专利名称：促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及促黄体生成素(LH)定量检测试剂盒，属于时间分辨免疫荧光 分析法检测领域。
技术背景-
促黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋 白，由两条多肽链通过非共价键结合而成。LH的分泌主要受下丘脑GnRH的调 节，同时还受月经周期的影响。其生理作用主要是促进女性排卵和黄体生成，以 促进黄体分泌雌激素和孕激素。在男性主要是促进睾丸间质细胞增生，促进睾酮 的合成和分泌。
目前血清LH检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于 受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位 素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染。
时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoroi隱noassay, TRFIA)利用 具有独特荧光特性的镧系元素，代替酶、同位素等，做为发光免疫分析中的一种 重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染 等许多优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于LH检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒， 主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。 本发明采用铕标记技术，提供铕标记试剂盒，以提高方法的灵敏度及稳定性。
本发明的技术方案是在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完成下列准 备工作-
首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗体包被的板，LH包被板条的制备 包括以下步骤-
(1)将纯化的LH单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内， 经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得LH单克隆抗体包被板条；
3(2)将LH单克隆抗体包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。 其次是LH铕标记的制备，包括以下步骤
(1) 取待标记抗体加入透析袋中，放入配制好的ra9.5的碳酸盐缓冲液中，室
温透析过夜(其间多次换透析液)；
(2) 次日，取出抗体，稀释至0.2-5/mL，按质量比为2:1的比例(DTTA-Eu : 抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡1小时，然后在黑暗 中静置48小时；
(3) 标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过S印hadex G50 (8cm) +3印[^『036 6B (38cm) 色谱柱(1.5X50cm)分离，分离过程用核酸蛋白仪监控；
(4) 用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在280nni处测吸光度，同 时测荧光强度，计算出Eu标抗体浓度；
(5) 用0.2um的过滤器过滤；
(6) 加入O. 3。/。优级纯BSA， 2-8。C保存。 促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法，包括下列步骤
① 固相抗体制备将抗促黄体生成素单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至 l-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；
② 镧系元素离子标记抗体制备选用配对抗促黄体生成素单克隆抗体用常规方法 进行镧系元素离子标记；
③ 在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入促黄体生成素标准品或待 测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。 步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为l一10ug/mL，步骤②中标记抗体用反应 缓冲液以体积比为1 : 20稀释。步骤②中的镧系元素离子优选为Eu:i+。步骤③中 的反应缓冲液为PH 7. 8的50画1/L Tris-HC1,内含0. 9% NaCl， 1% BSA, 0. 05% 牛IgG' 20uM DTPA， 0. 08% Tween20和0. l%NaN3;且该步骤③在时间分辨荧光免 疫分析仪器上自动完成。所用增强液为荧光增强液。
促黄体生成素定量检测试剂盒，其特征是试剂盒包括:包被抗体的缓冲液、 封闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗促黄体生成素单克 隆抗体，镧系元素离子标记的抗促黄体生成素单克隆抗体和促黄体生成素标准所述LH标准品的制备方法为先分别将LH冻干抗原溶解并稀释至所需的 最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得LH标准品。
标准品为用含6% BSA， 4%糖，0. 1%歸,，50mmol/L Tris-HCl缓冲液将促 黄体生成素蛋白配制成标准品。
本发明使用双抗体夹心法，反应步骤包括试剂准备、加样反应、洗涤拍 干、加增强液、测荧光值。
本发明的有益效果是分析灵敏度高(0.1mlU/mL)，检测时间短(80min)， 特异性好，与干扰物质的交叉反应小。
图1为本发明的反应原理图
