专利名称：核酸分子rtn4bsr6及其在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸分子的应用。
本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’。在本发明中被称为RTN4BSR6。
其中，A、U、G和C分别是腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
在本发明中，术语“核苷酸分子RTN4BSR6”指具有抑制血管生成或者抑制RTN4B蛋白活性、并且含有与5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’序列高度同源的核酸序列。该术语还包括与5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者3’-CCGUGUCUAUCUAGUAAUA-5’后(3‘端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。
在本发明中，RTN4BSR6的序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’和5’AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列包括5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’和5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’和5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列是5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列是5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
在本发明中，RTN4BSR6的序列是5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’和5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
本发明还提供了一种载体，它含有序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’的核苷酸分子。
本发明的上述载体，其序列中可以包括5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’或者5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将含有本发明RTN4BSR6核苷酸序列的5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’所对应的DNA序列，例如，5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’或者3’-CCGTGTCTATCTAGTAATA-5’，可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus，HIV)为代表。慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
本发明中还提供了一种宿主细胞，它含有序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者3’-CCGUGUCUAUCUAGUAAUA-5’的核苷酸分子。
在本发明中，术语“宿主细胞”主要是真核哺乳细胞。常用的有CHO细胞、COS-7、293细胞，等等。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子RTN4BSR6的制备方法，即按RTN4BSR6的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
本发明的核苷酸分子RTN4BSR6可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷酸分子RTN4BSR6序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子RTN4BSR6在制备抗肿瘤药物中的应用。
体内和体外结果均验证，本发明的RTN4BSR6可明显削减RTN4B的表达。实验证明，RTN4B(NCBI登陆号AF148538)可以促进肿瘤生长，因此，削减RTN4B的表达就意味着抑制肿瘤生长。
将RTN4BSR6或者含有RTN4BSR6的细胞施用于裸鼠，与相同培养条件下未施用RTN4BSR6的裸鼠相比，前者瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。
本发明的核苷酸分子RTN4BSR6及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的核苷酸分子RTN4BSR6为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子RTN4BSR6可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的RTN4B SR6还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核苷酸分子RTN4BSR6被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的核苷酸分子RTN4BSR6和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。
本发明中，所述药物可以是针剂、粉剂或者片剂。
本发明的核苷酸分子RTN4BSR6或者含有RTN4BSR6的细胞施用于裸鼠的肿瘤，与相同培养条件下不含RTN4BSR6的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
图1为注射RTN4 B后，裸鼠左侧腋下长瘤情况图。pcDNA3.1 Myc-His空载体细胞株接种裸鼠为阴性对照。接种细胞数为3×106个。接种约2周后，接种的裸鼠长出细胞瘤。
图2为注射RTN4 B后，裸鼠左侧腋下长瘤情况图。pcDNA3.1 Myc-His空载体细胞株接种裸鼠为阴性对照。接种细胞数为3×106个。接种约2周后，接种的裸鼠长出细胞瘤。裸鼠顺序同图1。
图3为图1和图2和瘤体剥离后的结果图。上排为左侧a6细胞株的瘤体，下排为同一只裸鼠右侧b6细胞株的瘤体。瘤体排列顺序与图1和图2裸鼠排列顺序一致。
图4为a6和b6细胞株接种裸鼠后，所致瘤的体积与重量分析图。EF分别为接种a6和b6的结果。体积计算公式体积＝0.5*长径*短径2。稳定表达外源RTN4B的细胞株所致的瘤在体积和重量上都明显大于和重于稳定转染空载体的细胞株所致的瘤，**表示成对T检验P＜0.01，差异显著。
图5为内源筛选RTN4BSR6片段蛋白电泳图。
图6为RTN4BSR6对RTN4B基因表达的消减作用的细胞水平验证图。
图7为裸鼠瘤体内注射含有RTN4BSR6的慢病毒后，瘤体的生长情况图。
图中，b6是在QGY、L02、293T等细胞中稳定转染RTN4B的细胞株，a6则是在相应的细胞中转染空载体的细胞株，NS为阴性对照。
具体实施例方式
实施例1 RTN4B促裸鼠肿瘤生长实验1)稳定转染RTN4B的细胞株b6和稳定转染空载体的细胞株扩大培养2)用胰酶消化细胞，离心1000rpm×5min3)PBS洗两遍，用细胞计数板进行计数4)用PBS稀释细胞悬液至2×106细胞/200微升5)在裸鼠(上海中国科学院药物所动物中心，BALB/c)腋下进行皮下接种，一次注射200μl细胞悬液。同一只裸鼠左边腋下注射稳定转染空载体的稳定细胞株a6，右边注射稳定表达外源RTN4B的细胞株b6。
6)约2周后，接种的裸鼠长出细胞瘤，经颈椎处死后取出瘤体，测量瘤体长短径和重量。
结果显示，如图1-4所示，右侧的肿瘤生长明显快于左侧的右边，这表明过表达RTN4B可以促进肿瘤生长。
