚合酶沿单链DNA模 板的变型NANO-VALIDTM方法。如先前所论述，这种方法变型测量DNA模板 的长度，从而代替直接跟踪聚合酶移动。为进行这种方法变型，必须如前所述 固定DNA的一端；然而，现在使DNA模板的另一端附着于通过可操纵的恒 力光阱询问的电介质珠粒上。酶仍游离在溶液中。
在这种变型方法中，甚至当模板分子由于聚合而缩短时，阱也将移动以维 持DNA模板上的恒力，从而代替阱响应聚合酶沿模板移动的力而移动。如先 前所论述，这是几乎类似的测量。虽然所述方法变型需要样品制备的微小差异， 但这种方法变型既不需要装置的差异，也不需要控制软件的差异。图4a-b概 括了用于执行这种方法变型的实验变型。
力反馈光学捕获子系统
图5A说明甚至当所捕获珠粒由于聚合酶的酶促活性而经受其它力时也会 维持所述珠粒上的恒力的光学捕获系统的示例性设计。通过一 系列透镜和镜面 (B)使IR激光源(A)聚焦于样品平面中的位置(xo， yo)。通过双轴声光 偏转器(AOD) (L)的偏转角来确定这个聚焦位置(xo, yo )。样品载玻片(C ) 上的高斯光束(Gaussian beam)分布捕获附着于聚合酶(未图示)或核酸模板 (如图所示)上的珠粒。
四象限光电二极管或QPD(D)检测从珠粒散射出的IR信号的干扰图案， 且输出这个信号的x和y扰动。将这些信号扩增(E),通过数据采集卡(data acquistion card, DAQ)获得，与个人计算机(G)连接。随后，以数据采集和分析程序(例如在来自国家仪器公司(National Instruments )的Labview⑧中编 程)处理这个数据，以在近纳米分辨率下确定珠粒相对于光阱中心的位置和测 量珠粒上的以皮牛顿计的捕获力。(也参见图5B)
通过灵敏CCD相机(例如，库克(Cooke)的PixelFly )联合光学显微镜 (F)来捕捉珠粒的直接图像。常规数据分析计算机程序提供珠粒的纳米级位 置检测；图像分析程序提供样品平面的图像，包括所捕获的珠粒。
在力反馈系统操作(L， K)下，激光对珠粒所施加的力甚至在作用于珠 粒的酶促力存在下也保持恒定，从而在阱内移动其位置。这通过确定珠粒相对 于激光阱中心的瞬时位置且比较其与参照位置(对应于所捕获珠粒上的特定 力)的软件程序来完成。将这个当前位置与所需珠粒位置之间的差异转化为射 频(RF )驱动器(K)输入到双轴AOD晶体中的双通道频率信号(△&， Afy )。 这个射频在晶体中形成驻波，接着衍射入射的激光束。 一级衍射光束的位置随 射频而变。
因此，激光束可通过控制输入到AOD晶体中的RF来准确且快速地调向。 数据采集程序计算应由射频驱动器(K)产生以偏转足以补偿珠粒位置的酶促 驱动移动的光束的新反馈频率。可对这个输出频率的记录进行后处理以输出阱 位置随聚合时间的时间演化。
NANO-VALID 药物验证工艺与常规方法相比的独特特点是 NANO-VALIDTM系统使得能够高分辨率实时跟踪药物候选物如何改变或干扰 聚合酶沿核酸模板的移动。进一步将这个系统高度整合和自动化，从而使其容 易升级用于高通量药物筛选应用。
本文所述的方法和装置还提供许多相对于常规药物筛选和验证技术的成 本相关优点。如图8至图10所说明，本发明方法和装置使得能够快速筛选， 从而使劳动时间减少约115倍。另夕卜，本发明的单分子方法使试剂体积减少约 130倍，且减少的仪器循环时间导致处理时间减少约10到50倍。因此，总之， 本发明使得总成本改进约20到100倍。
实施例
使用模板长度的动力学来检测DNA复制的抑制的方法和装置
在本实例中，我们说明通过DNA模板长度的单分子测量来检测DNA复
23制的抑制的方法和装置。在本实例中，我们设法筛选通过以下两种机制中的一
种来抑制DNA聚合的药物干扰聚合酶结合或超低连续性。图2-A展示预期 的正常特征，而2-B展示预期来自有效药物候选物的结果。用于单分子测量的 装置包含如先前所述的力反馈光学捕获子系统。用于此机械特征测量的实验设 置在图5a和5b中展示。