本发明采用双抗体夹心二步法。抗人LH单抗包被于96孔荧免板，校准品或样 品中的LH与包被单抗于微孔内表面发生免疫反应；洗涤后，加入铕离子(Ei^+) 标记的抗LH单抗，免疫反应后，微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记单抗通 过洗涤分离。微孔表面免疫复合物中的Eu"被荧光增强液解离后形成稳定的荧光 配合物，荧光强度与校准品或样品中的LH浓度呈正比例，通过剂量一反应曲线 可得出样品中LH浓度。
图2为本发明操作流程图
第一步复融校准品，第二步稀释铕标记物，第三步加入校准品和待 测样品，第四步加入稀释后的铕标记，第五步孵育，第六步洗板，第七步 加入稀释后铕标记物，第八步孵育，第九步洗板，第十步加入增强液，第 十一步检测。
具体实施例方式
下面参照图1、 2通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例促黄体生成素(LH)测定
1、 标准品配制
用含6% BSA， 4%糖，0. 1% NaN3， 50國ol/L Tris-HCl缓冲液将LH蛋白配制 成0、 3、 10、 30、 100、 300mIU/mL标准液，以国家LH标准品校正。分装，于
+2 +8°(:保存。
2、 操作步骤
1)试剂的准备
5a) 洗涤液将40mL浓縮洗液和960mL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作 为工作洗涤液备用。
b) 铕标记使用前一小时内，用分析缓冲液按l :20稀释铕标记物。
c) 将试剂盒分析缓冲液、待测样品、校准品和和所需数量的微孔反应条平 衡至室温(20 25°C)。
2) 吸取25ul的校准品或样品，按顺序加入相应微孔底部。
3) 在各微孔内加入100y 1已稀释的铕标记溶液，室温下于慢档振动60分钟。
4) 洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。
5) 在每个微孔内加入200iU的增强液，室温下于慢档振动5分钟。
6) 用时间分辨荧光测定仪检测。 促黄体生成素(LH)测定流程见表1
表l促黄体生成素(LH)测定流程
复融校准品0. 5ml去离子水，至少20分钟稀释铕标记物(见表格)条铕标记物(u 1)分析缓冲液(ml)
-11503
23006
34509
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加入校准品和待测样品25 u 1加入分析缓冲溶液100 u 1孵育常温下于慢档振动60分钟洗板洗板4次加入稀释后的铕标记150 u 1孵育常温下于慢档振动15分钟洗板洗板6次加入增强液200 于慢档振动5分钟检测LH kit3、特异性见表2
表2 LH TRIFMA与FSH、 HCG、 TSH的交叉反应
交叉反应物质浓度表观LH浓度
人促卵泡成熟激素(FSH， Fitzgrald)270mIU/mL0.1 mlU/mL
人绒毛膜促性腺激素(HCG)22800mIU/mL1.5 mlU/mL
促甲状腺激素(TSH， Biodesign)130mIU/L0.2 mlU/mL
表观LH浓度为上表所示浓度的交叉反应物质用本试剂检测所得到的LH浓度。
权利要求
1、促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是包括下列步骤①固相抗体制备将抗促黄体生成素单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备选用配对抗促黄体生成素单克隆抗体用常规方法进行镧系元素离子标记；③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入促黄体生成素标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。
2、 根据权利要求1所述促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤 ②中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1 : 20稀释。
3、 根据权利要求1所述促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤② 中的镧系元素离子为EiT'+。
4、 根据权利要求1所述促黄体生成素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤③ 中的反应缓冲液为PH7. 8的50隱ol/LTris-HC1,内含O. 9%NaCl， 1%BSA， 0. 05%牛IgG， 200uM DTPA， 0. 08% Tween20和0. l%NaN:i;且该歩骤③在时间 分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。
5、 促黄体生成素定量检测试剂盒，其特征是试剂盒包括:包被抗体的缓冲液、封 闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗促黄体生成素单 克隆抗体，镧系元素离子标记的抗促黄体生成素单克隆抗体和促黄体生成素 标准品。
6、 根据权利要求5所述的促黄体生成素定量检测试剂盒，其特征是标准品为用 含6% BSA， 4%糖，0. 1% NaN:,， 50醒ol/L Tris-HCl缓冲液将促黄体生成素 蛋白配制成标准品。
全文摘要
本发明公开了促黄体生成素(LH)的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其选用抗LH单克隆抗体作为包被抗体，用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/ml作为包被液；配对抗LH单克隆抗体用镧系元素离子标记作为标记抗体；实验时用反应缓冲液按1∶20稀释使用；在包被抗体的反应板上，每孔依次加入25ul的LH的标准品或待测样品、以及稀释的标记抗体，孵育后进行荧光检测。本发明还提供相应的试剂盒。本发明具有较高的灵敏度、特异性及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
文档编号G01N33/74GK101614749SQ20081004355
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者吴冯波, 君 沈 申请人:上海新波生物技术有限公司