实施例2 内源筛选RTN4B抑制剂按照RTN4B的序列，设计序列为5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’和3’-dTdTCCGUGUCUAUCUAGUAAUA-5’的核苷酸分子作为RTN4B候选抑制剂。称为RTN4BSR6。
1.种293T细胞于24孔板中，种板密度2*104/孔2.于种板后24h(小时)、72h、120h重复转染RTN4BSR6片段，以Opti-MEM(Opti-MEMI Reduced Serum Medium，invitrogen公司，31985-070)为溶剂溶解，使终浓度达到40nM。转染试剂使用lipofectamin2000(11668-027，invitrogene公司)。
3.于第一次转染后24h、72h、120h消化细胞，收取72h和120h部分(可以大概给一个数量级吗5*104)细胞样品。Western检测，抗体用Nogo(N-18)SC-11027(santa cruz公司)RTN4B内源蛋白表达水平的变化。
结论如图5所示，与siRNA阴性片段NS(5’-UUCUCCGAACGUCACGUdTdT-3’)比较，RTN4BSR6转染后72h即可见RTN4B蛋白表达水平下调约50％。这说明，本发明的RTN4BSR6可以明显抑制RTN4B。
实施例3 对RTN4B基因表达的消减作用的细胞水平筛选实验实验步骤1.种293T细胞(购自中国科学院细胞库)于96孔板中，种板密度0.8*104/孔2.24h后将携带RTN4BSR6的lentivirus(慢病毒，吉凯公司)转导入细胞。Lentivirus滴度为106TU/ul，取MOI为100，即每孔加入80ul病毒液。具体转导方法如下给每孔细胞换上50ul新鲜培养基(PH7.0)，加入适量病毒液，7-8h后每孔补加50ul培养基。24h后换液。48-72h观察GFP(绿色荧光)荧光，检测转导效率。
3.将细胞扩大培养，利用流式细胞术对细胞进行GFP绿色荧光分选，筛选出病毒转导阳性细胞，并检测其阳性率。
4.Western检测阳性细胞和阴性细胞的RTN4B内源蛋白表达水平的变化。
结论如图6所示，A.48h观察GFP荧光，阳性率为50％，说明病毒转导实验方法正确。
B.流式细胞术分选转导细胞，阳性组的转导率94％。阴性组的(含有阴性片段NS的细胞)转导率97％(流式细胞仪显示数据)。
C.Western检测阳性细胞RTN4B蛋白表达水平较阴性细胞降低90％。
实施例4 RTN4B抑制剂抑制裸鼠肿瘤生长实验一、实验材料1.裸鼠上海斯莱克实验动物有限公司2.Lentivirus vector(慢病毒载体)上海吉凯基因技术有限公司二、实验步骤1.将裸鼠放入SPF级动物房(无特定病原体级实验动物房)，使其适应培养环境约一个星期。
2.用DMEM(Dulbecco’s Medified Eagle Medium，invitrogene公司，12800-82)+10％FBS培养SMMC-7721细胞。
3.将SMMC-7721细胞(购自中国科学院细胞库)用胰酶消化后离心，去上清，用无血清的DMEM重悬，然后去上清，加入适量PBS，制成每毫升约4×107个细胞的悬液。
4.向4-6周龄的裸鼠的腋下注射0.2ml约含有8×106个单位的细胞的PBS悬液。
5.待瘤体直径达到3-5mm(毫米)时，按瘤体积大小将相同的2只分别归为实验组和对照组，并给这2组的每只小鼠都剪耳朵编号，记录此时的每只小鼠瘤体的长径短径和体重。
6.向2组小鼠的瘤体内分别直接注射0.1ml(毫升)的病毒和病毒空载体，以注射病毒空载体为对照。每4天重复注射一次，共注射三次。
7.从第一次注射病毒之日开始，每3天测量并记录每只小鼠的瘤体的长径短径和体重，瘤体的体积v＝ab2/2(a长径长度，b短径长度)。约4个星期后取瘤。
结果显示，如图7所示，与对照组相比，注射病毒(含有RTN4BSR6)的裸鼠瘤体生长明显减慢。这说明，本发明的RTN4BSR6可以明显抑制肿瘤生长。
序列表<110>复旦大学<120>核酸分子RTN4BSR6及其在制备抗癌药物中的应用<130>21<140>200710036587.1<141>2007-01-18<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>人工合成<400>1ggcacagaua gaucauuau 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2ggcacagata gatcattat 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3
ataatgatct atctgtgcc 19<210>4<211>20<212>RNA<213>人工合成<400>4auaaugaucu aucugugucc 20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>5ggcacagaua gaucauuaudTdT 21<210>6<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>6auaaugaucu aucugugucc dTdT 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>7uucuccgaac gucacgudtd t2权利要求
1.一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’、5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’、5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’。
2.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
3.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’和5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
4.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
5.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCCdTdT-3’。
6.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5’-GGCACAGATAGATCATTAT-3’和5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
7.一种重组载体，其特征在于，它的序列中包括5’GGCACAGATAGATCATTAT-3’或者5’-ATAATGATCTATCTGTGCC-3’。
8.一种细胞，它的序列包括5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAU-3’或者5’-AUAAUGAUCUAUCUGUGUCC-3’。
9.一种如权利要求1-6中任一种核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权利要求1-6中任一种核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者依次脱水缩合。
10.如权利要求1-6中任一种核苷酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及RTN4BSR6及其在制备抗肿瘤药物中的应用。肿瘤严重威胁着人类的健康。本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子RTN4BSR6，其序列包括5’－GGCACAGAUAGAUCAUUAU－3’、5’－GGCACAGATAGATCATTAT－3’、5’－ATAATGATCTATCTGTGCC－3’或者3’－CCGUGUCUAUCUAGUAAUA－5’。含有RTN4BSR6的裸鼠与相同培养条件下不含RTN4BSR6的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
文档编号A61K31/7088GK101041680SQ20071003658
公开日2007年9月26日 申请日期2007年1月18日 优先权日2007年1月18日
发明者余龙, 季国庆, 秦波, 韩丁丁, 唐丽莎 申请人:复旦大学