专利名称：一种牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种分析检测乳中蛋白的方法，特别是一种检测牛乳 中免疫球蛋白(IgG)含量的方法。属于检测技术领域。
背景技术：
牛乳是日常生活中不可或缺的营养品，它含有丰富的营养物质， 如酪蛋白、乳清蛋白、补体、脂肪和免疫球蛋白等。牛乳中含有的免 疫球蛋白主要为IgG, IgA和IgM。其中，IgG含量最高，约为免疫球 蛋白总量的80%。母牛分娩后第一天内分泌的初乳中免疫球蛋白含 量最高，研究表明，其IgG的平均浓度可达59~80mg/ml。然而， 第5—7天的初乳中IgG浓度已接近常乳水平，约为0. 7~1. Omg/ ml。免疫球蛋白具有多种生物活性功能，主要是识别和抵抗入侵的细 菌和病毒等病原体，在增强机体的免疫能力、防止细菌和病毒入侵、 活化补体、中和毒素、杀死肿瘤细胞等方面发挥着重要作用。
目前，国内尚未有乳免疫球蛋白(IgG)含量;f企测方法的国家标准 和行业标准。检测乳免疫球蛋白(IgG)的方法有血清中和实验、免疫 荧光抗体实验、琼脂扩散实验、补体结合实验、电镜观察、ELISA、 PCR等方法。由于考虑到人力、物力和效率，国内科研院所常用乳免疫球蛋白(IgG)的4企测方法是ELISA。 ELISA法灵敏度高，最小检测限 低，适合于乳免疫球蛋白(IgG)的检测，但是其检测时间较长，不适 于适用于实际应用当中。鉴于该方法的优缺点，本专利发明了将使用 毛细管电泳仪快速检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的方法。毛细管电泳 仪是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离技术。它能快速 精确检测出牛奶中的掺假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋 白、免疫球蛋白、酶、糖、添加剂和其他小分子的含量。该方法操作 简便、准确，检测到出结果时间仅为lh左右。
目前，毛细管电泳4义的应用前景非常广泛。许多国际官方权威机 构，如FDA、 U. S. P、 CBER、 CDER等均已认可毛细管电泳方法。权威 机构欧洲药典中认可勒沃卡-贝斯庭盐酸盐中杂质的CE测定；欧洲药 典中还认可促红细胞生成素(EP0)的毛细管电泳仪测定等。毛细管 电泳仪已成为化学、农业、医学、生物工程、药学等众多领域的一个 常规科研工具。
目前，国内毛细管电泳仪检测技术逐渐应用到乳品领域里，如产 品开发和控制质量问题等领域中。但毛细管电泳技术尚未开发检测乳 免疫球蛋白(IgG)的方法。本发明成功弥补了乳品领域中的缺点，能 准确测定乳免疫球蛋白(IgG)的含量，从而有利于产品开发和质量控 制当中。
发明内容
本发明的目的 一种牛乳中乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法。本发明的一种检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法，其中， 包括如下步骤1)将乳免疫球蛋白(IgG)溶于样品緩冲液，制备得到 多个不同含量乳免疫球蛋白(IgG)的标准溶液，并对多个溶液分别检 测后得到乳免疫球蛋白(IgG)含量与检测结果之间的标准曲线；2 )对 样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的4企测结果与所述的标 准曲线比对，得到样品中乳免疫球蛋白(IgG)的含量；其中，检测样 品的设备是高压毛细管电泳分析仪。
上述步骤l)中标准曲线的制定的方法优选如下配制乳免疫球 蛋白(IgG)标准溶液，在样品緩沖液中溶解乳免疫球蛋白(IgG)标准物 质配制成分别为lmg/ml 、 0. 5mg/ml 、 0. 25mg/ml 、 0. lmg/ml 、 0. 05mg/ml,制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析， 得到检测结果，即得到乳免疫球蛋白(IgG)含量与平均校正因子的关 系曲线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算按峰面积计算出 平均校正因子。
上述的标准溶液或待;险测样品的处理方法为4巴标准溶液或待4企 测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心5-15min, 将样品与緩冲液按照1: 4-20的比例加入冻存管(或其他容器)，并 摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中，；改置于超声波清 洗机1 ~ 10m i n, ^吏用毛细管电泳仪测定。
上述的样品緩冲液为能够使蛋白质*的緩沖液，优选如下緩 冲液
160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷石黄酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7 mol/L尿素，处理样品时 添加5ul/ml的巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0. 05%, pH值为8. 5 上述的摇匀步骤采用旋涡混合器。
上述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测 检测的温度控制在15 40。C之间，毛细管柱直径25~75um、长度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压 力为0 lpsi，进样时间为ls 20s,分离温度为15~40°C,工作电 压为10~ 30 kV。
上述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。 上述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电 泳緩沖液为pH2. 0~9. 0,主要成分为无机盐緩沖液，优选磷酸盐、 硼酸或柠檬酸。
上述的检测结果的处理方法如下检测结果为样品分离的图镨， 运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓 度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。
常乳里乳免疫球蛋白(IgG)的含量20mg ~ 350mg/L，其分子量为 12000。毛细管电泳^f义检测最低浓度能达到l(T5-10—8mol/L。所以毛 细管电泳仪能检测出其含量。使用毛细管电泳仪开发检测乳免疫球蛋 白(IgG)含量的方法包括样品性质的了解、分离模式、建立緩沖体系、 优化緩冲体系和换分离模式等步骤。开发出的方法能应用于产品开 发、质量控制和分析检测领域中。