根据标准方法，用抗生蛋白链菌素涂覆光学透明多孔微板的内表面。制备 长度超过5 kb的生物素标记ssDNA模板的样品(罗森伯格(Rothenberg)-全 文引用)且使其悬浮于緩冲溶液中。也设计可起始聚合的DNA引物。制备包 被抗生蛋白链菌素的0.5-1微米珠粒(可得自邦斯实验室(Bang's Laboratories )) 的悬浮液且将其分配到各孔中；随后，也将ssDNA模板的溶液分配到各孔中。 为了发生抗生蛋白链菌素-生物素结合，将所述板培养约30分钟，以致形成 DNA范围的足够群体，其使核酸的一端附着于微板，另一端附着于包被抗生 蛋白链菌素的珠粒。将药物候选物如下分配到各孔中各孔含有至多一种候选 物；将各候选物加入N个孔中以提供冗余度。 一组C孔并未添加有任何候选 物以致其可用作对照样品。
启动光镊装置且根据图形使用者界面进行校准。将微孔板装入光镊装置， 以致其底部与光阱的聚焦平面齐平。使用GUI来设定询问时间且将捕获力设 定为0-35 pN的所需值。也使用GUI来鉴别哪些候选物(如果有)存在于各微 孔中。
向GUI提供输入数据以驱动微孔板，使得光镊光束询问第一对照微孔。 使用操纵杆和样品平面的CCD图像，手动捕获合适的珠粒。啮合力反馈系统 且随后立即将DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩冲悬浮液加入这 个单微孔中。这同样可应用于RNA聚合酶和逆转录酶。使力反馈系统运行以 便在所选时间间隔期间跟踪阱的位置；将这些结果存储于存储器中以致其可通 过孔位址和作为对照结果来定址和识别。对于对照孔的其余部分重复这个过 程。从GUI可见，运行程序以分析多个对照样品，以便选取数个为聚合酶靶 所共有的显著特点。首先，对这些对照组应用截止频率在100-1000 Hz范围内 的不同低通滤波器的选择，且显示结果以致使用者可选择产生最高信号平滑程 度、同时维持靶聚合酶的总动力学的完整性的具有截止频率coc的滤波器。一旦过滤，数值微分方案确定每一点的瞬时速度。接着，对于范围为整个
采集窗口 (即，t=
)到大致对应于100个碱基对(约二分之一长度的窗 口 ，这取决于聚合酶的速度)的窗口的不同窗口尺寸确定速度的最邻近平均值。
向GUI提供输入数据以驱动微孔板，以致光镊光束询问第一非对照微孑L。 使用操纵杆和样品平面的CCD图像，手动捕获合适的珠粒。啮合力反馈系统 且随后立即将DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩冲悬浮液加入这 个单微孔中。力反馈系统继续在所选时间间隔期间跟踪阱的位置；将这些结果 存储于存储器中以致其可通过孔位址以及存在的药物候选物来定址和识别。对 于对照孔的其余部分重复这个过程。
用具有截止频率coc的低通滤波器过滤所有获得的结果。用GUI对结果进 行数值微分，且关于与对照组相同的时间尺度来计算最邻近速度图。依次考虑 各药物候选物。对于N个样品中的任一个来说，在任何时间尺度上的实质上 非零速度都将指示药物候选物并不可靠地或有效地干扰DNA复制过程。为此， 排除对于N个样品中的任一个来说，在任何时间尺度上都显示实质上非零速 度(例如，所有对照组的平均速度为1%)的那些候选物。
使用聚合酶沿DNA链的动力学来检测RNA聚合酶耙的提前终止的方法 和设备
在本实例中，我们说明通过RNA聚合酶来检测RNA转录的提前终止的 方法和装置。在本实例中，我们筛选诱导RNA聚合在特定位点起始后提前终 止的药物候选物。图2-A展示预期的正常特征，而2-B展示预期来自有效药物 候选物的结果。用于单分子测量的装置是包含力反馈光学捕获子系统和较高功 率可操纵光阱的双光束光4聂装置。
通过标准方法来制备双链(ds) DNA的样品以使其包含停止转录复合物