本发明主要使用毛细管电泳仪能准确测定乳免疫球蛋白(IgG)的含量，从而应用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。
本发明在在传统的电泳和色谱的原理的基础上，使用高压毛细管
电泳仪检测乳免疫球蛋白(IgG)的含量，达到准确检测出乳制品中乳 免疫球蛋白(IgG)的含量。通过试验，最终确定检测方法的最佳参数 条件。具体如下
检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法，包括样品前处理、上 样检测，还包括校准读数等步骤。毛细管电泳检测检测的温度控制 在15 ~ 40。C之间，毛细管柱直径50 ~ 75 u m、长度20 ~ 600隱的石 英毛细管柱，DAD (或紫外光)检测器，压力进样，压力为0.5psi, 进样时间为5s 20s,分离温度为20~40°C，工作电压为15-25 kV。 校准曲线的制定配制乳免疫球蛋白(IgG)标准溶液浓度分别为 lmg/ml、 Q. 5mg/ml、 0.25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 051mg/ml。摇匀后 使用高压毛细管电泳分析，按峰高计算出平均校正因子。 检测步骤为
把原料奶样品装入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下 离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管。提取400ul样品緩冲 液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取 40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min,使用毛细 管电泳仪测定。
样品定量读数:才艮据样品分离的图谱,运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分各峰高(或峰面积)，计算出试样浓度，再乘稀释倍 数，即得实际浓度。有益效果
本发明方法现行回归方程相关系数〉0.98，其线性范围在 0. Olmg/ml ~ 2mg/ml ，最低检出线为0. 15ng,最低4全出浓度为 0. 005mg/ml。精确度达90%以上，柱子回收率达到90%以上，样品回 收率达70°/。以上。能有效检测出样品中的乳免疫球蛋白(IgG)的含量。
具体实施例方式
实施例1 一种牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法
毛细管电泳温度控制在25°C,使用直径为50um、长度为20腿 的石英毛细管柱，DAD^r测器，进样压力为0. 5psi，进样时间为10s, 工作电压为15 kV。
校准曲线的制定利用乳免疫球蛋白(IgG)标准品配制浓度分别 为2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的标准溶液。 摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为189614、 87015、 44216、 20897、 13210,利用软件得出标准曲线，线性回归 相关系数为0.9973，最低检出线为0. 009ug，最低检出含量为 0. OlmgAnl，标准样品回收率达90%。
处理样品緩冲液配置方法160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲 液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 钠，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的P-巯基乙醇，曱基羟 乙基纤维素0. 05%,使用氢氧化钠溶液把pH值调至8. 5。
电泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L柠檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，7 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素0. 05%。才企测步骤为4巴奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min 离心条件下离心10min。准确提取样品lOOul置入冻存管(或其他 容器)。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用 漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超 声波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。
样品定量读数:根据样品分离的图语，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分乳免疫球蛋白(IgG)的峰面积为9851，利用分析软件 自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0. 1435mg/ml，再乘稀 释倍数5，即得实际浓度为0. 72mg/ml，所以该奶样含有的乳免疫球 蛋白(IgG)浓度为0. 72g/L。 实施例2 —种牛乳中乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法
毛细管电泳温度控制在30。C,使用直径为75y m、长度为600 mm 的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0. 5psi，进样时间为5s， 工作电压为25 kV。
校准曲线的制定利用乳免疫球蛋白(IgG)标准品配制浓度分别 为2 mg/ml 、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的标准溶 液。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为， 153413、 76214、 37502、 18305、 8923利用软件得出标准曲线，线 性回归相关系数为0. 999，最低检出线为0. Olug，最低检出含量为 0. 01mg/ml,标准样品回收率达92%。
处理样品緩冲液配置方法160 m mol/L三曱基氨基曱烷缓冲 液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷碌酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的巯基乙醇，曱基羟乙基纤 维素0. 4%。使用0. 1M氢氧化钠调至pH值为8. 5。