(包含生物素标记)，以及位于DNA的下游端的生物素标签(卡 崔 诺埃 曼(Neuman，K.C.)等，细胞(Cell) , 115:437-447,2003 )。随后使转录因子标 签附着于包被抗生蛋白链菌素的1微米直径电介质珠粒(例如，邦斯实验室
(Bang's Laboratories))上，且使DNA标签附着于包被抗生蛋白链菌素的0.5 微米直径电介质珠粒(例如，邦斯实验室(Bang's Laboratories ))上。这形成 在每一端都具有珠粒"柄，，的DNA "哑铃体(dumbell)"的样品 一个附着于DNA的末端，另一个附着于RNA聚合酶上。将药物候选物如下分配到光 学透明微孔板的孔中各孔含有至多一种候选物；将各候选物加入N个孔中 以提供冗余度。 一组C孔并未添加有任何候选物以致其可用作对照样品。
启动光镊装置且根据图形使用者界面进行校准。将微孔板装入光镊装置 中，以致其底部与光阱的焦点平面齐平。使用GUI来设定询问时间T，且将 力反馈光束的捕获力设定为0-35 pN的所需值。也使用GUI来鉴别哪些候选物 (如果有)存在于各微孔中，以致微孔随后可通过其位置和含量来定址。
向GUI提供输入数据以驱动微孔板，以致光镊光束询问第一对照微孔。 使用操纵杆和样品平面的CCD图像，通过捕获力反馈光阱中的较大珠粒和强 次级阱中的较小珠粒来手动捕获哑铃体。啮合力反馈系统且随后立即将RNA dNTP混合物的緩冲悬浮液加入这个单微孔中。力反馈系统继续在所选时间间 隔期间跟踪阱的位置；将这些结果存储于存储器中，以致其可通过孔位址和作 为对照结果来定址和识别。对于对照孔的其余部分重复这个过程。从GUI可 见，运行程序来分析多个对照样品，以便选取数个为聚合酶靶所共有的显著特 点。首先，对这些对照组应用截止频率在100-1000 Hz范围内的不同低通滤波 器的选择，且显示结果以致使用者可选择产生最高信号平滑程度、同时维持靶 聚合酶的总动力学的完整性的具有截止频率coc的滤波器。
一旦过滤，数值微分方案确定每一点的瞬时速度。接着，对于范围为整个 采集窗口 (即，t-
)到大致对应于100个碱基对(约二分之一长度的窗 口，这取决于聚合酶的平均速度)的窗口的不同窗口尺寸确定速度的最邻近平 均值。接着，使用者通过GUI选择对应于聚合仍应进行的时间最大值(即， 超过后聚合应被有效药物候选物终止的时间)的时间点，To<T。
向GUI提供输入数据以驱动微孔板，以致光镊光束询问第一非对照微孔。 使用操纵杆和样品平面的CCD图像，手动捕获合适的珠粒。啮合力反馈系统 且随后立即将RNA dNTP混合物的緩冲悬浮液加入这个单微孔中。使力反馈 系统运行以在所选时间间隔期间跟踪阱的位置；将这些结果存储于存储器中， 以致其可通过孔位址以及存在的药物候选物来定址和识别。对于对照孔的其余 部分重复这个过程。
用具有截止频率coc的低通滤波器过滤所有获得的结果。用GUI对结果进
26行数值微分，且关于与对照組相同的时间尺度来计算最邻近速度图。依次考虑 各药物候选物。如果药物候选物可靠地以所需方式干扰转录，那么所有相关的
N个样品都应在时间To后显示实质上非零速度。因此，排除对于To后的任何 时间窗口来说N个样品中的任一个都显示实质上非零速度(例如，所有对照 组的平均速度为1%)的那些候选物。
虽然本发明已参考其特定实施例进行详细描述，但对于所属领域的技术人 员将显而易见的是在不脱离本发明的范围的情况下可进行各种变化，和利用等 效物。
本文所论述的公开出版物仅仅在本申请的申请日期之前提供其揭示内容。 本文中无任何内容可解释为承认本发明无权先于根据先前发明之所述公开内 容公开。此外，所提供的
公开日期可能不同于实际
公开日期，这可能需要独立 地加以i正实。
本文所引用的所有^Hf出版物都以全文引用的方式并入。
权利要求