电泳緩冲液的配置方法0. 32 mol/L种檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，6 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素0. 4%。
才企测步骤为把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min 离心条件下离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容 器)。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩 涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声 波清洗机3min,之后使用毛细管电泳仪测定。
样品定量读数:根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分乳免疫球蛋白(IgG)的峰面积为4738，利用分析软件 自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0. 0614mg/ml,再乘稀 释倍数5，即得实际浓度为0. 307mg/ml，所以该奶样含有的乳免疫 球蛋白(IgG)浓度为0. 307g/L。
权利要求
1.一种检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤1)将乳免疫球蛋白(IgG)溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量乳免疫球蛋白(IgG)的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到乳免疫球蛋白(IgG)含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中乳免疫球蛋白(IgG)的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤l)中 标准曲线的制定的方法优选如下配制乳免疫球蛋白(IgG)标准 溶液，在样品緩沖液中溶解乳免疫球蛋白(IgG)标准物质配制成 分另寸为lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml, 制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测 结果，即得到乳免疫球蛋白(IgG)含量与平均校正因子的关系曲 线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算按峰面积计算出 平均校正因子。
3. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于把标准溶液或 待检测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心 5-15min，将样品与緩沖液按照1: 4-20的比例加入冻存管(或 其他容器)，并摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中， 放置于超声波清洗机1 ~ 10min,使用毛细管电泳仪测定。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的样品緩冲液 为能够使蛋白质分歉的緩冲液，优选如下緩冲液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7mol/L尿素，处理样 品时添加5ul/ml的P-巯基乙醇，曱基羟乙基纤维素0. 05%， pH值为8. 5。
5. 如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的摇匀步骤采 用旋涡混合器。
6. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述高压毛细 管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测检测的温度控 制在15 ~ 40。C之间，毛细管柱直径25 ~ 75 y m、长度20 ~ 600 mm, DAD (或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0~ lpsi，进样时间为ls 20s，分离温度为15~40°C，工作电压为 7~ 30 kV。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述的毛细管柱为 石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。
8. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述的高压毛 细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳緩冲液为 pH2. 0~9. 0,主要成分为无机盐緩冲液，优选磷酸盐、硼酸或 柠檬酸。
9. 根据权利要求2中所述的检测方法，其特征在于所述的检测结 果的处理方法如下；险测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度,再乘稀 释倍数，即得实际浓度。
全文摘要
本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法。属于检测技术领域。本发明毛细管电泳仪检测乳免疫球蛋白(IgG)含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数，编辑报告等步骤。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出乳免疫球蛋白(IgG)的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。
文档编号G01N33/68GK101315384SQ200810081900
公开日2008年12月3日 申请日期2008年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者刘卫星, 孙国庆, 康小红, 胡新宇 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司