1. 一种用于筛选药物候选物的方法，其中所述方法包含(a)使靶酶与所述靶酶的底物接触；(b)通过使用单分子检测装置进行机械测量来确定在所述靶酶的所述底物存在下所述靶酶的基线机械特征；(c)使所述靶酶和所述靶酶的所述底物与一种或一种以上药物候选物接触；(d)通过使用单分子检测装置进行机械测量来确定在所述靶酶的所述底物和一种或一种以上药物候选物存在下所述靶酶的机械特征；以及(e)比较步骤(b)的所述基线机械特征与步骤(d)的所述机械特征；其中步骤(b)的所述基线机械特征和步骤(d)的所述机械特征使用同一单分子检测装置和相同机械测量得以确定。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述机械测量选自由下列测量所 组成的组中对所述耙酶沿所述把酶的所述底物的时间依赖性速度的测量、对 所述把酶的所迷底物的长度的时间依赖性变化的测量、对所述靶酶的所述底物 的弹性的变化的测量，以及对通过所述靶酶进行底物结合和加工的效率或准确 度的测量。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述单分子检测装置选自由下列 装置所组成的组中利用磁性或光学捕获的装置、利用高分辨率荧光成像联合 量子点标记的装置和利用原子力显微术的装置。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶选自由下列酶所组成 的组中DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是人类聚合酶。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是病毒聚合酶。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述病毒聚合酶是病毒逆转录酶。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述病毒逆转录酶是HIV-1逆转录酶。
10. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是细菌聚合酶。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶，所述靶酶的 所述底物是多核苷酸，且所述分子测量是对所述聚合酶沿所述多核香酸底物的 移动的测量或对聚合期间所述多核苷酸底物的长度的时间依赖性变化的测量。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述分子测量使用利用磁性或 光学捕获的单分子检测装置来进行。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法提供准确地表征所检验 的药物候选物的抑制和/或干扰机制的详细酶促动力学数据。
全文摘要
本申请揭示了用于单分子药物筛选、发现和验证的方法和装置。这些方法和装置允许使用者使用单分子的观察结果快速检测药物候选物是否和如何干扰特定疾病路径所涉及的靶酶。本文所述的方法和装置利用单分子操纵和检测技术(例如，光镊或磁镊)来直接检测靶酶-底物相互作用的特征动力学或“机械特征(mechinal signature)”是否实质上由药物候选物改变或调节。此外，所述方法和装置适用于分析机械特征的调节以便鉴别药物候选物的潜在干扰机制。本发明的一方面中，本文所揭示的方法和装置涉及监测在抑制或者调节聚合过程的药物候选物存在下个别聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶)沿多核苷酸底物的实时动力学机械特征。所述药物候选物的鉴别和分析对于抗病毒、抗癌和抗生素药物的开发至关重要。
文档编号G01N33/567GK101479605SQ200780022986
公开日2009年7月8日 申请日期2007年4月23日 优先权日2006年4月21日
发明者阿妮塔·高尔 申请人:纳诺拜希姆公司